АГОНИСТЫ И АНТАГОНИСТЫ ГИБРИДНОГО РЕЦЕПТОРА IL-1 I ТИПА Российский патент 2021 года по МПК C07K14/545 C07K19/00 C12P21/02 A61K38/20 A61P27/02 A61P29/00 A61P37/02 A61P43/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА И ЗАЯВЛЕНИЕ ПРИОРИТЕТА

Данная заявка заявляет приоритет предварительных заявок на патент Соединенных Штатов серийный номер 61/368799, поданной 29 июля 2010 года, серийный номер 61/436178, поданной 25 января 2011 года, серийный номер 61/436184, поданной 25 января 2011 года, серийный номер 61/493966, поданной 6 июня 2011 года, и серийный номер 61/493967, поданной 6 июня 2011 года, и, с учетом заявок Соединенных Штатов, включает содержания серийного номера 61/368799, поданного 29 июля 2010 года, серийного номера 61/436184, поданного 25 января 2011 года, и серийного номера 61/493967, поданного 6 июня 2011 года, путем ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интерлейкин-1 альфа (IL-1α) и бета (IL-1β) являются прототипными членами семейства иммунорегуляторных цитокинов, и они играют несколько выдающихся ролей в регулировании иммунной системы. IL-1α и IL-1β связываются с рецептором интерлейкина-1 (IL-1RI), что приводит к вовлечению вторичного рецептора, вспомогательного белка рецептора интерлейкина-1 (interleukin-1 receptor accessory protein, IL-1RAcP). Передача сигнала, агонистами которой служат IL-1α и IL-1β, приводит к усиленным ответам Т-клеток, включая пролиферацию и выживание наивных Т-клеток и развитие T_H17 клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описываемыми здесь являются не встречающиеся в природе домены цитокинов, которые могут быть использованы, среди прочего, для модулирования клеточной передачи сигнала, управляемой рецептором I интерлейкина-1 (IL-1RI), для лечения нарушений и для детекции и/или связывания как с клеточными рецепторами, так и с другими агентами.

В одном аспекте настоящее раскрытие характеризует изолированный белок, включающий домен цитокина, который содержит аминокислотные остатки от по меньшей мере двух родительских доменов цитокинов, например, рецептор-связывающие характеристики, поверхностные характеристики, β-цепи и петли из по меньшей мере двух родительских доменов цитокинов.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина связывается с IL-1RI и включает рецептор-связывающие характеристики как от различных родительских доменов цитокинов, например, от агониста рецептора и антагониста рецептора (такого как IL-1β и IL-1Ra, или IL-1α и IL-1Ra), от IL-1β и IL-1α, или от всех трех из IL-1Ra, IL-1α и IL-1Ra. Рецептор-связывающие характеристики могут относиться к остаткам, сегментам или участкам в Сайтах А и В. По отношению к таким остаткам, сегментам или участкам, относящимся к Сайтам А и В, в контексте IL-1 (IL-1β, IL-1α и IL-1Ra) см. определения далее ниже.

В отношении Сайта A, домен цитокина может иметь: (a)(i) остатки Сайта A, которые на по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в первом родительском домене цитокина; (a)(ii) расширенные остатки Сайта A, которые на по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в первом родительском домене цитокина; (a)(iii) сегменты A1 и A2 Сайта A, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные соответствующим участкам в первом родительском домене цитокина; и/или (a)(iv) участок Сайта A, который на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичный соответствующим участкам в первом родительском домене цитокина.

В отношении Сайта B, домен цитокина может иметь: (b)(i) остатки Сайта В, которые на по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам во втором родительском домене цитокина; (b)(ii) расширенные остатки Сайта В, которые на по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам во втором родительском домене цитокина; (b)(iii) сегменты B1, B2 и B3 Сайта В, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные соответствующим участкам во втором родительском домене цитокина; и/или (b)(iv) участок Сайта В, который на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичный соответствующим участкам во втором родительском домене цитокина.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает характеристики: (a)(i) и b(i), (a)(ii) и b(ii), (a)(iii) и (b)(iii) или (a)(iv) и (b)(iv), например, где каждая характеристика далее определяется 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичностью. Например, первый родительский домен цитокина может быть IL-1β, и второй родительский домен цитокина может быть IL-1Ra. Например, первый родительский домен цитокина может быть IL-1α, и второй родительский домен цитокина может быть IL-1Ra.

Домен цитокина может также включать аминокислоты из второго родительского домена цитокина в одном или более положений в домене, которые понижают взаимодействие с вторичным рецептором цитокина (например, IL-1RAcP). Например, вторым родительским доменом цитокина является IL-1Ra. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает один или более сегментов Сайта C и/или D (например, C1, D1, D2, D3, D4 и/или D5) из IL-1Ra, или последовательности, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные таким сегментам. Например, домен цитокина включает (i) остатки Сайта C, которые на по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в IL-1Ra, (ii) остатки Сайта D, которые на по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в IL-1Ra, (iii) сегмент C1, который на по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичный соответствующим остаткам в IL-1Ra; или (iv) сегмент D2, который идентичный на по меньшей мере 3, 4 или 5 остатков соответствующим остаткам в IL-1Ra. Домен цитокина может включать характеристики (i) и (ii) или (ii) и (iii), например, где каждая характеристика далее определяется 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичностью, или (iii) и (iv).

Домен может включать участки от по меньшей мере двух различных цитокиновых доменов семейства человеческого IL-1, где участки отобраны из группы, состоящей из участка А (имеющего сегменты А1 и А2), участка В (имеющего сегменты В1, В2 и В3), участка С и участка D (имеющего сегменты D1, D2, D3, D4 и D5).

Домен цитокина может включать участок Сайта A и участок Сайта B от различных доменов цитокинов. Участок Сайта A может быть от природного агониста или антагониста рецептора; участок Сайта B может быть от природного агониста рецептора. Он может включать участок Сайта C от природного антагониста рецептора и/или участок Сайта D от природного антагониста рецептора.

Например, домен может быть гибридным доменом, имеющим сегменты, которые в длину составляют по меньшей мере 5, 6, 10, 15, 20 или 25 аминокислот, и которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные соответствующим сегментам из по меньшей мере двух различных родительских доменов цитокинов, таких как первый и второй родительский домен цитокина. Родительские домены цитокинов могут быть IL-1RI-связывающими цитокинами, такими как IL-1β, IL-1α и IL-1Ra. В некоторых вариантах воплощения аминокислоты, которые не находятся в сегментах из первого родительского домена цитокина, исходят из двух или более других родительских доменов цитокинов.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере два сегмента длиной по меньшей мере 5, 6, 10, 15, 20 или 25 аминокислот, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные соответствующим сегментам первого родительского домена цитокинов, и аминокислоты, которые не находятся в таких сегментах, преимущественно (например, на по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100%) идентичные соответствующим остаткам во втором родительском домене цитокина.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает (i) по меньшей мере два сегмента в длину по меньшей мере 5, 6, 10, 15, 20 или 25 аминокислот, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные соответствующим сегментам первого родительского домена цитокинов, и (ii) по меньшей мере один, два или три сегмента, например, длиной по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 10 или 15 аминокислот, которые идентичные второму родительскому домену цитокина.

Например, домен цитокина может включать первый сегмент в 20-50, 25-50, 30-45 или 30-40 аминокислот (например, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) и второй сегмент в 20-45, 20-40, 25-40 или 25-35 аминокислот (например, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35), каждый идентичный (или на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 98% идентичный) первому родительскому домену цитокина (например, IL-1Ra), и третий сегмент, который идентичный (или на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 98% идентичный) второму родительскому домену цитокина (например, IL-1β или IL-1α). Например, третий сегмент может быть длиной между 55-90, 60-90, 60-85 или 70-85 аминокислот, например, длиной в 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 или 85 аминокислот.

В некоторых вариантах воплощения первым сегментом может быть сегмент по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9, также называемый здесь сегмент А1 и соответствующий остаткам 16-40 SEQ ID NO:3 и остаткам 11-36 в соответствии с нумерацией IL-1β). Вторым сегментом может быть сегмент по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% остаткам 120-140 или 120-141 SEQ ID NO:3 (IL-1Ra), соответствующий остаткам 121-139 или 121-140 (в соответствии с нумерацией IL-1β). Третий сегмент может быть по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% остаткам 45-100 или 42-120 из IL-1β (SEQ ID NO:1).

В некоторых случаях первым сегментом может быть сегмент по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% остаткам 14-45 SEQ ID NO:3 (соответствующий остаткам 9-41 в соответствии с нумерацией IL-1β). Вторым сегментом может быть сегмент по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% остаткам 120-145 SEQ ID NO:3 (соответствующий остаткам 121-145 в соответствии с нумерацией IL-1β) или остаткам 120-147 SEQ ID NO:3 (соответствующий остаткам 121-147 в соответствии с нумерацией IL-1β). В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере остатки 11-41 и 120-147 (в соответствии с нумерацией IL-1β) в совокупности на, по меньшей мере, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в IL-1Ra.

В некоторых вариантах воплощения конец одного из сегментов первого домена цитокина семейства IL-1 расположен в пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотах аминокислоты 41 SEQ ID NO:1, и конец одного из сегментов первого домена цитокина семейства IL-1 расположен в пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотах аминокислоты 121 SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах воплощения домен включает сегмент, имеющий N-конец в положении в пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотах аминокислоты 42 SEQ ID NO:1 и С-конец в пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотах аминокислоты 120 SEQ ID NO:1, и/или сегмент, имеющий N-конец в положении в пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотах аминокислоты 121 SEQ ID NO:1 и C-конец в пяти, четырех, трех, двух или одной аминокислотах аминокислоты 145 SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах воплощения остатки в домене в положениях, относящихся к 11-41 и 120-147 (в соответствии с нумерацией IL-1β), в совокупности на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в IL-1Ra. Домен также может базироваться на последовательностях из членов семейства цитокинов IL-1, например, в положениях, аналогичных вышеизложенным.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает одну, две, три или более из следующих последовательностей: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9); NLEEK (SEQ ID NO:10); RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK (SEQ ID NO:11); AMEADQP (SEQ ID NO:12); FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY (SEQ ID NO:13); и/или последовательности, на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные вышеизложенным. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает одну, две, три или более из следующих последовательностей: VQGEESNDKI (SEQ ID NO:14); KKKMEKRF (SEQ ID NO:15); и FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN YPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO:16); и/или последовательности, на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные вышеизложенным.

В некоторых вариантах воплощения одна или более, или все из петлей β1β2, β2β3, β8β9 и β10β11 на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные соответствующим петлям из антагониста IL-1, например, IL-1Ra. В некоторых вариантах воплощения одна или более, или все из петлей β4β5, β5β6, β6β7 и β7β8 на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные соответствующим петлям из другого домена цитокина семейства IL-1, отличного от человеческого семейства цитокинов, которые наиболее подобны петлям β1β2, β2β3, β8β9 и β10β11. Например, одна или более, или все из петлей β4β5, β5β6, β6β7 и β7β8 на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные таким петлям из агониста IL-1, такого как IL-1β. В некоторых вариантах воплощения петля β11β12 на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичная соответствующей петле из антагониста IL-1, например, IL-1Ra.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает последовательности, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные одной, двум, трем или всем бета-цепям β2, β3, β10 и β11 IL-1Ra. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает последовательности, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные одной, двум, трем или всем из β4, β6, β7 и β8 IL-1β или β4, β5, β6, β7 и β8 IL-1β.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина не содержит сегмент более чем на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичный аминокислотам I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46-S110, V49-S110 или I46-G118 SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина не содержит сегмент более чем на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичный аминокислотам N7-V41, R11-M36, N102-D145 или Y121-D145 SEQ ID NO:1.

В общем, домен цитокина является не встречающимся в природе. Он отличается от человеческого домена цитокинов семейства IL-1. Например, от менее чем на 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60 или 55% идентичный IL-1Ra (SEQ ID NO:3), IL-1β (SEQ ID NO:1) и/или IL-1α (SEQ ID NO:2). Домен цитокина может также быть на по меньшей мере 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70% идентичный такому цитокину. Например, гибридный домен может быть на между 30-95%, 40-90% или 45-85% идентичный IL-1Ra, IL-1β и IL-1α. Например, гибридный домен может быть на между 40-90% идентичный IL-1β и 35-85% идентичный IL-1Ra; между 40-80% идентичный IL-1β и 45-80% идентичный IL-1Ra; между 45-72% идентичный IL-1β и 45-80% идентичный IL-1Ra; между 45-72% идентичный IL-1β и 53-80% идентичный IL-1Ra; между 50-72% идентичный IL-1β и 53-70% идентичный IL-1Ra; между 60-72% идентичный IL-1β и 53-68% идентичный IL-1Ra; между 65-72% идентичный IL-1β и 54-60% идентичный IL-1Ra; или между 68-72% идентичный IL-1β и 54-57% идентичный IL-1Ra. Например, гибридный домен может быть на между 40-90% идентичный IL-1α и 35-85% идентичный IL-1Ra; между 40-80% идентичный IL-1α и 45-80% идентичный IL-1Ra; между 45-72% идентичный IL-1α и 45-80% идентичный IL-1Ra; между 45-72% идентичный IL-1α и 53-80% идентичный IL-1Ra; между 50-72% идентичный IL-1α и 53-70% идентичный IL-1Ra; между 60-72% идентичный IL-1α и 53-68% идентичный IL-1Ra; между 65-72% идентичный IL-1α и 54-60% идентичный IL-1Ra; или между 68-72% идентичный IL-1α и 54-57% идентичный IL-1Ra.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина отличается от IL-1Ra и связывается с рецептором, при этом включая характеристики природного антагониста рецептора (такого как IL-1Ra) Сайта C и/или Сайта D. Например, домен менее чем на 98, 95, 92, 90, 85 и 80% идентичный по сравнению с человеческим IL-1β и IL-1Ra. Например, домен на между 40-95%, 40-90% или 45-85% идентичный IL-1Ra. Домен также может быть между 40-95%, 40-90% или 45-85% агонистом семейства цитокинов IL-1, таким как IL-1α или IL-1β. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85% аминокислот из первого родительского домена цитокина, который является агонистом передачи цитокиновых сигналов.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина имеет большую аминокислотную идентичность (например, на по меньшей мере 5, 10, 15 или 20% большую) с агонистом рецептора (такого как IL-1β или IL-1α), чем с антагонистом рецептора (IL-1Ra), однако функционирует как антагонист IL-1RI.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина является полностью гибридным, например, каждая аминокислота в домене из одного из родительских доменов цитокинов, например, одного из двух родительских доменов цитокинов или одного из трех или более родительских доменов цитокинов. Например, родительские домены цитокинов являются человеческими доменами цитокинов или не относящимися к человеку доменами цитокинов приматов. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина является частично гибридным, например, не все аминокислоты в домене происходят из одного из родительских доменов цитокинов.

Например, изолированный белок связывается с IL-1RI и модулирует передачу сигналов рецептором, например, выступает в роли агониста или антагониста активности по передаче сигнала рецептора IL-1RI. В некоторых вариантах воплощения белок не индуцирует в значительной степени продукцию IL-6 при контакте с человеческими клетками, отвечающими на IL-1β, и/или не индуцирует в значительной степени продукцию отвечающего на IL-1β гена-репортера, например, при концентрациях 10 мкг/мл, 100 мкг/мл или 1 мкг/мл. В общем, белок ингибирует передачу сигнала IL-1β (например, при концентрациях 0,1 нг/мл, таких как в описываемом здесь клеточном тесте) с IC₅₀ менее чем 100, 50, 20, 10 или 5 нМ. Белок может ингибировать передачу сигнала IL-1β с IC₅₀, меньшей чем IC₅₀ IL-1Ra, например, на по меньшей мере 10, 20 или 50% более низкой.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина связывается с, например, такой же или более высокой аффинностью по сравнению с одним из родительских доменов цитокинов. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина связывается с IL-1RI с K_D, меньшей чем 100, 50, 20, 10, 5 или 1 нМ или меньшей чем 500, 400, 100 или 50 нМ. Например, константа ассоциации может быть большей чем 1×10⁴, 3×10⁴, 1×10⁵ или 1×10⁶ M^-1 сек^-1, и диссоциация может быть меньшей чем 1×10^-3, 1×10^-4, 6×10^-4 или 6×10^-5 сек^-1.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина связывается с IL-1RI с более высокой аффинностью (например, с более низкой K_D) и/или более медленной скоростью диссоциации, чем IL-1β или IL-1Ra. Например, домен цитокина может связываться с IL-1RI с константой диссоциации, меньшей или равной константе диссоциации IL-1Ra, и/или с константой ассоциации, большей или равной константе ассоциации IL-1β.

Домен цитокина может иметь длину приблизительно между 120-180, 140-170 или 148-160, или 150-156 аминокислот. В некоторых вариантах воплощения домен имеет в длину 152 или 153 аминокислоты. Как правило, домен включает по меньшей мере 10, 11 или 12 β-цепей и он стабильно сложен. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина имеет T_m по меньшей мере 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 или 64°C, как описано здесь. Он может иметь T_m между 51-61, 51-66, 56-61 или 56-66°C. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина не начинает разворачиваться до по меньшей мере 48, 50, 51, 55, 57, 58 или 59°C. Например, он имеет T_m, которая составляет по меньшей мере между 10°C или 5°C T_m IL-1Ra и/или IL-1β в физиологическом буфере. В некоторых вариантах воплощения он более термостабилен, чем IL-1Ra и/или IL-1β в физиологическом буфере. Например, домен может иметь Tm, которая на по меньшей мере 2, 4, 6, 7 или 8°C больше, чем T_m IL-1Ra и/или IL-1β в физиологическом буфере, например, приблизительно между 5-12, 5-10 или 7-10°C большую, чем T_m IL-1Ra и/или IL-1β в концентрации приблизительно 0,5 мг/мл.

Белок может включать другие характеристики, описываемые здесь.

В другом аспекте раскрытие характеризует изолированный белок, который включает гибридный домен цитокина семейства IL-1. Примеры членов семейства цитокинов IL-1 включают IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10 и IL-33. Домен цитокина может включать рецептор-связывающий участок одного из вышеупомянутых цитокинов или белковую последовательность, которая включает элементы одного или более таких цитокинов. Например, домен цитокина может включать гибрид двух или более членов семейства цитокинов IL-1.

В одном варианте воплощения гибридный домен включает по меньшей мере один сегмент длиной в по меньшей мере пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70 аминокислот, и имеющий аминокислотную идентичность с (или по меньшей мере 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность с) первым цитокином семейства IL-1, и другой сегмент длиной в по меньшей мере пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 аминокислот, и имеющий аминокислотную идентичность со (или по меньшей мере 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность со) вторым цитокином семейства IL-1. Гибридный домен может быть менее чем на 90, 85, 80 или 75% идентичный одному или обоим из первого и второго цитокина семейства IL-1.

В одном варианте воплощения первый и второй цитокин семейства IL-1 отобраны из группы, состоящей из IL-1β, IL-1α и IL-1Ra. В другом варианте воплощения первый и второй цитокины семейства IL-1 отобраны из группы, состоящей из IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7 и IL-1F8. В другом варианте воплощения первый цитокин семейства IL-1 отобран из группы агонистов и второй отобран из группы антагонистов. В некоторых вариантах воплощения гибридный домен включает менее чем 120, 110, 100, 90 или 80 непрерывных аминокислот из того же родительского домена цитокина.

В одном варианте воплощения гибридный домен идентичный первому цитокину семейства IL-1 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 положениям, и идентичный второму цитокину семейства IL-1 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 положениям (включая положения, которые индивидуально могут быть идентичными обоим цитокинам).

В одном варианте воплощения гибридный домен включает по меньшей мере два, три или четыре прерывистых сегмента, каждый в длину по меньшей мере пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 15 или 20 аминокислот, и имеющих аминокислотную идентичность с (или по меньшей мере 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность с) соответствующими сегментами первого цитокина семейства IL-1, и включающий аминокислоты преимущественно из второго цитокина семейства IL-1 в оставшихся положениях. В одном варианте воплощения гибридный домен включает 4, 5, 6 или 7 сегментов, где смежные сегменты происходят из различных родительских доменов цитокинов семейства IL-1. Например, каждая аминокислота в домене расположена в пептиде, имеющем в длину по меньшей мере 5 или 6 аминокислот из природного человеческого домена цитокина IL-1. В одном варианте воплощения гибридный домен включает по меньшей мере один, два или три из: (i) сегмента в длину по меньшей мере 50, 60, 65, 70 или 75 аминокислот из IL-1β, (ii) сегмента в длину по меньшей мере 15, 20, 25 аминокислот из IL-1Ra; и (iii) другого сегмента в длину по меньшей мере 15, 20, 25 аминокислот из IL-1Ra.

В одном варианте воплощения прерывистые сегменты включают остатки (i) 1-6 и 45-61, (ii) 1-6 и 86-95, (iii) 45-61 и 86-95, (iv) 1-6 и 148-153, (v) 45-61 и 148-153 или (vi) 86-95 и 148-153, в соответствии с нумерацией таких положений в IL-1β. Три прерывистых сегмента из первого цитокина семейства IL-1 могут включать, например, остатки 1-8, 42-120 и 141-153, остатки 1-10, 37-125 и 131-153 или остатки 1-6, 45-61, 86-95 и 148-153, в соответствии с нумерацией таких положений в IL-1β. Гибридный домен может быть на по меньшей мере 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичный второму цитокину семейства IL-1 в оставшихся положениях. В одном варианте воплощения одна или более границ прерывистых сегментов расположены в положениях, где первый и второй цитокины семейства IL-1 идентичные или консервативные. Белок может иметь другие характеристики, описываемые здесь.

В другом аспекте данное раскрытие характеризует изолированный ингибитор IL-1, включая домен цитокина семейства IL-1, который связывается с IL-1RI. Например, ингибитор IL-1 включает одну или более характеристик, указанных здесь выше или в ином месте. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает: (a) аминокислоты, идентичные IL-1Ra в следующих положениях ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130 и GLN141 (в соответствии с нумерацией IL-1β), и (b) аминокислоты, идентичные IL-1β в следующих положениях: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 и SER152. В некоторых вариантах воплощения сегменты A1 и A2 Сайта A, на по меньшей мере 80% идентичные (в совокупности) соответствующим сегментам IL-1Ra. В некоторых вариантах воплощения сегменты В1, В2 и В3 Сайта В, на по меньшей мере 80% идентичные (в совокупности) соответствующим сегментам IL-1β. Например, сегменты A1 и A2 Сайта A, на по меньшей мере 90% идентичные (в совокупности) соответствующим сегментам IL-1Ra; и сегменты B1, B2 и B3 Сайта B, на по меньшей мере 90% идентичные (в совокупности) соответствующим сегментам IL-1β. Например, сегменты A1 и A2 Сайта A идентичные соответствующим сегментам IL-1Ra; и сегменты B1, B2 и B3 Сайта B идентичные соответствующим сегментам IL-1β.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает последовательности, которые на по меньшей мере 80% идентичные (в совокупности) бета цепям β2, β3, β10 и β11 IL-1Ra, и последовательности, которые на по меньшей мере 80% идентичные (в совокупности) бета цепям β4, β6, β7 и β8 IL-1β. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает последовательности, идентичные бета-цепям β2, β3, β10 и β11 IL-1Ra, и последовательности, идентичные бета-цепям β4, β6, β7, и β8 IL-1β. В некоторых вариантах воплощения сегменты и характеристики, идентифицированные выше из IL-1β, получены из IL-1α или комбинации IL-1β или IL-1α.

В некоторых вариантах воплощения ингибитор IL-1 включает одно или более (например, по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть или семь) из следующих свойств: (i) остатки Сайта A или Сайта B (и/или расширенные остатки Сайта A или расширенные остатки Сайта B), которые на по меньшей мере 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в IL-1β, IL-1α или IL-1Ra; (ii) сегменты A1 и A2, которые в совокупности на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в IL-1Ra; (iii) сегменты B1, B2 и B3, которые в совокупности на по меньшей мере 80% идентичные соответствующим остаткам в IL-1β или IL-1α; (iv) участок Сайта A, который на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичный соответствующим остаткам в IL-1Ra; (v) участок Сайта B, который на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% соответствует остаткам в IL-1β или IL-1α; (vi) остатки Сайта C и/или Сайта D, которые на по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные соответствующим остаткам в IL-1Ra или IL-36Ra, (vii) сегмент C1, который на по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичный соответствующим остаткам в IL-1Ra; (viii) сегмент D2, который идентичный по меньшей мере по 3, 4 или 5 остаткам соответствующим остаткам в IL-1Ra. Домен цитокина отличается от IL-1Ra, например, домен цитокина менее чем на 99, 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60% идентичный IL-1Ra, и/или на по меньшей мере 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70% идентичный IL-1Ra, например, между 40-95%, 40-90% или 45-85% идентичный IL-1Ra. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина не содержит сегмент, более чем на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичный аминокислотам I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46-S110, V49-S110 или I46-G118 SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина не содержит сегмент, более чем на 80, 85, 90, 95 или 100% идентичный аминокислотам N7-V41, R11-M37, N102-D144 или Y121-D144 SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах воплощения ингибитор связывается с IL-1RI с K_D, меньшей чем 100, 50, 20, 10, 5 или 1 нМ. В некоторых вариантах воплощения ингибитор связывается с IL-1RI с большей аффинностью (например, более низкой K_D) и/или более медленной скоростью диссоциации, чем IL-1β или IL-1Ra.

В некоторых вариантах воплощения ингибитор не индуцирует значительно экспрессию IL-6 при контакте с человеческими клетками, отвечающими на IL-1β. В общем, ингибитор ингибирует передачу сигнала IL-1β, например, с IC₅₀, меньшей чем 100, 50, 20, 10 или 5 нМ.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает одну, две, три или более из следующих последовательностей: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9); NLEEK (SEQ ID NO:10); RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11); AMEADQP(SEQ ID NO:12); FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO:13); и/или последовательности, которые на по меньшей мере 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные вышеизложенным. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает одну, две, три или более из следующих последовательностей: VQGEESNDKI (SEQ ID NO:14); KKKMEKRF (SEQ ID NO:15); и FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN YPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO:16); и/или последовательности по меньшей мере на 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 или 100% идентичные вышеизложенным. Ингибитор может включать другие характеристики, описываемые здесь.

В другом аспекте раскрытие предоставляет изолированный белок, который включает аминокислотную последовательность на по меньшей мере 80, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичную раскрываемой здесь последовательности, например, последовательности, указанной в Таблице 4 или Примере 1, например, аминокислотную последовательность P01, P02, P03, P04, P05, P06 или P07, или последовательность в Примере 1, 5, 6 или в ином месте здесь. В некоторых вариантах воплощения аминокислотная последовательность включает по меньшей мере одно замещение, вставку или делецию. Аминокислотная последовательность может включать менее чем 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 неконсервативных замещений, или менее чем 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 суммарных замещений. Аминокислотная последовательность может включать по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 замещений, например, консервативных замещений.

Также предоставляются изолированные белки, которые включают метиониновый N-конец аминокислотной последовательности P01, P02, P03, P04, P05, P06 или P07 или последовательности в Примере 1, 5, 6 или в ином месте здесь, изолированные белки, которые включают аминокислотную последовательность P01, P02, P03, P04, P05, P06 или P07 или последовательность в Примере 1, 5, 6 или в ином месте здесь, в которой отсутствует аланиновый N-конец. Вышеуказанные последовательности могут включать иные характеристики, раскрываемые здесь. Например, последовательность может далее включать метку, такую как гекса-гистидиновую последовательность, например, N- или C-концевую в отношении IL-1RI-связывающей последовательности. Последовательность может далее включать функциональную группу, которая модифицирует стабильность или фармакокинетику IL-1RI-связывающей последовательности. В отношении последовательности, она далее может включать сывороточный альбумин и/или Fc-домен, или один или более доменов того, например, один или более константных доменов иммуноглобулина или один или более доменов альбумина. Белок может иметь другие характеристики, описываемые здесь. В некоторых вариантах воплощения изолированный белок состоит или состоит в основном из последовательности или гибридного домена, раскрываемого здесь.

В еще другом аспекте раскрытие предоставляет изолированный белок, который включает домен, имеющий форму описываемого здесь домена цитокина с круговыми перестановками, например, домен цитокина, указанный в Таблице 4, и/или домен, который включает SEQ ID NO:3. Белок далее может включать гетерологичную последовательность (такую как Fc-домен или альбумин) на N- или C-конце формы с круговыми перестановками, необязательно разделенную линкером. Белок может иметь другие характеристики, описываемые здесь.

Данное раскрытие также охарактеризовывает фармацевтические композиции, которые включают один или более рецептор-связывающих агентов, описываемых здесь (таких как белок, который включает гибридный домен цитокина). Композиции могут быть офтальмологическими фармацевтическими композициями, топическими композициями или композициями для парентерального введения.

В другом аспекте раскрытие охарактеризовывает способ модулирования иммунного или воспалительного ответа у субъекта. Способ может включать введение композиции, которая включает рецептор-связывающий агент, описываемый здесь, субъекту в количестве, эффективном для модулирования иммунного или воспалительного ответа у субъекта.

В другом аспекте раскрытие характеризует способ лечения IL-1-опосредованного нарушения у субъекта. Способ включает введение субъекту композиции, которая включает белок, способный связываться с IL-1RI, например, рецептор-связывающий агент, описываемый здесь. Например, нарушение может быть аутоиммунным нарушением, например, ревматоидным артритом или ювенильным хроническим артритом, склеродермой, синдромом Шергена, анкилозирующим спондилитом, синдромом Бехчета, воспалительным заболеванием кишечника, астмой, васкулитом или псориазом. Нарушение может быть нарушением, ассоциированным с образованием комплексов, например, гиперурикемия, подагра, диабет (включая инсулин-независимый диабет), болезнь Альцгеймера, вторичный реактивный амилоидоз, амиотрофический боковой склероз (АБС), болезнь Хантингтона или болезнь Паркинсона. Нарушение также может быть нарушением CAPS (CIAS1-ассоциированные периодические синдромы) или другим описываемым здесь нарушением.

В другом аспекте раскрытие характеризует способ лечения IL-1-опосредованного глазного нарушения у субъекта. Способ может включать введение субъекту композиции, включающей белок, способный связываться с IL-1RI, например, рецептор-связывающий агент, описываемый здесь. Например, композиция является офтальмологической композицией, которая вводится топически в глаз субъекта или в окружающий участок. В одном варианте воплощения нарушение является нарушением сухого глаза. В некоторых вариантах воплощения субъект не демонстрирует манифестации системного аутоиммунного заболевания. В некоторых вариантах воплощения субъект имеет синдром Шергена. В некоторых вариантах воплощения субъект имеет заболевание трансплантат-против-хозяина (ЗТПХ). В еще других вариантах воплощения нарушение является увеитом.

В еще одном аспекте раскрытие характеризует способ ингибирования активности IL-1. Способ включает контактирование рецептор-связывающего агента, способного связываться с IL-1RI, с клетками, отвечающими на IL-1 или с субъектом. В целом, белок предоставляется в количестве, эффективном для ингибирования активности IL-1, ассоциированной с клетками, или у субъекта. Белок можно контактировать с клетками от субъекта ex vivo.

В другом аспекте данное раскрытие характеризует изолированную нуклеиновую кислоту, которая включает одну или более последовательностей, кодирующих описываемые здесь белки, или нуклеиновую кислоту, описываемую здесь (например, в Таблице 5), последовательность, которая гибридизируется с такой нуклеиновой кислотой, или такой, которая на 80, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичная такой нуклеиновой кислоте. Примерные гибридизирующиеся последовательности могут быть в длину по меньшей мере 200, 300, 400, 420 или 450 нуклеотидов, например, в длину между 420-480 нуклеотидов. Нуклеиновая кислота также может включать другие характеристики, описываемые здесь.

Также характеризуется рекомбинантная клетка хозяина, которая включает нуклеиновую кислоту, которая включает одну или более последовательностей, кодирующих белки, описываемые здесь, и полипептидную цепь. Рецептор-связывающий агент может производиться способом, включающим поддержание клеток хозяина в условиях, разрешающих экспрессию рецептор-связывающего агента, и, необязательно, выделение рецептор-связывающего агента, например, из клеток или среды, ассоциированной с клетками хозяина. Например, рецептор-связывающий агент может быть очищен из лизата из клеток. Очищенный рецептор-связывающий агент может включаться в состав, например, с одним или более наполнителем, стабилизатором и буфером.

Также характеризуемым является способ предоставления гибридного белкового домена. Способ включает идентификацию по меньшей мере двух родительских белков, имеющих общую складку (например, первого родительского белка и второго родительского белка), локализацию по меньшей мере двух сегментов в первом родительском белке и конструирование нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, кодирующую гибридную аминокислотную последовательность, которая включает два сегмента из первого родительского белка и остатки, которые преимущественно происходят из второго родительского белка в оставшихся положениях. Домен может быть доменом, который в значительной степени составлен из β-складчатостей, или доменом, который в значительной степени составлен из α-спиралей, или доменом, имеющим комбинацию таких элементов. Например, домен может иметь складку цитокина. Первый и второй родительские белки могут быть связаны гомологией, например, аминокислотной идентичностью между 10-40%. В некоторых вариантах воплощения сегменты из первого белка расположены в белковом домене с единичной складкой, и гибридная аминокислотная последовательность включает форму складчатого белкового домена, который не идентичен соответствующему домену в первом и втором родительских белках. В некоторых вариантах воплощения два родительских белка имеют различные функциональные свойства, и гибридный домен может иметь свойства одного или обоих из родительских белков. В некоторых вариантах воплощения гибридный домен имеет один связывающий интерфейс из первого родительского белка и другой связывающий интерфейс из второго родительского белка.

Здесь делается ссылка на различные участки, сегменты и остатки в семействе цитокинов IL-1 в отношении Сайтов A, B, C и D. Локализация таких остатков, сегментов и участков в последовательности человеческого IL-1β (SEQ ID NO:1) и соответствующие положения предоставлены ниже и на Фиг. 1:

Сайт A. Остатки Сайта A в IL-1β включают: ARG11, SER13, GLN14, GLN15, SER21, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLU128, ASN129 и MET130, и соответствующие остатки других членов семейства цитокинов IL1 (называемые здесь «остатки Сайта А»). В определенных контекстах, в частности, в связи с IL-1β, ссылка делается на «расширенные остатки Сайта А», которые включают остатки Сайта А наряду с GLN149 и PHE150, и соответствующие остатки других членов семейства цитокинов IL1. Кроме того, возможно определить «участок Сайта А», как показано на Фиг. 4, включая, например, сегмент A1 (относящийся в IL-1β к 11-36 с SEQ ID NO:1) и сегмент A2 (относящийся в IL-1β к 125-131 с SEQ ID NO:1), и соответствующие сегменты в других членах семейства цитокинов IL1.

Сайт B. Остатки Сайта В в IL-1β включают: ALA1, PRO2, ARG4, GLN48, GLU51, ASN53, ILE56, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105 и ASN108, и соответствующие остатки других членов семейства цитокинов IL1 (называемые здесь «остатки Сайта В»). В определенных контекстах, в частности, в связи с IL-1β, ссылка делается на «расширенные остатки Сайта В», которые включают остатки Сайта В наряду с PHE46 и SER152, которые находятся снаружи участка сайта В на Фиг. 4. Кроме того, возможно определить «участок Сайта В», как показано на Фиг. 4, включая, например, сегмент В1 (относящийся в IL-1β к 1-5 с SEQ ID NO:1), сегмент B2 (относящийся в IL-1β к 48-56 с SEQ ID NO:1) и сегмент B3 (относящийся в IL-1β к 92-98 с SEQ ID NO:1), и соответствующие сегменты в других членах семейства цитокинов IL1.

Сайт C. Остатки Сайта С в IL-1β включают: ILE104, ILE106, ASN107, LYS109, GLU111, THR137, LYS138, GLY139, GLY140, GLN141, THR144 и ASP145, и соответствующие остатки других членов семейства цитокинов IL1 (называемые здесь «остатки Сайта С»). Кроме того, возможно определить «участок Сайта С», как показано на Фиг. 4, включая, например, сегмент С1 (относящийся в IL-1β к 136-145 с SEQ ID NO:1), и соответствующие сегменты в других членах семейства цитокинов IL1.

Сайт D. Остатки Сайта D в IL-1β включают: LEU6, THR9, LYS63, GLU64, LYS65 и ASN66, и соответствующие остатки других членов семейства цитокинов IL1 (называемые здесь «остатки Сайта D»). Кроме того, возможно определить «участок Сайта D», как показано на Фиг. 4, включая, например, сегмент D1 (относящийся в IL-1β к 6-9 с SEQ ID NO:1), сегмент D2 (относящийся в IL-1β к 37-41 с SEQ ID NO:1) и сегмент D3 (относящийся в IL-1β к 63-66 с SEQ ID NO:1), сегмент D4 (относящийся в IL-1β к 86-91 с SEQ ID NO:1) и сегмент D5 (относящийся в IL-1β к 150-153 с SEQ ID NO:1), и соответствующие сегменты в других членах семейства цитокинов IL1.

Дальнейшая идентификация локализации остатков и участков для Сайтов A, B, C и D может быть обнаружена путем выравнивания изучаемого цитокина с последовательностями, показанными на Фиг. 4.

Аминокислотная последовательность IL-1β (человека), как указано ниже, являет собой: APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (SEQ ID NO:1).

Аминокислотная последовательность IL-1α (человека), как указано ниже, являет собой: SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQSIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA (SEQ ID NO:2).

Аминокислотная последовательность IL-1Ra (человека), как указано ниже, являет собой: RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED (SEQ ID NO:3). Термины IL-1β, IL-1α и IL-1Ra, как используются здесь, относятся к соответствующим зрелым белкам.

β-складчатости, упоминаемые здесь и показанные на Фиг. 4, относятся к следующим последовательностям:

Таблица 1 Складка IL-1β (SEQ ID NO:1) IL-1Ra (SEQ ID NO:3) Петля IL-1β (SEQ ID NO:1) IL-1Rα (SEQ ID NO:3) β1 6-12 11-17 β1β2 13-17 18-22 β2 18-21 23-26 β2β3 22-24 27-28 β3 25-28 29-32 β3β4 29-41 33-45 β4 42-46 46-50 β4β5 47-56 51-54 β5 57-62 55-60 β5β6 63-66 61-64 β6 67-70 65-68 β6β7 71-80 69-78 β7 81-83 79-81 β7β8 84-99 82-98 β8 100-105 99-104 β8β9 106-109 105-108 β9 110-114 109-113 β9β10 115-120 114-119 β10 121-123 120-122 β10β11 124-130 123-129 β11 131-135 130-134 β11β12 136-145 135-145 β12 146-150 146-150

Расчет «гомологии» или «идентичности последовательности» между двумя последовательностями (здесь термины используются взаимозаменяемо) производится следующим образом. Последовательности выравниваются в соответствии с выравниваниями, предоставленными здесь, или, в отсутствие соответствующего выравнивания, оптимальное выравнивание определяется как наилучший балл с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша, как это выполняется в алгоритме Needle пакета EMBOSS с использованием матрицы замен Blosum 62 со штрафом за пропуск в последовательности 10 и штрафом за продолжение делеции 1. См. Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453; Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley, и инструментов, доступных от Европейского Института Биоинформатики (European Bioinformatics Institute (Cambridge UK) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice, P. et al., A., Trends in Genetics 16, (6) pp. 276-277, и доступных онлайн на http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html и http://emboss.open-bio.org/wiki/Appdoc:Needle. Затем сравниваются аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующем положении во второй последовательности, тогда молекулы идентичны в этом положении (в данном контексте «идентичность» аминокислот или нуклеотидов эквивалентна «гомологии» аминокислот или нуклеотидов). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей. Для определения совокупной идентичности одной исследуемой последовательности с группой референтных последовательностей, положение считается идентичным для по меньшей мере одной аминокислоты в соответствующем положении в любой одной или более из группы референтных последовательностей. В отношении списков сегментов, характеристик или участков, идентичность может быть рассчитана в совокупности для всех членов такого списка для получения общей процентной идентичности.

Здесь предоставляются последовательности, которые на по меньшей мере 80, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные раскрываемым здесь последовательностям.

В данном контексте термин «относящийся к» используется для обозначения положения аминокислотного остатка в исследуемом полипептиде по отношению к референтному полипептиду. В целом, позицией является позиция, указанная предоставленным здесь выравниванием (например, Фиг. 4).

В данном контексте термин «гибридизируется в строгих условиях» описывает условия для гибридизации и отмывания. Руководство для проведения реакций гибридизации можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, которое включено в настоящую заявку посредством ссылки. В этой ссылке описываются водные и неводные способы, и может быть использован любой из них. Строгие условия гибридизации включают гибридизацию в 6X SSC при приблизительно 45°C с последующим одним или более отмываний в 0,2X SSC, 0,1% ДСН (додецил сульфат натрия) при 65°C, или в значительной степени подобных условиях. Здесь предоставляются изолированные нуклеиновые кислоты, которые содержат последовательности, гибридизирующиеся в строгих условиях с нуклеиновыми кислотами, кодирующими раскрываемые здесь аминокислотные последовательности, и с раскрываемыми здесь нуклеиновыми кислотами, например, в Примере 1.

Упоминаемые здесь природные белки специфически включают человеческую форму такого белка и также формы от других видов млекопитающих.

Все патенты, опубликованные заявки на патенты и опубликованные ссылки, цитируемые здесь, включены в настоящую заявку посредством ссылки для всех целей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 является графическим изображением структуры P04, как было определено из данных рентгенокристаллографии. Остов остатков из IL-1Ra показан в черном цвете, и остов остатков из IL-1β показан в сером цвете.

ФИГ. 2 описывает три вида модели белка P05, связанного с внеклеточным доменом человеческого IL-1RI. В P05 остатки IL-1Ra изображены в черном цвете, а остатки IL-1β изображены в белом цвете.

ФИГ. 3 описывает модели гибридных белков, в которых остатки IL-1Ra изображены в черном цвете, а остатки IL-1β изображены в белом цвете. Модель описывает белки: P01 (ФИГ. 3A), P03 (ФИГ. 3B), P04 (ФИГ. 3C), P05 (ФИГ. 3D), P07 (ФИГ. 3E) и P06 (ФИГ. 3F).

ФИГ. 4 предоставляет выравнивание нескольких человеческих цитокинов семейства IL-1: IL-1β (SEQ ID NO:1), IL-1α (SEQ ID NO:2), IL-1Ra (SEQ ID NO:3), IL-33 (SEQ ID NO:4), IL-36Ra (SEQ ID NO:5), IL-36α (SEQ ID NO:6), IL-36β (SEQ ID NO:7) и IL-36γ (SEQ ID NO:8). Сегменты, упомянутые здесь в тексте, идентифицируются при выравнивании. В добавление, идентифицируются β-складчатости и петли между такими складками.

ФИГ. 5A является перечислением аминокислотной последовательности P01 (SEQ ID NO:17). ФИГ. 5B является перечислением аминокислотной последовательности P02 (SEQ ID NO:18). ФИГ. 5C является перечислением аминокислотной последовательности P03 (SEQ ID NO:19). ФИГ. 5D является перечислением аминокислотной последовательности P04 (SEQ ID NO:20). ФИГ. 5E является перечислением аминокислотной последовательности P05 (SEQ ID NO:21). Сегменты из IL-1β указаны жирным курсивом. См. также Пример 1 ниже.

ФИГ. 6 является изображением ДСН-ПААГ геля, демонстрирующим примерные образцы белка, очищенного из клеток E. coli, экспрессирующих рецептор-связывающий агент. Маркеры с молекулярным весом 15 и 20 кДа указаны слева. Линии соответствуют следующему: маркер молекулярного веса (линия 1 и 6), экстракт (линии 2 и 7), материал, очищенный катионообменной хроматографией (линии 3 и 8), материал, дополнительно очищенный анионообменной хроматографией (линии 4 и 9), и восстановленные образцы такого материала (линии 5 и 10). Линии 2-5 являются очисткой P05, и линии 6-10 - очисткой P04. См. также Пример 2.

ФИГ. 7A представляет собой таблицу, и сопутствующая столбчатая диаграмма демонстрирует способность белков P06, P07 и P01 служить агонистами передачи сигналов в отношении IL-1β и негативного контроля, белка β-глюкуронидазы (GUS). ФИГ. 7B является графиком, изображающим антагонизм P01 в отношении IL-1β при различных концентрациях IL-1β.

ФИГ. 8A является графиком, изображающим антагонизм P03 (меченный гекса-гистидином), P04 (меченный гекса-гистидином), P05 (меченный гекса-гистидином) и IL-1Ra в отношении IL-1β в присутствии 0,1 нг/мл IL-1β (человека). ФИГ. 8B является графиком, изображающим антагонизм лизатами, содержащими немеченые формы P01, P02, P03, P04 и P05, и IL-1Ra в отношении IL-1β в присутствии 0,1 нг/мл IL-1β (человека), и используя определения концентраций белка в соответствующих лизатах.

ФИГ. 9 содержит графики с данными поверхностного плазмонного резонанса (SPR), демонстрирующими кинетику связывания с иммобилизированным растворимым IL-1RI для следующих белков: IL-1β (ФИГ. 9A), IL-1Ra (ФИГ. 9B), P04 (ФИГ. 9C) и P05 (ФИГ. 9D).

ФИГ. 10A является графиком, показывающим температурную денатурацию IL-1Ra, IL-1β, P03, P04 и P05, как описывается в Примере 7. ФИГ. 10B представляет негативное первое производное графика на ФИГ. 10A.

ФИГ. 11A является столбчатой диаграммой, демонстрирующей средний балл окрашивания роговицы ± стандартная ошибка среднего (SEM) на роговицу глаза в тесте с окрашиванием флуоресцеином в двух независимых исследованиях, в дни 0, 3, 7, 9 и 11 у мышей на модели сухого глаза. Мыши не получали никакого лечения (n=18), 10 мг/мл P05 (n=19) или 1,25× ЗФФ (забуференный фосфатами физраствор, PBS), носитель (n=20). Звездочки указывают на статистическую значимость P05 по отношению к носителю следующим образом: * (P<0,05) и ** (P<0,005).

ФИГ. 11B является столбчатой диаграммой, представляющей данные отдельного эксперимента, демонстрирующего средний балл окрашивания роговицы ± стандартная ошибка среднего (SEM) на роговицу глаза глаз в дни 0, 3, 7, 9 и 11 у мышей на модели сухого глаза. Мыши не получали никакого лечения (n=8), 1,25×носителя PBS (n=8), 10 мг/мл мышиного сывороточного альбумина (МСА) (n=8) или 10 мг/мл P05 (n=9). Звездочки указывают на статистическую значимость P05 по отношению к мышиному сывороточному альбумину следующим образом: * (P<0,05) и *** (P<0,0005).

ФИГ. 11C является столбчатой диаграммой, включающей данные для мышей, леченных Restasis® (0,05% эмульсия циклоспорина) (n=8) в том же эксперименте, то и на ФИГ. 11B. Звездочки указывают на статистическую значимость P05 по отношению к Restasis® следующим образом: **(P<0,005) и ***(P<0,0005).

ФИГ. 12A описывает структуру рентгенокристаллографической структуры (черным цветом) P04, наложенную на рассчитанную модель (серым цветом) его структуры. ФИГ. 12B иллюстрирует взаимодействие между K64 и Е39 Р04; ФИГ, 12С иллюстрирует взаимодействие между С-концевыми остатками Q149 и S152 с K40 и R9 P04.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ

Семейство цитокинов IL-1 включает несколько членов, все имеют общую складку в форме β-трилистника, состоящую из шести β-цепей, которые образуют β-бочонок, накрытый другими шестью β-цепями. Первичные структуры форм этих цитокинов у человека и других млекопитающих известны. Примерное структурное выравнивание нескольких членов семейства IL-1 показано на Фиг. 1.

Мы обнаружили, среди прочего, что складка IL-1 является высокопластичной. В частности, элементы от различных членов можно комбинировать для предоставления белков, которые могут служить агонистами или антагонистами сигналов цитокинов. Примеры этих белков включают гибридные домены цитокинов, которые включают, например, два или более сегментов или поверхностных остатков от одного цитокина в окружении другого цитокина или консенсусной последовательности цитокина, тем самым создавая не встречающиеся в природе комбинации сайтов рецепторного взаимодействия из различных цитокинов семейства IL-1.

Цитокины семейства IL-1 могут включать по меньшей мере два первичных сайта рецепторного взаимодействия, называемых как Сайт А и Сайт В. Сайты А и В задействованы в контактах с первичным рецептором цитокина (например, IL-1RI). В случае IL-1Ra и IL-1β, например, эти два белка в значительной степени отличаются по отношению к сайтам А и В таким образом, что IL-1Ra образует меньше рецепторных контактов в Сайте В по сравнению с Сайтом А.

Мы обнаружили, что возможно сконструировать функциональные гибридные домены цитокинов, которые включат Сайт А, полученный из одного цитокина, и Сайт В, полученный из другого цитокина. Пластичность складки IL-1 позволяет конструировать разнообразные гибридные домены цитокинов для создания антагонизма передачи сигналов IL-1.

Кроме того, цитокины семейства IL-1 могут включать два вторичных сайта рецепторного взаимодействия, названные как Сайт С и сайт D, которые вовлечены в агонистические и/или антагонистические взаимодействия, и могут служить определителями способности цитокинов взаимодействовать со своим вторичным рецептором цитокинов (например, IL-1RAcP). Включение остатков сайта С и/или Сайта D от природных антагонистов рецепторов (таких как IL-1Ra) может придавать свойства антагонистов. Могут быть сконструированы гибридные домены цитокинов, которые включают один или оба сайта А и В из одного или более агонистов IL-1 (таких как IL-1β и IL-1α) и/или антагонистов рецептора IL-1 (такого как IL-1Ra) и одного или обоих из Сайтов С и D из антагониста рецептора IL-1 (такого как IL-1Ra). Соответственно, возможно получить гибридный домен цитокина, который служит антагонистом передачи сигнала и который включает остатки Сайта В из агониста IL-1.

Примерные комбинации также предоставлены в Таблице 2 ниже:

Таблица 2 A B C D 1. IL-1β или 1α IL-1β или 1α IL-1Ra IL-1β или 1α 2. IL-1β или 1α IL-1β или 1α IL-1β или 1α IL-1Ra 3. IL-1β или 1α IL-1β или 1α IL-1Ra IL-1Ra 4. IL-1Ra IL-1β или 1α IL-1Ra IL-1β или 1α 5. IL-1Ra IL-1β или 1α IL-1β или 1α IL-1Ra 6. IL-1Ra IL-1β или 1α IL-1Ra IL-1Ra

Исходные последовательности могут быть идентичными человеческим последовательностям в отношении идентифицированных доменов цитокина или могут содержать мутации, относящиеся к человеческим последовательностям, например, такие, которые на по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичные человеческим последовательностям в каждом соответствующем участке, например, они могут включать один или более сегментов из каждого участка.

Для максимизации аффинности для первичного рецептора могут быть избраны источники для остатков Сайта А и остатков Сайта В. Например, для связывания IL-1RI, остатки Сайта А могут быть получены из IL-1Ra, и остатки Сайта В могут быть получены из IL-1β.

Гибридный домен цитокина может иметь способность связываться с рецептором семейства IL-1, например, с человеческим IL-1RI с K_D, меньшим чем 10^-8, 10^-9 или 10^-10, например, K_D в пределах 10-кратного или 100-кратного значения K_D природного рецепторного лиганда (например, IL-1β, IL-1α или IL-1Ra) в тех же условиях, или меньшим чем K_D природного лиганда (например, IL-1β, IL-1α или IL-1Ra) в тех же условиях. Более того, в определенных вариантах воплощения гибридный домен цитокина связывается с K_D меньшим, K_on более быстрым или K_off более медленным, чем по меньшей мере один из своих родительских доменов цитокина.

Гибридные домены цитокинов, которые связываются с рецептором семейства IL-1 и которые являются антагонистами передачи сигнала рецептором, могут быть использованы в качестве рецептор-связывающих агентов, например, для лечения нарушений, опосредованных передачей сигнала цитокинами семейства IL-1, как описано ниже. Например, в некоторых вариантах воплощения гибридный домен цитокина связывается с IL-1RI и служит антагонистом передачи сигнала IL-1. Например, он имеет IC₅₀ менее чем 100, 10, 1, 0,6 или 0,3 нМ.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина может быть на по меньшей мере 40, 45 или 50% идентичный, однако, менее чем полностью идентичный, например, менее чем на 95, 90, 85 или 80% идентичный первому домену цитокина семейства IL-1. В то же время домен цитокина может быть на по меньшей мере 40, 45, или 50% идентичный, однако, менее чем полностью идентичный, например, менее чем на 95, 90, 85 или 80% идентичный второму домену цитокина семейства IL-1. Первый и второй домен цитокина семейства IL-1 могут быть менее чем на 50% идентичные один другому. Например, первый домен цитокина семейства IL-1 может быть агонистом (например, IL-1β или IL-1α), в то время как второй домен цитокина семейства IL-1 может быть антагонистом рецептора (например, IL-1Ra).

В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере 80, 85, 90, 92, 94, 95, 97, 98, 99 или 100% положений в домене цитокина имеют такое свойство, что в каждом из таких положений представленная аминокислота, идентичная либо первому домену цитокина семейства IL-1, либо второму домену цитокина семейства IL-1 (или обоим, если первый и второй домен цитокина семейства IL-1 идентичные в конкретном положении). Там, где 100% положений аминокислот в домене цитокина имеют это свойство, домен является полным гибридом двух цитокинов. Гибридные домены цитокинов также могут быть приготовлены из более чем двух цитокинов и могут также иметь мутации по отношению к своим родительским цитокинам (например, одно или более конкретных положений, где представленная аминокислота отличается от соответствующей аминокислоты в каждом из своих родительских цитокинов).

Домены цитокинов могут иметь остатки Сайтов А, B, C и D от различных доменов цитокинов IL-1 и, сходным образом, могут иметь участки Сайтов A, B, C и D от различных доменов цитокинов IL-1.

САЙТ A. Например, в некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает остатки антагониста рецептора (например, IL-1Ra) или агониста в по меньшей мере 5, 10, 12, 15, 16, 17 или 18 идентифицированных выше остатках Сайта А, или в по меньшей мере 5, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 идентифицированных выше расширенных остатках Сайта А, или консервативные замещения таких остатков, или по меньшей мере 50, 65, 75, 80, 90, 95 или 100% таких остатков. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, которые на по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные сегментам A1, A2 или A1+A2 в антагонисте рецептора (например, IL-1Ra) или в агонисте (например, IL-1β или IL-1α).

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, идентичные агонисту IL-1 (например, остатки IL-1β) в по меньшей мере 5, 10, 12, 15, 16, 17 или 18 идентифицированных здесь остатках Сайта А, или в по меньшей мере 5, 10, 12, 15, 16, 17 или 18 идентифицированных выше расширенных остатках Сайта А, или консервативные замещения таких остатков, или по меньшей мере 50, 65, 75, 80, 90, 95 или 100% таких остатков.

САЙТ B. В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, идентичные агонисту IL-1 (например, остатки IL-1β или IL-1α) в по меньшей мере 2, 3, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 идентифицированных здесь остатках Сайта В, или консервативные замещения таких остатков, или по меньшей мере 50, 65, 75, 80, 90, 95 или 100% таких остатков. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, которые на по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95 или 100% идентичные сегментам B1, B2, B3, B1+B2, B1+B3, B2+B3 или B1+B2+B3 в агонисте цитокина IL-1 (например, IL-1β или IL-1α).

САЙТ C. В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, идентичные антагонисту рецептора (например, остатки IL-1Ra) в по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 идентифицированных здесь остатках Сайта С, или консервативные замещения таких остатков, или по меньшей мере 50, 65, 75, 80, 90 или 100% таких остатков. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, которые на по меньшей мере 50, 65, 75, 80, 90 или 100% идентичные сегменту C1 в антагонисте рецептора (например, IL-1Ra).

В определенных вариантах воплощения домен цитокина может включать, например, одну или более гидрофобных аминокислот (например, Met или Ile) в положении, соответствующем THR137 SEQ ID NO:1, или гидрофобных, например, алифатических аминокислот (например, Val или Ile) в положении, соответствующем GLN141 SEQ ID NO:1, и некислую аминокислоту, такую как основную аминокислоту (например, Lys или Arg) в положении, соответствующем ASP145 SEQ ID NO:1, и такие остатки в положениях, соответствующих тому в других цитокинах IL-1. Данные указывают на то, что ASP145 важен для рекрутинга IL-1RAcP, и, соответственно, мутация некислого основания нарушает активность агониста и может быть использована для придания свойства антагониста. Соответственно, в определенных вариантах воплощения некислая аминокислота, такая как основная аминокислота (например, Lys или Arg), или гидрофобная аминокислота, которая расположена в положении, соответствующем ASP145 SEQ ID NO:1.

САЙТ D. В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, идентичные антагонисту рецептора (например, остатки IL-1Ra) в по меньшей мере одном, двух, трех, четырех, пяти или шести идентифицированных здесь остатках Сайта D, или консервативные замещения такого остатка, или по меньшей мере, 50, 65, 75, 80, 90, 95 или 100% таких остатков. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает остатки, которые на по меньшей мере 50, 65, 75, 80, 90, 95 или 100% идентичные сегментам D1, D2, D3, D4, D5, D1+D2, D1+D2+D3, и их комбинации в антагонисте рецептора (например, IL-1Ra).

Несколько остатков в IL-1β находятся в контакте или в близости с IL-1RI, например: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, ALA127, GLU128, ASN129, MET130, GLN141, GLN149, PHE150 и SER152. Дополнительно, остатки приписаны к сайтам, как описано выше, эти остатки могут быть классифицированы на два набора: Набор 1 и Набор 2.

Примерные остатки Набора 1 в IL-1β включают: ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130 и GLN141, и соответствующие остатки в других членах семейства цитокинов IL-1. Расширенные остатки Набора 1 включают остатки взаимодействия Набора 1 и остатки в пределах 4 ангстрем упомянутого выше в структуре 1ITB. Примерные остатки Набора 2 в IL-1β включают: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 и SER152, и соответствующие остатки в других членах семейства цитокинов IL-1. Расширенные остатки Набора 2 включают остатки взаимодействия Набора 2 и остатки в пределах 4 ангстрем упомянутого выше в структуре 1ITB. В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает IL-1β остатки в по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 остатке из Набора 1, идентифицированных выше. В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает IL-1β остатки в по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков из Набора 2, идентифицированных выше. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает остатки IL-1β в по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 расширенном остатке Набора 1. В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает IL-1β остатки в по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 расширенном остатке Набора 2.

Другие варианты, которые могут использоваться в качестве рецептор-связывающего агента, включают белки, имеющие последовательности, происходящие из двух или более членов семейства цитокинов IL-1. Примеры таких вариантов включают гибридные домены, основанные на IL-1β и IL-1Ra. Например, варианты могут включать один или более аминокислотных остатков из Набора 1 IL-1Ra (например, все остатки Набора 1 из IL-1Ra) и один или более аминокислотных остатков из Набора 2 IL-1β (например, все остатки Набора 2 из IL-1β).

Примерные гибридные белки преимущественно (например, на по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичные IL-1β в следующих аминокислотных положениях (т.е. основанные на соответствии этим позициям в IL-1β):

остатки 1-8, 42-120 и 141-153 SEQ ID NO:1; остатки 1-6, 45-61, 86-95 и 148-153 SEQ ID NO:1; и остатки 1-10, 37-125 и 131-153 SEQ ID NO:1.

Оставшиеся остатки могут быть преимущественно (например, по меньшей мере на 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичные IL-1Ra. Например, следующие аминокислотные положения могут быть преимущественно идентичные IL-1Ra:

остатки 9-41 и 121-140 SEQ ID NO:1; остатки 7-44, 62-85 и 96-147 SEQ ID NO:1; и остатки 11-36 и 126-130 SEQ ID NO:1.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина идентичный IL-1β по меньшей мере 2, 4, 5, 10 или 20 положениям дополнительно к аминокислотным положениям Gln48-Asn53 IL-1β, и, например, домен цитокина, преимущественно, например, по меньшей мере на 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичный цитокину, отличному от IL-1β.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7 или 8 остатков, идентичных IL-1β в положениях, соответствующих 1-8 SEQ ID NO:1. Например, он включает остатки, идентичные IL-1β в положениях, соответствующих 3, 4 или все 5 из ALA1, PRO2, VAL3, ARG4 и LEU6.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 остатков, идентичных IL-1β в положениях, соответствующих 45-61 SEQ ID NO:1. Например, он включает остатки, идентичные IL-1β в положениях, соответствующих 3, 4, 5, 6, 7 или 8 из PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56 и PRO57.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков, идентичных IL-1β в положениях, соответствующих 86-95 SEQ ID NO:1. Например, он включает остатки, идентичные IL-1β в положениях, соответствующих одному, двум или всем трем из LYS92, LYS93 и LYS94.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере 3, 4, 5 или 6 остатков, идентичных IL-1β в положениях, соответствующих 148-153 SEQ ID NO:1. Например, он включает остатки, идентичные IL-1β в положениях, соответствующих одному, двум или всем трем из GLN149, PHE150 и SER152.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина не включает треонин в положении, соответствующем THR147 в IL-1β. Например, это положение может быть ароматическим, таким как тирозин. Соединение ароматического ряда в положении, соответствующем THR147 в IL-1β, может укладываться против другого соединения ароматического ряда (например, триптофана), присутствующего в нескольких вариантах воплощения в положении 11 (в соответствии с нумерацией IL-1β).

В определенных вариантах воплощения домен цитокина не включает соединение ароматического ряда в положении, соответствующем CYS8 в IL-1β. Например, этой позицией может быть аминокислота, отличная от фенилаланина или отличная от соединения ароматического ряда. Например, она может быть цистеином, валином, серином, треонином или аланином. Это положение расположено рядом с другими объемными остатками, в частности, с MET44 и MET148 (в соответствии с нумерацией IL-1β). Предпочтительно, не все три положения 8, 43 и 148 представляют собой объемные остатки.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере пять, шесть или семь остатков, идентичных IL-1Ra в положениях, соответствующих 30-36 SEQ ID NO:1, например, по меньшей мере пять, шесть или семь остатков, идентичных YLQGPNV (SEQ ID NO:43). Например, домен цитокина включает по меньшей мере 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 остатков, идентичных IL-1Ra в положениях, соответствующих 11-36 SEQ ID NO:1. Домен цитокина также может включать основный остаток в положении, соответствующем 145 SEQ ID NO:1.

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает: (a) глутаминовую кислоту в положении, соответствующему Val40 IL-1β, и лизин в положении, соответствующему Lys65 IL-1β; (b) аргинин в положении, соответствующему Thr9 IL-1β, и глутамин в положении, соответствующему Gln149 IL-1β; и/или (c) лизин в положении, соответствующему V41 IL-1β, и серин в положении, соответствующему Ser152 IL-1β.

Домен цитокина также может включать по меньшей мере четыре, пять, шесть или семь остатков, идентичных IL-1Ra в положениях, соответствующих 126-132, например, по меньшей мере четыре, пять, шесть или семь остатков, идентичных MEADQPVS (SEQ ID NO:44).

В определенных вариантах воплощения домен цитокина включает по меньшей мере 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 остатка, идентичных IL-1β в положениях, соответствующих 62-85 SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах воплощения домен цитокина включает одну или более из следующих аминокислотных последовательностей (например, все четыре из): RSLAFR (SEQ ID NO:45), IDVSFV (SEQ ID NO:46), KKMDKR (SEQ ID NO:47) и KFYMQF (SEQ ID NO:48); одну или более из следующих (например, все четыре из): RSLAFR (SEQ ID NO:45), IDVSFV (SEQ ID NO:46), NKLSFE (SEQ ID NO:49) и KFYMQF (SEQ ID NO:48); одну или более из следующих (например, все четыре из): RSLAFR (SEQ ID NO:45), EEKFSM (SEQ ID NO:50), RFVFIR (SEQ ID NO:51) и VTKFTM (SEQ ID NO:52); одну или более из следующих (например, все четыре из): RSLAFR (SEQ ID NO:45), EEKFSM (SEQ ID NO:50), FESAAC (SEQ ID NO:53) и VTKFTM (SEQ ID NO:54); или одну или более из следующих (например, все четыре из): LNCRIW (SEQ ID NO:55), EEKFSM (SEQ ID NO:50), PNWFLC (SEQ ID NO:56) и KFYMQF (SEQ ID NO:48).

Гибридные белки могут быть использованы для разнообразных целей. Например, они могут быть использованы для повышения или снижения активности передачи сигнала рецепторами, для обнаружения клеток, экспрессирующих рецепторы, или для очистки клеток или белков, с которыми они связываются.

Специфические примеры гибридных доменов цитокинов, основанные на IL-1β и IL-Ra, предоставлены в Примере 1, ниже, и включают следующие примерные домены цитокинов, которые служат антагонистами передачи сигналов IL-1:

P01. Домен P01 включает три сегмента из IL-1Ra, соответствующие аминокислотам Ala12-Val48, Ile60-Val83 и Asp95-Tyr147 SEQ ID NO:3, и оставшиеся четыре сегмента из IL-1β. В целом, домен P01 имеет 74 из 153 аминокислот из IL-1β (приблизительно 48% идентичность) и 119 аминокислот из IL-1Ra (приблизительно 77% идентичность). Эти проценты в сумме дают больше 100%, так как количество аминокислот в P01 и других примерных белках, раскрываемых здесь, являются аминокислотами, которые сохраняются между IL-1β и IL-1Ra, и, соответственно, вносят вклад в процентную идентичность, как для IL-1β, так и для IL-1Ra.

P02. Домен P02 включает три сегмента из IL-1Ra, соответствующие аминокислотам Ala12-Val48, Ile60-Val83 и Ser110-Tyr147 SEQ ID NO:3, и оставшиеся четыре сегмента из IL-1β. В целом, домен P02 имеет 85 из 153 аминокислот из IL-1β (приблизительно 55% идентичность) и 108 аминокислот из IL-1Ra (приблизительно 70% идентичность).

P03. Домен P03 включает два сегмента из IL-1Ra, соответствующие аминокислотам Ala12-Lys45 и Phe100-Lys145 SEQ ID NO:3, и оставшиеся три сегмента из IL-1β. В целом, домен P03 имеет 94 из 153 аминокислот из IL-1β (приблизительно 61% идентичность) и 91 аминокислоту из IL-1Ra (приблизительно 64% идентичность).

P04. Домен P04 включает два сегмента из IL-1Ra, соответствующие аминокислотам Ala12-Lys45 и Ala114-Lys145 SEQ ID NO:3, и оставшиеся три сегмента из IL-1β. В целом, домен P04 имеет 104 из 153 аминокислот из IL-1β (приблизительно 68% идентичность) и 89 аминокислот из IL-1Ra (приблизительно 58% идентичность).

P05. Домен P05 включает два сегмента из IL-1Ra, соответствующие аминокислотам Arg14-Lys45 и Phe120-Tyr147 SEQ ID NO:3, и оставшиеся три сегмента из IL-1β. В целом, домен P05 имеет 108 из 153 аминокислот из IL-1β (приблизительно 70% идентичность) и 85 аминокислот из IL-1Ra (приблизительно 55% идентичность).

Подобным образом могут быть сконструированы другие гибридные белки. Например, могут быть приготовлены гибридные белки, промежуточные между IL-1α и IL-1Ra, например, специфические домены, включающие идентифицированные сегменты IL-1Ra в комбинации с соответствующими остатками, скорее из IL-1α, чем из IL-1β, для каждого из примеров выше.

Белковые модификации и замещения

Белковые последовательности, такие как описаны здесь, могут быть изменены, например, путем проведения одного или двух консервативных замещений. Консервативные замещения могут быть выполнены для сохранения функции или проведения умеренных изменений функции. Примерные консервативные замещения описаны в следующей таблице:

Таблица 3 Первичная форма Примерные замещения Дальнейшие специфические замещения Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; leu leu Leu (L) норлейцин; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; leu; норлейцин ala

Замещения могут быть избраны на основе своего потенциального воздействия на (a) структуру остова вблизи замещения, например, развернутую или закрученную в спираль конформацию, (b) заряд или гидрофобность молекулы в таргетном сайте, или (c) объем и разветвленность боковой цепи. Аминокислотные остатки могут быть классифицированы на основе свойств боковых цепей: (1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr; asn; gln; (3) кислые: asp, glu; (4) основные: his, lys, arg; (5) остатки, влияющие на конформацию остова: gly, pro; и (6) ароматические: trp, tyr, phe.

Неконсервативные замещения могут включать замещение члена одного из этих классов на член другого класса. Консервативные замещения могут включать замещение члена одного из этих классов на член того же класса.

Значение конкретного остатка также можно оценить в контексте гидрофобного индекса для аминокислоты. Каждой аминокислоте присвоен гидрофобный индекс на основе ее гидрофобности и характеристик заряда: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9); и аргинин (-4,5). За обсуждением гидрофобного индекса аминокислоты и его значения см., например, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131.

Последовательность белка может быть изменена любым способом, включая опосредованный олигонуклеотидами (сайт-направленный) мутагенез, (Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487, 1987), кассетный мутагенез (Wells et al., Gene, 34:315, 1985), мутагенез способом рестрикционного отбора (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London, 317:415, 1986) и ПЦР мутагенез. См. также In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition, Braman (ed.), Humana Press, (2010) ISBN: 1607616513 и PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic Engineering, Chen and Janes (ed.), Humana Press, (2002) ISBN: 0896039730.

Может быть применен сканирующий аминокислотный анализ для оценки одной или более аминокислот по непрерывной последовательности. Способ может включать проведение мутации каждой или почти каждой аминокислоты в участке до конкретной аминокислоты, например, до относительно малой, нейтральной аминокислоты, такой как аланин, серин или валин. Обычно избирается аланин, так как он элиминирует боковую цепь за бета-углеродом и менее склонен изменять конформацию основной цепи варианта (Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085, 1989). Это также самая распространенная аминокислота, и она часто обнаруживается как в заглубленных, так и в экспонированных положениях (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1, 1976). Процесс сканирования также может быть адаптирован для проведения более выраженных изменений, например, заряженные остатки могут быть заменены на остатки противоположного заряда, остатки с короткими боковыми цепями могут быть замещены остатками с объемными боковыми цепями. Например, сканирование аргинина является подходом, который может быть использован вместо сканирования аланина или в добавление к нему. Сканирование может быть применено к каждому остатку с конкретным свойством, например, остаткам на поверхности белка или рядом с ней, или остаткам, предположительно находящимся на поверхности белка или рядом с ней.

Структура белка, одного из его доменов или комплекса, содержащего белок, может быть смоделирована, например, путем проведения моделирования, основанного на гомологии, минимизации энергии и/или другого моделирования с использованием известных расшифрованных структур. Такие способы включают: моделирующее программное обеспечение AMBER™ Accelrys Software Inc., Discovery Studio®, Release 3.0, San Diego: Accelrys Software Inc., 2010, (Case et al. (2005) J. Computat. Chem. 26, 1668-1688 и Case et al. (2010), AMBER 11, University of California, San Francisco, CA USA), и моделирующее программное обеспечение CHARMM™ (Molecular Simulations Inc.). Также см., в целом, Baker and Sali, Science 294(5540):93-6, 2001). Структура также может быть определена напрямую, например, с использованием рентгеновской кристаллографии и/или ЯМР-спектроскопии.

Примерные структуры базы данных белков (БДБ), описывающие структуру цитокинов семейства IL-1, включают: 1I1B, 1ILR, 1IRA, 1ITB, 2I1B, 2ILA, 2KLL, 4I1B, 5I1B, 6I1B, 7I1B, 8I1B, 9ILB и 1MD6 (доступно по адресу http на www.pdb.org от RCSB-Rutgers, Piscataway NJ, USA, и от Национальной Библиотеки Медицины (National Library of Medicine) (Bethesda, MD, USA)). Например, были расшифрованы структуры одного только IL-1β и в комплексе со своим рецептором IL-1RI. См., например, Finzel et al. (1989) J. Mol. Biol. 209:779-791, PDB 1ITB и Vigers et al. (1997) Nature 386:190-194. Структура IL-1Ra с IL-1RI также была расшифрована. См., например, PDB 1IRA и Schreuder et al., (1997) Nature 386:194-200.

Гомологичное моделирование может сопровождаться выравниванием последовательностей, например, с использованием компьютерного программного обеспечения, такого как Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), PSI-BLAST, PHI-BLAST, WU-BLAST-2 и/или MEGABLAST. См. Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410; Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266, 460-480; и Karlin et al., 1993, PNAS USA 90, 5873-5787. Дополнительные алгоритмы для выравнивания макромолекул (аминокислотных последовательностей и последовательностей нуклеиновых кислот) включают FASTA (Pearson, 1995, Protein Science 4, 1145-1160), ClustalW (Higgin et al., 1996, Methods Enzymol. 266, 383-402), DbClustal (Thompson et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28, 2910-2926) и Molecular Operating Environment (Chemical Computing Group, Montreal, Quebec Canada H3A 2R7). Кроме того, может быть использован алгоритм Маерса и Миллера (Myers & Miller, CABIOS 4, 11-17, 1988), который включен в программу ALIGN (версия 2.0) программного обеспечения выравнивания последовательностей GCG.

Консенсусная последовательность для IL-1β и IL-1Ra может быть получена путем сравнивания двух последовательностей и идентификации идентичных остатков или тех, которые являются высоко консервативными. Описываемый здесь домен цитокина может иметь по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 100% таких идентичных остатков или высоко консервативных остатков. Примерные консенсусные последовательности следующие: DXXQKX_{8-9}L-AXXLQGX_{18-28}LGX_{7}LSCVXXXDXXXLQLEXVX_{8-9}KXXKRFXFX_{10}FESAXXPXWXXXTXXXXXXPVXLX_{5-6}GXXXTXFXXQ (SEQ ID NO:57), где X - независимо любая аминокислота, и указанное нижним индексом число или диапазон является числом частотности. Описываемый здесь гибридный домен цитокина может иметь по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 100% идентичность с консенсусной последовательностью (где X - остатки, которые не учитываются в отношении идентичности). Другие консенсусные последовательности могут быть идентифицированы подобным образом.

Дальнейшие варианты члена семейства цитокинов IL-1 могут быть получены и оценены с использованием системы представления или другого скрининга, основанного на библиотеках. Например, варианты белков могут быть представлены или экспрессированы и оценены на предмет способности связываться с рецептором для члена семейства цитокинов IL-1. Например, варианты IL-1β, IL-1Ra или описываемый здесь домен цитокина может быть оценен на предмет способности связываться с растворимым внеклеточным доменом IL-1RI. Общее описание систем, основанных на системе представления, включают следующее: для клеточного представления, Chao et al. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68; Colby et al. Methods Enzymol. 2004; 388:348-58; Boder et al., Methods Enzymol. 2000; 328:430-44), для фагового представления (например, Viti et al., Methods Enzymol. 2000; 326:480-505 и Smith (1985) Science 228:1315-1317), и для рибосомного представления (например, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 и Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; и Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-3.

Хотя во многих вариантах воплощения, приведенных здесь в качестве примера, в качестве родительских доменов используются последовательности человеческого цитокина IL-1, могут быть использованы другие последовательности. Известны и доступны многочисленные другие цитокины IL-1, например, из других видов, и они находятся в публичных базах данных, таких как Entrez (Национальная Библиотека Медицины, Bethesda MD) и EBI-EMBL (Hinxton, Cambridge UK). Примеры таких последовательностей из базы данных UNIPROT (доступной по адресу UniProt.org и см. The UniProt Consortium, Nucleic Acids Res. D142-D148 (2010)), включают следующее:

Белок Номера доступа IL-1α P01583, P01582, P16598, P08831, Q28385, Q28579, O46612, P48089, P18430, P04822, P46647, O46613, Q3HWU1, P79161, Q60480, P79340 IL-1β P01584, P10749, Q28386, P09428, P14628, P21621, Q63264, P41687, P48090, Q9YGD3, P26889, Q2MH07, Q28292, Q9WVG1, P46648, P79182, P51493, Q865X8 IL-1Ra P18510, P25085, O18999, P26890, P25086, Q9GMZ4, Q9BEH0, O77482, Q866R8, Q29056 IL-1RI Q02955, P14778, P13504 IL-1RAcP Q9NPH3, Q61730, P59822, Q63621

Описываемые здесь домены цитокинов также могут включать замещения, присутствующие в вариантах доменов цитокинов, которые способны связываться с IL-1RI. Например, положение 15 SEQ ID NO:1 (соответствующее положению 20 SEQ ID NO:3) может быть Met или Asn. Положение 30 SEQ ID NO:1 (соответствующее положению 34 SEQ ID NO:3) может быть Gly, His, Trp или Met.

Дополнительные примерные варианты IL-1β и IL-1Ra включают такие, которые описаны в Boraschi et al. (1996) Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library 1, d270-308, Evans et al., J. Biol. Chem., 270:11477 (1995) и Greenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995). Например, варианты IL-1β включают R11G, R11A, Q15H, E105G и T147G. См., например, Evans et al. Варианты IL-1Ra включают W16Y, Q20M, Q20N, Y34G, Y34H, Y34W, Y34M, Y147G, Y147H, Y147M, K145D, H54P, V18S, T108K, C116F, C122S, C122A, Y147G, H54P, H54I и другие в Evans et al. и Greenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995). Домен цитокина может включать остаток, идентичный IL-1Ra в одном из предыдущих положений. Домен цитокина также может включать остаток, отличный от остатка вышеуказанных мутаций в соответствующем положении.

Кроме того, цитокины семейства IL-1 могут включать один или более неспаренных остатков цистеина. Один или более, например, два, три или все из таких неспаренных остатков цистеина могут быть мутированы до другой аминокислоты, например, незаряженной аминокислоты, такой как аланин или серин. Например, P01 включает цистеины в положениях 67, 70, 116 и 122 SEQ ID NO:17. Один, два, три или все четыре таких цистеина могут быть замещены другой аминокислотой, например, незаряженной аминокислотой, такой как аланин или серин. P02 включает цистеины в положениях 67, 70, 116 и 122 SEQ ID NO:18. Один, два, три или все четыре таких цистеина могут быть замещены другой аминокислотой, например, незаряженной аминокислотой, такой как аланин или серин. P03 включает цистеины в положениях 70, 116 и 122 SEQ ID NO:19. Один, два или все три таких цистеина могут быть замещены другой аминокислотой, например, незаряженной аминокислотой, такой как аланин или серин. P04 включает цистеины в положениях 70, 116 и 122 SEQ ID NO:20. Один, два или все три таких цистеина могут быть замещены другой аминокислотой, например, незаряженной аминокислотой, такой как аланин или серин. P05 включает цистеины в положениях 8, 70 и 122 SEQ ID NO:21. Один, два или все три таких цистеина могут быть замещены другой аминокислотой, например, незаряженной аминокислотой, такой как аланин или серин.

Все домены цитокина семейства IL-1, включая описываемые здесь гибридные домены цитокинов, также могут быть подвержены круговым перестановкам. Например, C-концевой сегмент из домена может быть репозиционирован таким образом, что он станет N-концом по отношению к первоначальному N-концу и N-концевому сегменту (обычно составляющему остаток первоначального белка после вырезания С-концевого сегмента). Два репозиционированных сегмента могут быть разделены линкером (например, составляющим от трех до десяти аминокислот). Обычно все аминокислоты, существующие в домене до круговой перестановки, сохранятся, за исключением изменения их порядка. В некоторых вариантах воплощения точкой разрезания для круговой перестановки может быть гибкий участок, например, гибкая петля, такая как β6-β7 (например, аминокислоты, относящиеся к 71-80 SEQ ID NO:3) или петля β7-β8 (например, аминокислоты, относящиеся к 84-99 SEQ ID NO:3).

В некоторых вариантах воплощения описываемый здесь рецептор-связывающий агент, например, рецептор-связывающий агент, который включает домен цитокина семейства IL-1, имеет молекулярный вес менее чем 30, 25, 22, 20, 19, 18 или приблизительно 17 кДа. В некоторых вариантах воплощения рецептор-связывающий агент имеет молекулярный вес более чем 18, 19, 20, 22, 25, 30, 40, 45 или 50 кДа. Например, рецептор-связывающий агент может включать другие полипептиды, полимерные или неполимерные компоненты, например, компоненты, которые модифицируют фармакокинетику, стабильность, иммуногенность и/или молекулярный вес агентов. Белок может включать другие модификации, например, пост-трансляцинные или синтетические модификации. В определенных вариантах воплощения рецептор-связывающий агент не гликозилирован. В других вариантах воплощения рецептор-связывающий агент включает по меньшей мере одно гликозилирование.

Например, описываемые здесь рецептор-связывающие агенты могут включать дополнителные домены и характеристики. Например, рецептор-связывающий агент может быть соединен, прямо или непрямо, с доменом белка антитела, например, с Fc доменом или одним или более константных доменов (например, CH1, CH2 или CH3). Например, домены могут быть человеческими доменами или вариантами человеческих доменов. Fc-домен или один или более константных доменов могут быть расположены с N-конца или С-конца рецептор-связывающего агента.

Fc-домены могут быть получены из любого подходящего иммуноглобулина, например, из человеческого антитела, например, такого как антитело подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, IgA, IgE, IgD или IgM. В одном примере Fc-домен включает последовательность из аминокислотного остатка в положении приблизительно Cys226 или в положении приблизительно Pro230 к карбоксильному концу Fc-домена. Fc обычно включает два константных домена, CH2 домен и CH3 домен, и, необязательно, включает CH4 домен. Антитела с замещениями в Fc-участке и повышенные полупериоды жизни в сыворотке также описаны в WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). Нумерация остатков в тяжелой цепи IgG соответствует нумерации в каталоге Евросоюза (EU index), как это приводится в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) со ссылкой на нумерацию ЕС человеческого антитела IgG1.

В одном варианте воплощения рецептор-связывающий агент включает «спасающий» рецептор-связывающий эпитоп, который повышает полупериод жизни в сыворотке in vivo, как описано в, например, патенте США 5739277 и Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000). В некоторых вариантах воплощения эпитоп включен в Fc-участок, которые соединен с рецептор-связывающим агентом.

В одном варианте воплощения рецептор-связывающий агент включает последовательность сывороточного альбумина или часть такой последовательности, которая связывается с FcRn-рецептором, или последовательность, которая связывается с сывороточным альбумином, например, человеческим сывороточным альбумином. Например, определенные пептиды, связанные с сывороточным альбумином, могут быть ассоциированы с рецептор-связывающим агентом, например, последовательность DICLPRWGCLW (SEQ ID NO:22). См. также Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).

Рецептор-связывающие агенты могут быть модифицированы с включением последовательности, которая повышает размер и стабильность агента, например, последовательности, описанной в WO2008/155134 или WO2009/023270. Такие последовательности могут, в основном, быть биологически неактивными, например, она не модулирует передачу сигнала членами семейства цитокинов IL-1. Могут быть использованы разнообразные стабилизирующие полипептидные последовательности, например, последовательности, богатые на глицин и/или серин, наряду с другими аминокислотами, такими как глутамат, аспартат, аланин или пролин. Например, последовательностям может быть задано иметь по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% остатков глицина и/или серина. В некоторых вариантах воплощения комбинированная длина стабилизирующих полипептидных последовательностей, присоединенных к белку, может быть по меньшей мере 20, 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или более чем 1000 или 2000 аминокислот. Стабилизирующие последовательности могут быть, например, соединенными с биологически активным полипептидом, например, с N- или C-концом рецептор-связывающего агента. Присоединение стабилизирующих последовательностей может приводить в результате к значительному возрастанию гидродинамического радиуса белка слияния по отношению к немодицифированному белку, что может быть обнаружено, например, способом ультрацентрифугирования, гель-фильтрации или светового рассеяния. В некоторых вариантах воплощения стабилизирующие последовательности призваны содержать мало или вообще не содержать следующих аминокислот: цистеин (чтобы избежать образования дисульфидов и окисления), метионин (чтобы избежать окисления), аспарагин и глутамин (чтобы избежать дезамидирования), и аспартат. Стабилизирующим последовательностям может быть предназначено иметь остатки пролина, которые имеют склонность снижать чувствительность к протеолитической деградации.

Тесты на связывание

Взаимодействие рецептор-связывающего агента со своими мишенями может быть проанализировано с использованием любого подходящего подхода, включая, например, радиоиммуноанализы, тесты на связывание клеток и поверхностный плазмонный резонанс (surface plasmon resonance, SPR). Примерные тесты на связывание клеток с использованием конкурентного связывания белков, меченных радиоактивным йодом, описаны в Boraschi, J. Immunol., 155(10):4719-25 (1995).

SPR или биомолекулярный анализ взаимодействия (Biomolecular Interaction Analysis, BIA) может обнаруживать биоспецифические взаимодействия в реальном времени и без мечения какого-либо из участников взаимодействия. Изменения в массе на поверхности связывания (свидетельствующее о явлении связывания) чипа BIA приводят в результате к изменению показателя светового преломления возле поверхности (оптическое явление поверхностного плазмонного резонанса (SPR)). Изменения в преломлении генерирует поддающийся обнаружению сигнал, который измеряется как показатель взаимодействия в реальном времени между биологическими молекулами. Способы использования SPR описаны, например, в Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 и в ресурсах он-лайн, предоставляемых BIAcore International AB (Uppsala, Sweden). Могут использоваться система BIAcore® или двухканальный Reichert SR7000DC Dual Channel SPR для сравнения и оценки взаимодействий в реальном времени, в терминах кинетики, аффинности или специфичности, без использования меток. Аффинности связывания рецептор-связывающего агента с внеклеточным доменом рецептора цитокина (например, внеклеточным доменом IL-1RI) могут быть измерены с использованием SPR в условиях, приближенных к физиологическим, например, 10 мМ HEPES pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% Tween-20. Могут быть использованы другие способы, не основанные на SPR, например, для измерения связывания и аффинности.

Информация от тестов на связывание может быть использована для предоставления точного и количественного измерения равновесной константы диссоциации (K_D) и кинетических параметров (например, K_on и K_off) для связывания рецептор-связывающего агента с мишенью. Такие данные могут быть использованы для сравнения различных белков, мишеней и условий. Эта информация также может быть использована для выяснения отношений структура-активность (ОСА). Например, могут быть сопоставлены кинетические и равновесные параметры связывания вариантных белков с параметрами референтного или родительского белка. Могут быть идентифицированы вариантные аминокислоты в данных положениях, которые коррелируют с конкретными параметрами связывания, например, высокой аффинностью и медленной K_off. Эта информация может быть объединена со структурным моделированием (например, с использованием гомологичного моделирования, минимизации энергии или определения структуры при помощи рентгеновской кристаллографии или ЯМР).

Белки, используемые для определения аффинности, могут быть получены в рекомбинантной форме и могут включать метки, пригодные для очистки или иммобилизации, например, метку FLAG, метку myc, метку гемагглютинином, метку His tag или встраивание Fc домена. Внеклеточные домены рецепторных белков (такие как IL-1RI и IL-1RAcP) могут быть получены в рекомбинантной форме путем экспрессии, например, в клетках бактерий или насекомых, например, используя экспрессию бакуловируса в клетках Sf9. Растворимые рецепторные белки могут быть иммобилизированы в системе BIAcore, например, с использованием чипов, содержащих реагенты, которые связываются со своими метками, например, чип, покрытый IgG, специфическим по отношению к домену Fc, или другой меткой.

Тесты на клеточную активность

Способность рецептор-связывающих агентов функционировать в качестве антагонистов рецепторов может быть оценена, например, в тесте, основанном на клетках. Например, возможно оценить ингибирование IL-1RI рецептор-связывающим агентом. Несколько примерных тестов на активность IL-1 описаны в Boraschi et al. и включают тесты на пролиферацию Т-клеток, тесты на продукцию IL-6 и IL-8 и ингибирование притока кальция.

В одном примерном тесте способность рецептор-связывающего агента оценивается по его способности ингибировать высвобождение IL-6 из человеческих фибробластов, стимулированное IL-1β. Ингибирование высвобождения цитокина, стимулированное IL-1β в клетках MRC5, коррелирует со способностью агента ингибировать активность, опосредованную IL-1, in vivo. Детали теста описаны в Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, Ch. 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., 2000. Кратко, человеческие MRC5 фибробласты человека (ATCC#CCL-171, Manassas VA, USA) выращивают до достижения сплошного монослоя в многолуночных планшетах. Клетки обрабатывают титрованными дозами рецептор-связывающего агента и контролями. Клетки затем приводят в контакт с 100 пг/мл IL-1β в присутствии титрованного агента и/или контролей. Клетки отрицательного контроля не стимулируются IL-1β. Количества IL-6, выделенного в каждой группе обработанных клеток, измеряют с использованием набора ИФА IL-6 (например, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA). Контроли, которые могут быть использованы, включают один только буфер, IL-1Ra и антитела к IL-1β.

Эффективность рецептор-связывающего агента также может быть оценена in vivo. Примерный тест описан в Economides et al., Nature Med., 9:47-52 (2003). Кратко, мышам вводили внутрибрюшинно титрованные дозы рецептор-связывающего агента и контроли. Через двадцать четыре часа после инъекции мышам вводили подкожно рекомбинантный человеческий IL-1β в дозе 1 мкг/кг. Через два часа после инъекции IL-1β (пик времени ответа IL-6) мышей умерщвляли, собирали кровь и ее обрабатывали для получения сыворотки. Сывороточные уровни IL-6 определяли в ИФА. Процент ингибирования может быть рассчитан на основе отношения IL-6, определяемого в сыворотке экспериментальных животных, и IL-6, обнаруживаемого в контролях.

Другие примерные тесты на активность IL-1 in vivo описаны в Boraschi et al. и включают тесты на анорексию, гипогликемию и нейтрофилию.

Получение

Рецептор-связывающие агенты могут быть получены путем экспрессии в рекомбинантных клетках хозяина, но также и другими способами, такими как транскрипция и трансляция in vitro и химический синтез.

Для клеточной экспрессии одна или более нуклеиновых кислот (например, кДНК или геномная ДНК), кодирующие рецептор-связывающий агент, могут быть введены в реплицируемый вектор для клонирования или для экспрессии. Различные векторы являются общедоступными. Вектор может быть, например, плазмидой, космидой, вирусным геномом, фагемидом, геномом фага или другой автономно реплицирующейся последовательностью. Соответствующая кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты может быть введена в вектор с использованием разнообразных методик. Например, могут быть сконструированы сайты рестрикционных эндонуклеаз (например, с использованием ПЦР). Затем может быть использовано рестрикционное расщепление и соединение для введения кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты в определенное местоположение. Компоненты вектора, в основном, включают один или более репликаторов, один или более маркерных генов, элемент энхансера, промотор и последовательность терминации транскрипции.

Рецептор-связывающий агент может быть получен рекомбинантным путем, как в изолированном виде, так и путем слияния с одним или более других компонентов, таких как сигнальная последовательность, эпитоп или функциональная группа для очистки, и с меткой. Рецептор-связывающий агент может включать, например, домен pro члена семейства интерлейкинов-1, который впоследствии может быть удален путем протеолитической обработки.

В отношении экспрессии в бактериях, рецептор-связывающий агент может быть получен как с сигнальной последовательностью, так и без нее. Например, он может быть получен внутри клетки, так что он накапливается во внутриклеточных включениях или в растворимой фракции. Он также может быть секретируемым, например, путем добавления прокариотической сигнальной последовательности, например, соответствующей лидерной последовательности, такой как из щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостабильного энтеротоксина II. Примерные бактериальные клетки хозяина для экспрессии включают любой трансформируемый штамм E. coli K-12 (такой как E. coli BL21, C600, ATCC 23724; E. coli HB101 NRRLB-11371, ATCC-33694; E. coli MM294 ATCC-33625; E. coli W3110 ATCC-27325), штаммы B. subtilis, Pseudomonas, и других бацилл. Белки, вырабатываемые в бактериальных системах, будут обычно лишены гликозилирования. Соответственно, в некоторых вариантах воплощения описываемые здесь рецептор-связывающие агенты в значительной степени свободны от гликозилирования, например, свободны от модификаций гликозилирования клеток млекопитающих или других эукариотических клеток.

Рецептор-связывающий агент может быть экспрессирован в клетках хозяина - дрожжах, например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Hanseula или Pichia pastoris. В отношении экспрессии в дрожжах, рецептор-связывающий агент также может продуцироваться внутриклеточно или путем секреции, например, с использованием дрожжевого инвертазного лидера или лидера - альфа-фактора (включая формы Saccharomyces и Kluyveromyces), или лидера - кислой фосфатазы, или глюкоамилазного лидера C.albicans (EP 362179, опубликованный 4 апреля, 1990г.). При экспрессии в клетках млекопитающих для прямой секреции белка могут быть использованы сигнальные последовательности млекопитающих, такие как сигнальные последовательности из секретируемых полипептидов того же или родственных видов, наряду с вирусными секреторными лидерами. Альтернативно, рецептор-связывающий агент может продуцироваться с pro доменом члена семейства интерлейкинов-1, например, pro доменом IL-1α или IL-1β.

Как экспрессирующие, так и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет вектору реплицироваться в одних или более отобранных клетках хозяина. Такие последовательности хорошо известны для множества бактерий, дрожжей и вирусов. Происхождение репликации из плазмиды pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий; происхождение плазмиды 2μ подходит для дрожжей; и различные вирусные происхождения (SV40, полиома, аденовирус, вирус везикулярного стоматита или вирус папилломы крупного рогатого скота) пригодны для клонирующих векторов в клетках млекопитающих.

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат ген селекции или маркер. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (a) придают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например, ампицилину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) дополняют ауксотрофные дефициты (такие как маркер URA3 в Saccharomyces), или (c) снабжают критическими питательными веществами, не доступными из комплексной среды, например, ген, кодирующий D-аланин рацемазу для Bacilli. Также доступны различные маркеры для клеток млекопитающих, например, дигидрофолатредуктаза (DHFR) или тимидинкиназа. DHFR также может быть использована в соединении с клеточной линией (такой как клеточная линия CHO), дефицитной по активности DHFR, приготовляемой и размножаемой, как описано Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980).

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей рецептор-связывающий агент, для направления синтеза мРНК. Примерные промоторы, подходящие для использования с прокариотическим хозяином, включают промоторные системы β-лактамазы и лактозы (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), щелочной фосфатазы, промоторную систему триптофана (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36776) и гибридные промоторы, такие как промотор tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Промоторы для использования в бактериальной системе могут также содержать соответственно расположенную последовательность Шайна-Дальгарно. Также может быть использована система T7 полимеразы для управления экспрессией последовательности, кодирующей нуклеиновую кислоту, находящейся под контролем T7 промотора. См., например, векторы pET (EMD Chemicals, Gibbstown NJ, USA) и клетки хозяина, например, как описано в пользовательском протоколе Novagen TB053, доступному от EMD Chemicals и US 5693489. Например, такие векторы могут быть использованы в комбинации с клетками BL21(DE3) и клетками BL21(DE3) pLysS для получения белка, например, по меньшей мере 0,05, 0,1 или 0,3 мг на мл клеточной культуры. Другие клеточные линии, которые могут быть использованы, включают лизогены DE3 от B834, BLR, HMS174, NovaBlue, включая клетки, несущие плазмиду pLysS.

Примерные промоторы для использования в клетках дрожжей включают промоторы для 3-фосфоглицерат киназы (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) или других гликолитических ферментов (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфат изомераза и пируваткиназа. Другие примерные промоторы дрожжей являются индуцибельными и имеют дополнительное преимущество, состоящее в транскрипции, контролируемой условиями роста. Примеры индуцибельных промоторов включают промоторные участки для алкоголь дегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, металлотионеина и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы.

Экспрессия мРНК, кодирующей рецептор-связывающий агент из векторов в клетках хозяина млекопитающих, может контролироваться, например, промоторами, получаемыми из геномов вирусов, таких как полиомавирус, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и обезьяний вирус 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотор актина или промотор иммуноглобулина и из промоторов теплового шока. Также могут быть использованы системы гетерологичных промоторов, например, промоторы, реагирующие на тетрациклин. См. Urlinger, S., et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968. Транскрипцией также может управлять последовательность-энхансер, локализованная в cis или trans. Примерные последовательности-энхансеры млекопитающих включают последовательности для глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина. Дополнительные примеры включают энхансер SV40 на поздней стороне точки начала репликации (bp 100-270), ранний энхансер промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне точки начала репликации и энхансеры аденовирусов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении 5' или 3' по отношению к кодирующей последовательности рецептор-связывающего агента, однако он предпочтительно располагается со стороны 5' от промотора.

Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках хозяина (дрожжи, грибы, насекомые, растения, животные, человек или ядросодержащие клетки из других многоклеточных организмов), также могут содержать последовательности, необходимые для завершения транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны из 5' и иногда 3' нетранслируемых участков эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти участки содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей рецептор-связывающий агент. Экспрессирующий вектор может также включать одну или более интронных последовательностей.

Рецептор-связывающий агент также может быть экспрессирован в клетках насекомых, например, клетках Sf9 или SF21, например, с использованием системы pFAST-BAC™. Дополнительные примерные бакуловирусные векторы доступны от Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad CA, USA. Рецептор-связывающий агент также может быть экспрессирован в клетках млекопитающих. Например, могут быть применены клеточные линии, происходящие от млекопитающих. Примеры клеточных линий хозяина от млекопитающих включают линии клеток почек обезьяны COS-7 (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L клетки, C127 клетки, 3T3 клетки (ATCC CCL 163), клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa и клеточные линии BHK (ATCC CRL 10), и клеточные линии CV1/EBNA, полученные от линии клеток почек африканской зеленой мартышки CV1 (ATCC CCL 70), как описано McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991). Принятые способы введения ДНК в клетки млекопитающих были описаны (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 1569).

Все еще другие способы, векторы и клетки хозяина, подходящие для адаптации к синтезу рецептор-связывающего агента в рекомбинантных клетках, описаны в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Sambrook et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773).

Если произошла экспрессия в клетке, рецептор-связывающие агенты могут быть выделены из культуральной среды, внутриклеточных включений или клеточных лизатов. Клетки могут быть разрушены разнообразными химическими и физическими способами, такими как замораживание-оттаивание, обработка ультразвуком, механическое разрушение или агенты, лизирующие клетку (например, детергенты).

Рецептор-связывающие агенты могут быть очищены от других клеточных белков или полипептидов, которые могут быть обнаружены в клеточных лизатах или в клеточной среде. Могут быть применены различные способы очистки белка, и такие способы известны в области техники настоящего изобретения и описаны, например, в Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (2010) (ISBN: 1441928332). Примерные методики очистки включают: путем фракционирования на ионообменной колонке; преципитации этанолом; обращенно-фазовой ВЭЖХ; хроматографии на силикагеле или катионообменной смоле, такой как ДЭАЭ; хроматофокусирования, ДСН-ПААГ; преципитации сульфатом аммония; гель-фильтрации с использованием, например, Sephadex G-75; колонок с протеин A Сефарозой для удаления контаминантов, таких как IgG; и аффинных колонок (например, колонки, образующие комплексы с металлами, для связывания форм белка, меченных по эпитопу, и колонки с различными лигандами для связывания любой функциональной группа выделения, которая ассоциирована с рецептор-связывающим агентом). Способы очистки могут включать комбинацию двух различных этапов ионообменной хроматографии, например, катионообменной хроматографии с последующей анионообменной хроматографией или наоборот. Рецептор-связывающие агенты могут быть элюированы с ионообменной смолы разнообразными способами, включая солевые градиенты и/или рН градиенты или этапы. В некоторых вариантах воплощения рецептор-связывающий агент включает функциональную группу очистки (такую как метки эпитопа и держатели аффинности). Такие функциональные группы могут быть использованы для аффинной хроматографии и могут опционально удаляться путем протеолитического расщепления.

Ионообменная хроматография также может быть использована как методика ионообменного разделения. Ионообменная хроматография разделяет молекулы на основе различий между общим зарядом молекул и может быть использована для отделения интактной формы рецептор-связывающих агентов от других форм таких белков.

К матрицам могут быть присоединены анионные или катионные замещающие группы с целью образования анионной или катионной поддержки для хроматографии. Анионообменные заместители включают диэтиламиноэтил (DEAE), четвертичный аминоэтил (QAE) и четвертичные аминогруппы (Q). Катионные заместители включают карбоксиметил (СМ), сульфоэтил (SE), сульфопропил (SP), фосфат (P) и сульфонат (S). Целлюлозные ионообменные смолы, такие как DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 и CM-52, доступны от Whatman Ltd. (Maidstone, Kent, U.K). Также известны SEPHADEX™ и другие перекрестно-связанные ионообменники. Например, DEAE-, QAE-, CM- и SP-SEPHADEX™ и DEAE-, Q-, CM- и S-SEPHAROSE™ и SEPHAROSE™ Fast Flow доступны от Pharmacia AB. Сополимер этиленгликоль метакрилата - производное от DEAE и CM, такой как TOYOPEARL DEAE-650S или M, и TOYOPEARL CM-650S или M доступны от Toso Haas Co. (Philadelphia, PA, USA).

Катионообменная поверхность является ионообменной поверхностью с ковалентно связанными отрицательно заряженными лигандами, и которые, таким образом, имеют свободные катионы в растворе в контакте с поверхностью. Примерные поверхности включают катионообменные смолы, такие как те, в которых ковалентно связанными группами являются карбоксилат или сульфонат. Коммерчески доступные катионообменные смолы включают CMC-целлюлозу, SP-Sephadex™ и Fast S-Sepharose™ (Pharmacia).

Анионообменная поверхность является ионообменной поверхностью с ковалентно связанными положительно заряженными группами, такими как четвертичные аминогруппы. Примерной анионообменной поверхностью является анионообменная смола, такая как DEAE целлюлоза, TMAE, QAE Sephadex™ и Fast Q Sepharose™ (Pharmacia).

Примерная схема очистки рецептор-связывающего агента включает лизис клеток E. coli в лизирующем буфере с последующей глубинной фильтрацией. Материал затем подвергается катионообменной хроматографии (КОХ). КОХ-элюат затем пропускается через анионообменную среду на этапе анионообменной хроматографии (АОХ). Фильтрат АОХ может быть подвергнут этапу доочистки. Материал затем подвергается обработке путем ультрафильтрации/диафильтрации, например, для концентрации или обессоливания материала. Мембраны для ультрафильтрации/диафильтрации могут быть избраны на основании номинальной границы пропускания молекулярного веса («НГПМВ»), таким образом, чтобы сохранить белок в ретенате, при этом позволив материалам с низким молекулярным весом, таким как соли, проходить в фильтрат. На заключительном этапе обмена буфера может быть использован любой буферный раствор или стерильная вода, например, в зависимости от желаемой окончательной рН и проводимости продукта.

Рецептор-связывающий агент может храниться в разнообразных растворах, включая воду, фосфатно-физиологический раствор (ФФР) и забуференные растворы. Примерные забуференные растворы включают ацетат натрия pH 4,5, ацетат натрия pH 4,7, ацетат натрия pH 4,9, ацетат натрия pH 5,1, ацетат натрия pH 5,3, ацетат натрия pH 5,5, сукцинат pH 5,2, сукцинат pH 5,4, сукцинат pH 5,6, сукцинат pH 5,8, гистидин pH 5,7, гистидин pH 6,0, гистидин pH 6,3, гистидин 6,6, фосфат натрия pH 6,5, фосфат натрия pH 6,7, фосфат натрия 7,0, фосфат натрия pH 7,3, фосфат натрия pH 7,7, имидазол pH 6,5, имидазол pH 6,8, имидазол pH 7,2, Трис pH 7,0, Трис pH 7,5, Трис pH 7,7. Забуферивающие агенты могут присутствовать, например, в концентрации приблизительно 1-100 мМ, 5-50 мМ, 10-50 мМ или 5-25 мМ. Раствор далее может включать соль, такую как NaCl (например, 50 мМ, 150 мМ или 250 мМ, и диапазоны между ними), аргинин (например, в приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7,5% и диапазонах между ними), сахарозу (например, в приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7,5%, 8,5%, 10%, 15% и диапазонах между ними) и/или глицерин (например, в приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7,5%, 8,5%, 10%, 15% и диапазонах между ними).

Рецептор-связывающий агент может присутствовать в композиции в количестве по меньшей мере 50 мг, 100 мг, 500 мг, 1 г, 5 г, 10 г или более.

Аналитические способы

Белки клетки-хозяина (БКХ) относятся к белкам в препарате, которые отличны от рецептор-связывающего агента, и, например, являются эндогенными белками клетки-хозяина, из которой был получен рецептор-связывающий агент, как правило, белки E. coli. Предпочтительно, белки клетки хозяина присутствуют в количестве, меньшем чем 10000, 1000, 900, 800 или 700 ppm (parts per million, частей на миллион). БКХ могут быть обнаружены, например, ИФА или другими способами детекции. Например, ИФА может использовать поликлональные антитела к БКХ. Примерный набор доступен от Cygnus Technologies (CN# F410; Southport NC USA). Другой примерный набор использует технологию AlphaScreen (AlphaLisa® E. coli HCP Kit, Product Number AL261 C/F, Perkin Elmer, Waltham MA USA).

Материал, содержащий или потенциально содержащий рецептор-связывающий агент, может быть оценен, например, путем использования высокоэффективной жидкостной хроматографии. Примерные аналитические методики включают слабокатионообменную высокоэффективную жидкостную хроматографию (сКО-ВЭЖХ), эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (Э-ВЭЖХ), обращенно-фазовую жидкостную хроматографию, масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ИЭР МС), масс-спектрометрию с ионизацией турбораспылением, масс-спектрометрию с ионизацией нанораспылением, масс-спектрометрию с ионизацией термораспылением, масс-спектрометрию с ионизацией ультразвуковым распылением, масс-спектрометрию с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-MS) и масс-спектрометрию с лазерной деионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS).

В нескольких вариантах воплощения N-концевой участок рецептор-связывающего агента включает последовательности, идентичные пептидам из N-концевого участка IL-1β, например, пептид APVRS (SEQ ID NO:58). Рекомбинантные клетки (в частности, клетки E. coli), экспрессирующие такие белки, могут продуцировать интактный белок наряду с другими изоформами, включая изоформу des-Ala и изоформу с дополнительным метионином (например, N-концевым по отношению к Ala1). Рецептор-связывающие агенты, которые включают пролин в аминокислотном положении 2 (где N-концевой остаток находится в положении 1), могут быть чувствительными к расщеплению протеазами E. coli, такими как аминопептидаза P, которая обладает специфичностью расщепления для X-PRO. Это расщепление может удалять N-концевую аминокислоту. Например, P03, P04 и P05 имеют пролин в положении 2. Интактные формы P03, P04 и P05 имеют 153 аминокислот в длину и начинаются с аланина, в то время как виды des-Ala имеют в длину 152 аминокислот и начинаются с пролина.

Аналитические методики, такие как те, что указаны выше, могут быть использованы, чтобы провести различие между интактными формами и другими формами, например, видами des-Ala. Примерной аналитической методикой является сКО-ВЭЖХ. Например, P05 может быть оценен с использованием колонки Dionex ProPac® WCX-10 4×250 мм (номер продукта 054993), как описано ниже в Примере 9. Пики сКО-ВЭЖХ могут быть оценены способом C4 обращенно-фазовой (ОФ)-ВЭЖХ в режиме реального времени вместе с масс-спектрометрией. Интактный P05 имеет теоретическую массу: 17700,4 Да и выявляется как 17700,4 Да. Виды des-Ala выявляются как 17629,4 Да, что на 71 Да меньше, чем масса интактного P05. Снижение в массе на 71 Да относится к удалению единичного остатка аланина.

Фармацевтические композиции

Рецептор-связывающий агент может быть разработан в виде фармацевтической композиции. Как правило, композиция является стерильной и включает один или более буферов, фармацевтически приемлемую соль и вспомогательное вещество или стабилизатор. Например, композиция может быть водной композицией. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может быть разработан в соответствии со стандартными способами для биологического препарата. См., например, Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th Ed.., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X); Protein formulation and delivery, McNally and Hastedt (eds.), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007).

Рецептор-связывающий агент для фармацевтической композиции, как правило, на по меньшей мере 10, 20, 50, 70, 80, 90, 95, 98, 99 или 99,99% чистый и, как правило, свободный от человеческих белков. Он может быть единственным белком в композиции или единственным активным белком в композиции. Он также может быть скомбинирован с одним или более других активных белков, например, одним или более других активных белков, например, родственным или неродственным белком. В некоторых вариантах воплощения композиция может содержать рецептор-связывающий агент в концентрации между приблизительно 0,001-10%, например, 0,001-0,1%, 0,01-1% или 0,1-10%.

Соответственно, также здесь охактеризовываются очищенные и изолированные формы описываемых здесь агентов. Термин «изолированный» относится к материалу, который удаляется из своего природного окружения (например, клетки или материалы, из которых получают рецептор-связывающий агент). Фармацевтические композиции могут быть в значительной степени свободны от пирогенных материалов, в значительной степени свободны от нуклеиновых кислот и/или в значительной степени свободны от клеточных ферментов и компонентов, таких как полимеразы, рибосомальные белки и белки шапероны.

Фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемый носитель. В данном контексте «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и подобные, которые являются физиологически совместимыми. «Фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность родительского соединения и не придает никаких нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19), например, соли, аддитивные соли кислот, и соли, добавляющие основание.

В одном варианте воплощения рецептор-связывающий агент разработан в составе с одним или более вспомогательных веществ, таких как хлорид натрия и фосфатный буфер (например, гептагидрат двухосновного фосфата натрия, одноосновный фосфат натрия) и полисорбат. Он может быть предоставлен в, например, забуференном растворе, например, в концентрации приблизительно 5-100, 5-30, 30-50 или 50-100 мг/мл, и может храниться при 2-8°C. Фармацевтические композиции могут также быть в разнообразных других формах. Они включают, например, жидкие, полужидкие и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекции и инфузии), дисперсии или суспензии, и липосомы. Предпочтительная форма может зависеть от намеченного способа введения и терапевтического применения. Композиции для описываемых здесь агентов, как правило, в форме растворов для инъекции и инфузии, или они для топической или глазной доставки (см. ниже).

Фармацевтические композиции, как правило, стерильны и стабильны в условиях производства и хранения. Фармацевтическая композиция также может быть проанализирована для гарантии того, что она соответствует регуляторным и промышленным стандартам для введения. Композиция может быть разработана в составе в качестве эмульсии, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой заказанной структуры, подходящей для высокой концентрации препарата. Стерильные растворы для инъекции могут быть приготовлены путем введения описываемого здесь агента в требуемом количестве в соответствующем растворителе с одним или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, по требованию, с последующей стерилизацией фильтрованием. В основном, дисперсии готовятся путем введения описываемого здесь агента в стерильный носитель, который содержит основную диспергирующую среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов предпочтительными способами приготовления являются высушивание в вакууме и лиофилизация, в результате которых получается описываемый здесь порошок агента плюс любой желаемый ингредиент из предварительно стерильно профильтрованного раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частицы в случае дисперсии или путем использования сурфактантов. Пролонгированная абсорбция композиций, вводимых путем инъекции, может быть сконструирована путем включения агента, который замедляет абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.

Например, рецептор-связывающий агент ассоциирован с полимером, например, с в значительной степени неантигенным полимером, таким как оксид полиалкилена или оксид полиэтилена. В некоторых вариантах воплощения полимер ковалентно присоединен к рецептор-связывающему агенту, например, прямо или непрямо. Пригодные полимеры будут в значительной степени варьировать по весу. Могут быть использованы полимеры, имеющие среднее значение молекулярных весов, варьирующие от приблизительно 200 до 35000 дальтон (или приблизительно от 1000 до приблизительно 15000, и 2000 до приблизительно 12500). Например, рецептор-связывающий агент может быть сконъюгированным с водорастворимым полимером, например, гидрофильным поливиниловым полимером, например, поливиниловым спиртом или поливинилпирроллидоном. Не имеющий ограничительного характера список таких полимеров включает гомополимеры оксида полиалкилена, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиоли, сополимеры того и блок-сополимеры, при условии, что сохранена водорастворимость блок-сополимеров. Дополнительные пригодные сополимеры включают полиоксиалкилены, такие как полиоксиэтилен, полиоксипропилен и блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена (Pluronics); полиметакрилаты; карбомеры; разветвленные и неразветвленные полисахариды, которые включают сахаридные мономеры D-маннозу, D- и L-галактозу, фукозу, фруктозу, D-ксилозу, L-арабинозу, D-глюкуроновую кислоту, сиаловую кислоту, D-галактуроновую кислоту, D-маннуроновую кислоту (например, полиманнуроновую кислоту или альгиновую кислоту), D-глюкозамин, D-галактозамин, D-глюкозу и нейраминовую кислоту, включая гомополисахариды и гетерополисахариды, такие как лактоза, амилопектин, крахмал, гидроксиэтиловый крахмал, амилоза, декстран сульфат, декстран, декстрины, глигоген или полисахаридную единицу кислых мукополисахаридов, например, гиалуроновую кислоту; полимеры сахарных спиртов, такие как полисорбитол и полиманнитол; гепарин или гепаран.

В определенных вариантах воплощения рецептор-связывающий агент может быть приготовлен с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения. Он может быть предоставлен в виде состава контролируемого высвобождения, доставляемого имплантатом или микрокапсулированной доставочной системой. Могут быть использованы биоразрушаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. См., в общем, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Введение

Рецептор-связывающий агент может быть введен субъекту, например, человеческому субъекту, разнообразными способами, такими как внутривенное введение, как болюсная или непрерывная в течение периода времени инфузия, путем внутримышечной, внутримышечной, интраартериальной, интратекальной, интракапсулярной, интраорбитальной, интракардиальной, внутрикожной, внутрибрюшинной, интрасиновиальной, транстрахеальной, подкожной, внутрикожной, внутрисуставной, субкапсулярной, субарахноидальной, интраспинальной, эпидуральной инъекции, интрастернальной инъекии и инфузии. Другие способы введения включают топические (например, кожные или через слизистую оболочку) или ингаляционные (например, интраназальные и интрапульмонарные) пути. Для многих применений путь введения один из: внутривенная инъекция или инфузия, подкожная инъекция или внутримышечная инъекция.

Рецептор-связывающий агент может вводиться в фиксированной дозе или в дозе мг/кг. Он может быть введен внутривенно (ВВ) или подкожно (ПК). Рецептор-связывающий агент может вводиться, например, каждый день, через день, раз в три, четыре или пять дней, каждую неделю, каждые от трех до пяти недель, например, каждую четвертую неделю или раз в месяц.

Фармацевтическая композиция может включать «терапевтически эффективное количество» описываемого здесь агента. Терапевтически эффективное количество агента может варьировать в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и вес субъекта, и способности соединения вызывать желаемый ответ у субъекта, например, исправление по меньшей мере одного параметра нарушения или исправление по меньшей мере одного симптома нарушения (и, необязательно, воздействие любых вводимых дополнительных агентов). Терапевтически эффективное количество также является таким количеством, в котором какие-либо токсические или вредные эффекты композиции перевешиваются терапевтически выгодными эффектами. Рецептор-связывающий агент, как правило, вводится в терапевтически эффективном количестве.

Фармацевтическая композиция может вводиться с использованием медицинских устройств, например, имплантатов, инфузионных насосов, подкожных игл и безыгольных устройств для подкожной инъекции. Устройство может включать, например, одну или более емкостей для хранения фармацевтических композиций и может быть сконфигурировано для доставки единиц доз рецептор-связывающего агента и, необязательно, второго агента. Дозы могут быть фиксированными, т.е. являться физически обособленными единицами, подобранными в качестве единичных дозировок для субъекта, которому предназначено лечение; каждая доза может содержать предопределенное количество рецептор-связывающего агента, рассчитанное так, чтобы вызывать желаемый терапевтический эффект, в ассоциации с фармацевтическим носителем и, необязательно, в ассоциации с другим агентом.

В некоторых вариантах воплощения для лечения описываемого здесь нарушения рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, имеющему нарушение, в количестве и в течение времени, достаточном, чтобы вызвать устойчивое улучшение в по меньшей мере одном показателе, который отражает тяжесть нарушения. Улучшение считается «устойчивым», если субъект демонстрирует улучшение в по меньшей мере двух случаях, разделенных периодом от одной до четырех недель. Степень улучшения может быть определена на основе симптомов, и также может включать вопросники, которые представляются субъекту, такие как вопросники по качеству жизни.

Для определения того, является ли количество и время лечения достаточным, могут быть оценены различные показатели, которые отражают степень заболевания. Значение исходного уровня для избранного показателя или показателей устанавливается путем исследования субъекта перед введением первой дозы рецептор-связывающего агента. Предпочтительно, исследование исходного уровня выполняется в пределах приблизительно 60 дней после введения первой дозы.

Улучшение может быть индуцировано путем повторных введений дозы рецептор-связывающего агента до тех пор, пока субъект не проявит улучшение по сравнению с исходным уровнем для избранного показателя или показателей. При лечении хронических состояний степень улучшения может быть получена путем повторных введений в течение периода по меньшей мере месяца или более, например, в течение одного, двух, трех месяцев или более, или неограниченно. При лечении острого состояния агент может вводиться в период от одной до шести недель, или даже вводиться единичная доза.

Хотя степень заболевания после лечения может оказаться улучшенной в соответствии с одним или более показателей, лечение может быть продолжено в течение неограниченного периода времени на том же уровне или с меньшей дозой или частотой. Лечение также может быть прервано, например, после улучшения или исчезновения симптомов. Лечение, будучи сниженным или прерванным, может возобновиться, если симптомы появятся вновь.

Лечение

Рецептор-связывающий агент, такой как тот, который связывается IL-1RI и который является антагонистом передачи сигнала IL-1, может быть использован для лечения «нарушения, опосредованного IL-1», которое включает любое заболевание или медицинское состояние, которое (i) вызвано, по меньшей мере частично, агонистическим действием IL-1, (ii) связано с повышенными уровнями или активностью сигнального компонента IL-1 (такого как IL-1α, IL-1β или IL-1RI) или повышенным уровнем передачи сигнала IL-1, и/или (iii) улучшается при снижении активности IL-1. Опосредованные IL-1 нарушения включают острые и хронические нарушения, включая аутоиммунные нарушения и воспалительные нарушения. Опосредованные IL-1 нарушения включают системные и несистемные нарушения. Твердо установлено, что IL-1α и IL-1β являются мощными провоспалительными цитокинами, вовлеченными в ответы на инфекцию, наряду с вовлечением в воспалительное заболевание, включая ревматоидный артрит. Повышенная продукция IL-1 наблюдается у пациентов с несколькими аутоиммунными нарушениями, ишемией и различными раками, тем самым вовлекая IL-1 в эти и родственные заболевания.

См. также, в общем, Sims and Smith, The IL-1 family: regulators of immunity, Nature Reviews Immunology, doi:10.1038/nri2691 (2010).

Термин «лечить» относится к введению описываемого здесь агента субъекту, например, пациенту, в количестве, образом и/или способом, имеющих целью улучшить состояние, симптом или параметр, связанный с нарушением, например, описываемым здесь нарушением, или для предотвращения прогрессии нарушения, как в статистически значимой степени, так и в той степени, которая может быть обнаружена специалистом в области техники. Лечение может иметь целью лечить, исцелять, смягчать, облегчать, изменять, вылечивать, улучшать, предоставлять паллиативное лечение, улучшать или воздействовать на нарушение, симптомы нарушения или предрасположенность к нарушению. Эффективное количество, образ или способ могут варьировать в зависимости от субъекта и могут быть приспособлены к субъекту. Примерные субъекты включают людей, приматов и других млекопитающих, не относящихся к человеку. Рецептор-связывающий агент также может даваться профилактически для снижения риска развития нарушения или его симптома.

Опосредованное IL-1 нарушение может быть аутоиммунным нарушением. Примеры опосредованных IL-1 нарушений включают: ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, синдром Бехчета, воспалительное заболевание кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит), астму, псориаз, диабет I типа и другие идентифицированные здесь нарушения. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент также может вводиться субъекту, имеющему такие опосредованные IL-1 аутоиммунные нарушения или имеющему риск таких нарушений. Опосредованное IL-1 нарушение может быть воспалительным нарушением, таким, как описано ниже. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, имеющему такие опосредованные IL-1 воспалительные нарушения, или имеющему риск таких нарушений.

Примерные опосредованные IL-1 нарушения включают:

Ревматоидный артрит и родственные артриты. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения субъекта, имеющего ревматоидный артрит или риск его. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим системным аутоиммунным воспалительным заболеванием, которое поражает синовиальные мембраны в суставах и которое поражает суставной хрящ. Патогенез РА является Т-лимфоцит-зависимым и может включать продукцию аутоантител, известных как ревматоидные факторы. Могут формироваться комплексы из ревматоидного фактора и антигена и накапливаться в суставной жидкости и крови, вызывая инфильтрацию лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов в синовиальную оболочку. Суставы, как правило, поражаются симметрическим образом, однако также может иметь место внесуставное заболевание, например, вызывающее легочной фиброз, васкулит и кожные язвы или синдром Фелти, который проявляется в виде нейтропении, тромбоцитопении и спленомегалии. У пациентов также могут проявляться ревматоидные узлы в области пораженных суставов, перикардит, плеврит, коронарный артерит и интерстициальный пневмонит с легочным фиброзом. Форма IL-1Ra показана для активности РА от умеренной до выраженной. См., например, Cohen, S. et al. Arthritis & Rheumatism 46, 614-24 (2002); Fleischmann, R.M. et al. Arthritis & Rheumatism 48, 927-34 (2003); Nuki, G., et al. Arthritis & Rheumatism 46, 2838-46 (2002); Schiff, M.H. et al. Arthritis & Rheumatism 50, 1752-60 (2004).

Симптомы активного РА включают усталость, отсутствие аппетита, слабое проявление лихорадки, боли в мышцах и суставах и их жесткость. Жесткость мышц и суставов обычно являются наиболее заметными по утрам и после периодов бездействия. Во время обострения суставы становятся красными, припухлыми, болезненными и чувствительными, в основном, как следствие синовита. Шкалы, пригодные для оценки РА и его симптомов, включают Шкалу тяжести ревматоидного артрита (Rheumatoid Arthritis Severity Scale, RASS); Bardwell et al., (2002) Rheumatology 41(1):38-45), специфический для артрита показатель здоровья (SF-36 Arthritis Specific Health Index) (ASHI; Ware et al., (1999) Med. Care. 37(5 Suppl):MS40-50), шкалы измерения воздействия артрита (Arthritis Impact Measurement Scales или Arthritis Impact Measurement Scales 2) (AIMS or AIMS2; Meenan et al. (1992) Arthritis Rheum. 35(1):1-10); Стэндфордский вопросник оценки здоровья (Stanford Health Assessment Questionnaire (HAQ)), HAQII, или модифицированный HAQ (см., например, Pincus et al. (1983) Arthritis Rheum. 26(11):1346-53).

Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, имеющему РА или риск его, чтобы задержать начало и/или исправить один или более из упомянутых выше признаков и симптомов. Субъект может иметь активность РА от умеренной до выраженной. Субъект может быть не отвечающим на терапию ингибитором ФНО (фактор некроза опухолей) (например, терапию ENBREL® (этанерцепт), HUMIRA® (адалимумаб) или REMICADE® (инфликсимаб)); субъект может быть таким, которому ранее вводили ингибитор ФНО; или субъект также может продолжать получать ингибитор ФНО (и быть отвечающим или неотвечающим).

Субъекту также может вводиться метотрексат. Субъекту может вводиться один или более базисных препаратов для лечения ревматоидного артрита (DMARDS - disease modifying anti-rheumatic drugs, базисные препараты для лечения ревматоидного артрита), кортикостероид и/или нестероидный противовоспалительный препарат. Другие препараты, которые могут вводиться совместно с рецептор-связывающим агентом, включают ингибиторы CD28 (например, CTLA4-Ig), ингибиторы RANKL, IFNγ (гамма-интерферон), IL-6, IL-8 и IL-17. Ингибиторы включают антитела к таким медиаторам, растворимые рецепторы, специфичные по отношению к таким медиаторам, и/или антитела к таким медиаторам.

Ювенильный хронический артрит. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения ювенильного хронического артрита, например, у субъекта моложе 21, 18, 17, 16, 15 или 14 лет. Ювенильный хронический артрит напоминает РА в нескольких аспектах. Субъекты могут быть положительными на ревматоидный фактор. Субъекты могут иметь олигоартикулярные, полиартикулярные или системные формы данного заболевания. Артрит может вызывать неподвижность сустава и запаздывающее развитие, и также может приводить к хроническому переднему увеиту и системному амилоидозу. Рецептор-связывающий агент может быть использован для замедления развития или для улучшения одного или более таких симптомов.

Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения ювенильного идиопатического артрита, включая ювенильный идиопатический артрит с системным началом (ЮИА-СН). Субъекты могут иметь предшествующее неудавшееся лечение кортикостероидами, или им может требоваться лечение кортикостероидами в дозе, равной или превышающей 0,3 мг/кг. См., например, Quartier et al. (2011) Ann Rheum Dis. 70(5):747-54.

Другие ревматические нарушения. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент также может быть использован для лечения других ревматических нарушений, включая склеродерму, системную красную волчанку, подагру, остеоартрит, ревматическую полимиалгию, псориатический артрит и хронический артрит Лайма, воспаление скелетной мышцы и других мышц, включая дерматомиозит, миозит с включенными тельцами, полимиозит и лимфангиолеймиоматоз, пирогенный синдром артрита, педиатрический грануломатозный артрит (ПГА)/синдром Блау и другие обсуждаемые здесь ревматические нарушения.

Рецептор-связывающий агент может быть использован метаболических ревматических нарушений, например, нарушений, ассоциированных с гиперурикемией, например, подагры, включая хроническую острую подагру, и другие артропатии, обусловленные кристаллами. Агент может быть использован для лечения вызванных лекарствами вспышек, связанных с подагрой, включая, например, вспышки, вызванные ингибиторами ксантиноксидазы, уратоксидазы или агентами, способствующими выведению мочевой кислоты. При подагре кристаллы мочевой кислоты могут активировать инфламмасому и запускать высвобождение IL-1β.

Спондилоартропатии. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения спондилоартропатий, которые включают такие нарушения, как анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера, артрит, ассоциированный с воспалительным заболеванием кишечника, спондилит, ассоциированный с псориазом, спондилоартропатию с ювенильным началом и недифференцированную спондилоартропатию. Спондилоартропатии часто ассоциированы с геном HLA-B27. Субъекты могут не иметь ревматоидного фактора и могут демонстрировать сарколеит со спондилитом и воспалительным асимметрическим артритом, или без этого. Субъекты также могут иметь глазное воспаление (см. ниже).

Склеродерма. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения склеродермы или системного склероза. Склеродерма характеризуется затвердеванием кожи, которое может иметь системную локализацию. Также могут присутствовать сосудистые поражения и повреждения эндотелиальных клеток в микроваскулатуре. Субъекты могут демонстрировать инфильтраты мононуклеарными клетками в кожных поражениях и иметь антинуклеарные антитела. Другие органы, которые демонстрируют патогенез, могут включать: желудочно-кишечный тракт, в котором может наблюдаться атрофия гладких мышц и фиброз, приводящие в результате к аномальной перистальтике/подвижности; почки, которые могут иметь концентрическую субэндотелиальную пролиферацию интимы, поражающую малые дугообразные и междольковые артерии со сниженным в результате почечным кортикальным кровотоком, и которая может вызывать протеинурию, азотемию и гипертензию; скелетные мышцы, что может включать атрофию, интерстициальный фиброз, воспаление, легкие, интерстициальный пневмонит и интерстициальный фиброз; и сердце, которое может демонстрировать, например, некроз полосы сокращения и рубцевание/фиброз. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может быть введен субъекту, имеющему склеродерму или риск того, для улучшения одного или более из вышеуказанных признаков и симптомов.

Синдром Шегрена. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения синдрома Шегрена. Синдром Шегрена характеризуется обусловленным иммунной системой воспалением и последующей функциональной деструкцией слезных желез и слюнных желез. Данное заболевание может быть ассоциировано или сопровождаться воспалительными заболеваниями соединительных тканей. Заболевание ассоциировано с выработкой антитела против антигенов Ro и La, оба из которых являются комплексами малой РНК-белка. Поражения в результате могут приводить к сухому кератоконъюнктивиту, ксеростомии, с другими манифестациями или ассоциациями, включая билиарный цирроз, периферическую или сенсорную невропатию и пальпируемую пурпуру. Лечение глазных нарушений, ассоциированных с Шегреном, также обсуждается ниже.

Тиреодные нарушения. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения тиреодного нарушения. Примерные тиреодные нарушения включают болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитарный тиреоидит и атрофический тиреоидит, и являются результатом аутоиммунного ответа против антигенов щитовидной железы с продукцией антител, которые реагируют с белками, присутствующими в щитовидной железе и часто являющимися специфичными для щитовидной железы. Доступны экспериментальные модели, включая спонтанные модели: крысы (крысы BUF и BB) и куры (линия курей с ожирением) и индуцибельные модели, создаваемые иммунизацией животных тиреоглобулином, тиреодным микросомальным антигеном (тиреоидная пероксидаза).

Диабетические и метаболические нарушения. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения диабетического нарушения, такого как диабет с ювенильным началом (включая аутоиммунный сахарный диабет и инсулин-зависимые типы диабета) и диабет зрелого возраста (включая инсулин-независимые типы диабета и диабет, опосредованный ожирением), диабет I типа и диабет II типа. Например, сахарный диабет I типа или инсулин-зависимый диабет ассоциирован с аутоиммунной деструкцией островковых клеток поджелудочной железы, вызванной аутоантителами и аутореактивными Т-клетками. Кроме того, снижение активности IL-1β может улучшить контроль глюкозы и функцию бета-клеток и может быть использовано для лечения диабета II типа. См., например, Owyang et al. Endocrinology. 2010; 151(6):2515-27. Например, в некоторых вариантах воплощения описываемый здесь рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, которому не вводится инсулин, например, субъект не является инсулин-зависимым. Например, субъект может быть пред-диабетическим. Субъект может иметь нарушенную толерантность к глюкозе либо к глюкозе натощак. Субъект может иметь ожирение или иметь индекс массы тела выше 23, 25, 30, 35 или 40 кг/м². Субъект может быть инсулин-резистентным и/или характеризоваться гипергликемией или гиперинсулинемией. Субъект может иметь риск прогрессии до диабета II типа. См. также Larsen, et al. (2007) NEJM 356:1517-26 и Larsen, et al. (2009). Diabetes Care 32:1663-8. В некоторых вариантах воплощения субъект имеет глюкозу в плазме натощак более чем 6,1, 6,5, 7 или 8 ммоль/л. В некоторых вариантах воплощения субъект имеет уровень A1C больше чем 5,5; 5,7; 6; 6,4; 7; 7,5 или 8%.

В некоторых вариантах воплощения субъекту вводится секретагог инсулина, например, такой как сульфонмочевина (например, хлорпропамид, толазамид, ацетогексамид, толбутамид, глибурид, глимепирид, глипизид) и/или меглитиниды (например, репаглинид, натеглинид), которые стимулируют секрецию инсулина. Субъекту также может вводиться бигуанид (например, метформин). Рецептор-связывающий агент может вводиться для снижения потери и/или повреждения панкреатических бета-клеток.

В некоторых вариантах воплощения субъект является гетерозиготным или гомозиготным по С аллели rs4251961, расположенной вблизи 5’ гена IL1RN.

Лечение рецептор-связывающим агентом включает улучшение или предотвращение ухудшения вторичных состояний, ассоциированных с диабетом, таких как диабетическая ретинопатия, отторжение почечного трансплантата у диабетических пациентов и почечная недостаточность, которая сама по себе может быть ассоциирована с протеинурией и гипертензией.

Желудочно-кишечные нарушения. Описываемые здесь рецептор-связывающие агенты могут быть использованы для лечения воспалительного желудочно-кишечного нарушения, включая, например, глютеновую болезнь, болезнь Крона, язвенный колит, идиопатический парез желудка, панкреатит, включая хронический панкреатит, острый панкреатит, воспалительное заболевание кишечника и язвы, включая язвы желудка и двенадцатиперстной кишки.

Легочные нарушения. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения легочного заболевания, опосредованного IL-1. Примерные легочные заболевания, которые можно лечить, включают хроническое обструктивное заболевание легких (например, эмфизема и хронический бронхит), легочный альвеолярный протеиноз, индуцированную блеомицином пневмопатию и фиброз, легочный фиброз, включая идиопатический легочный фиброз и легочный фиброз, индуцированный облучением, легочный саркоидоз, кистозный фиброз, накопление коллагена в легких, синдром острой дыхательной недостаточности, бронхолегочную дисплазию (БЛД), хронические обструктивные заболевания легких и хроническую фибротическую болезнь легких у недоношенных младенцев. Кроме того, описываемые здесь рецептор-связывающие агенты могут быть использованы для лечения профессиональных заболеваний легких, включая асбестоз, пневмокониоз шахтеров, силикоз или подобные состояния, ассоциированные с продолжительной экспозицией к мелким частицам. Воспалительное и фибротическое легочное заболевание, включая эозинофильную пневмонию, идиопатический легочный фиброз и пневмонит гиперчувствительности, может вовлекать неправильно регулированный иммуновоспалительный ответ, который можно лечить, используя рецептор-связывающий агент.

Саркоидоз является состоянием неизвестной этиологии, которое характеризуется присутствием эпителиоидных гранулом в почти каждой ткани организма; вовлечение легких является наиболее распространенным. Патогенез вовлекает персистенцию активированных макрофагов и лимфоидных клеток в местах заболевания с последующим хроническим последствием, проистекающим в результате локального и системного высвобождения активных продуктов, высвобождаемых этими типами клеток.

Сердечно-сосудистые нарушения. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения сердечно-сосудистого нарушения или повреждения, такого как аневризма аорты, острый коронарный синдром, артерии, окклюзия сосуда, включая окклюзию церебральной артериит, осложнения коронарного шунтирования, ишемическое/реперфузионное повреждение, заболевание сердца, включая атеросклеротическую болезнь сердца, миокардит, включая хронический аутоиммунный миокардит и вирусный миокардит, сердечная недостаточность, включая хроническую сердечную недостаточность, застойную сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, рестеноз и/или атеросклероз после операции на сердце или после ангиопластических процедур по установке баллонного катетера в каротидную артерию, бессимптомная ишемия миокарда, насосная дисфункция левого желудочка, постимплантационные осложнения вспомогательных устройств левого желудочка, симптом Рейно, тромбофлебит, васкулит, включая васкулит Кавасаки, веноокклюзивная болезнь, гигантоклеточный артериит, грануломатоз Вегенера и пурпура Шенлейна-Геноха. Рецептор-связывающий агент также может быть предоставлен профилактически, например, для снижения риска такого сердечно-сосудистого нарушения. В некоторых вариантах воплощения рецептор-связывающий агент вводится пациенту для лечения атеросклероза или уменьшения риска.

Передача сигнала, опосредованная IL-1, активируется острым инфарктом миокарда и может инициировать апоптотическую гибель клеток в периинфарктных миокардиальных клетках, расширяя размеры зоны инфаркта. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может быть введен для уменьшения повреждения, вызванного инфарктом миокарда. Например, рецептор-связывающий агент может быть введен субъекту, который имеет риск инфаркта миокарда, или субъекту, которые пережил инфаркт миокарда, в частности, острый инфаркт миокарда, например, в течение последних 2, 4, 6, 12, 24 или 48 часов. Агент может вводиться в комбинации с другими агентами, включая, например, гепарин или аспирин.

Рецептор-связывающий агент также может быть использован для лечения инсульта, субарахноидального кровоизлияния, травмы головы или травмы головного мозга и/или воспаления, ассоциированного с сердечно-сосудистым нарушением. Например, повышенные уровни IL-1β имеют своим последствием нейровоспаление, ассоциированное с инсультом и повреждением мозга (Rothwell, N. J., et al., TINS 23(12):618-625, 2000). Рецептор-связывающий агент может вводиться для снижения такого воспаления и другого воспаления, ассоциированного с ишемией и/или гипоксией. Кроме того, рецептор-связывающий агент также может предоставляться профилактически, например, для снижения риска таких нарушений и/или воспаления, ассоциированного с такими нарушениями. Например, рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, который имеет риск инсульта, ишемического события или геморрагического события (такого как субарахноидальное кровоизлияние), или субъекту, который пережил инсульт, ишемическое событие, другое сердечно-сосудистое событие или геморрагическое событие (такое как субарахноидальное кровоизлияние), в течение последних 2, 4, 6, 12, 24 или 48 часов.

Мочеполовые и почечные нарушения. Нарушения мочеполовой системы также можно лечить описываемым здесь рецептор-связывающим агентом. Такие нарушения включают гломерулонефрит, включая аутоиммунный гломерулонефрит, гломерулонефрит, вызванный экспозицией к токсинам, или гломерулонефрит, вторичный по отношению к инфекциям гемолитическими стрептококками или другими инфекционными агентами. Обусловленные иммунной системой почечные заболевания, включая гломерулонефрит и тубулоинтерстициальный нефрит, являются результатом обусловленного антителами или Т-лимфоцитами повреждения почечной ткани, как напрямую в результате продукции аутореактивных антител или Т-клеток против почечных антигенов, так и непрямо, в результате отложения в почке антител и/или иммунных комплексов, реактивных по отношению к другим, непочечным антигенам. Таким образом, другие заболевания, обусловленные иммунной системой, которые в результате приводят к образованию иммунных комплексов, также как непрямое последствие могут вызывать обусловленное иммунной системой заболевание почек. Как прямые, так и непрямые иммунные механизмы приводят в результате к воспалительному ответу, который продуцирует/индуцирует развитие повреждения в почечных тканях с получением в результате нарушения функции органа и, в некоторых случаях, к почечной недостаточности. В патогенез нарушений могут быть вовлечены как гуморальные, так и клеточные иммунные механизмы.

Рецептор-связывающий агент также может быть использован для лечения уремического синдрома и его клинических осложнений (например, почечной недостаточности, анемии и гипертрофической кардиомиопатии), включая уремический синдром, ассоциированный с экспозицией к токсинам окружающей среды, лекарствам, или другие причины. Также можно лечить осложнения, которые развиваются из воспаления стенки желчного пузыря, приводящего к изменению абсорбционной функции. В такие осложнения включены холелитиаз (камни в желчном пузыре) и холедохолитиаз (камни в желчном протоке) и рецидив холелитиаза и холедохолитиаза. Дальнейшими состояниями, которые можно лечить, являются осложнения гемодиализа; состояния простаты, включая доброкачественную гипертрофию простаты, небактериальный простатит и хронический простатит; и осложнения гемодиализа. Рецептор-связывающий агент также может быть использован для лечения состояний хронической боли, таких как хроническая тазовая боль, включая синдром хронического простатита/тазовой боли и постгерпетическую боль.

Гематологические и онкологические нарушения. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения различных форм рака, включая острую миелогенную лейкемию, хроническую миелогенную лейкемию, назофарингеальную карциному, положительную на вирус Эпштейна-Барр, глиому, раки прямой кишки, желудка, простаты, почечных клеток, шейки матки и яичника, рак легкого (мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого), включая ассоциированные с раком кахексию, усталость, астению, паранеопластический синдром кахексии и гиперкальцемию. См., например, Voronov et al. (2003) PNAS 100:2645-2650. Также можно лечить солидные опухоли, включая саркому, остеосаркому и карциному, такую как аденокарцинома (например, рак молочной железы) и плоскоклеточная карцинома. В отношении роли IL-1β в конкретных опухолях см., например, Krelin et al. (2007) Cancer Res. 67:1062-1071. Дополнительные раки включают рак пищевода, рак желудка, карциному желчного пузыря, лейкемию, включая острую миелогенную лейкемию, хроническую миелогенную лейкемию, миелоидную лейкемию, хроническую или острую лимфобластную лейкемию и волосатоклеточную лейкемию. Рецептор-связывающими агентами могут лечиться другие злокачественные новообразования с инвазивным метастатическим потенциалом, включая множественную миелому. См., например, Lust et al. (2009) Mayo Clin Proc 84(2):114-122.

Рецептор-связывающий агент также может быть использован для лечения анемий и гематологических нарушений, включая хроническую идиопатическую нейтропению, анемию хронического заболевания, апластическую анемию, включая апластическую анемию Фанкони; идиопатическую тромоцитопеническую пурпуру (ИТП); тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, миелодиспластические синдромы (включая рефрактерную анемию, рефрактерную анемию с кольцевидными сидеробластами, рефрактерную анемию с избытком бластов, рефрактерную анемию с избытком бластов в состоянии трансформации); миелофиброз/миелоидную дисплазию; и серповидноклеточный вазоокклюзивный криз.

Аутоиммунная гемолитическая анемия, иммунная панцитопения и пароксизмальная ночная гемоглобинурия могут явиться результатом продукции антител, реагирующих с антигенами, экспрессированными на поверхности красных кровяных клеток (и, в некоторых случаях, других клеток крови, включая также и тромбоциты), и является следствием удаления этих покрытых антигеном клеток путем комплемент-опосредованного лизиса и/или механизмов, обусловленных антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (АЗКЦ)/Fc-рецептором. При аутоиммунной тромбоцитопении, включая тромбоцитопеническую пурпуру и обусловленную иммунной системой тромбоцитопению в других клинических ситуациях, деструкция/удаление тромбоцитов происходит в результате присоединения антител или комплемента к тромбоцитам и последующего удаления путем механизмов, опосредованных лизисом комплементом, АЗКЦ или FC-рецептором.

Рецептор-связывающий агент также может вводиться субъектам, имеющим риск различных лимфопролиферативных нарушений, включая аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЛПС), хроническую лимфобластную лейкемию, волосатоклеточную лейкемию, хроническую лимфатическую лейкемию, периферическую Т-клеточную лимфому, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфому из клеток зоны мантии, фолликулярную лимфому, лимфому Беркита, Т-клеточную лимфому, позитивную на вирус Эпштейна-Барр, гистиоцитарную лимфому, болезнь Ходжкина, диффузную агрессивную лимфому, острые лимфатические лейкемии, Т-гамма лимфопролиферативное заболевание, кожную В-клеточную лимфому, кожную Т-клеточную лимфому (т.е. грибовидный микоз) и синдром Сезари.

Нарушения печени. Раскрываемые здесь рецептор-связывающие агенты также пригодны для лечения состояний печени, таких как гепатит, включая острый алкогольный гепатит, острый лекарственный или вирусный гепатит, гепатит А, В и С, склерозирующий холангит, печеночный синусоидный эпителий и воспаление печени из-за неизвестных причин.

Нарушения слуха. Рецептор-связывающие агенты также могут быть использованы для лечения нарушений, которые затрагивают потерю слуха и которые ассоциированы с аномальной экспрессией IL-1. Такие нарушения включают ассоциированную с улитковым нервом потерю слуха, которая, как считается, является результатом аутоиммунного процесса, например, аутоиммунная потеря слуха, синдром Меньера и холестеатома, нарушение среднего уха, часто ассоциированное с потерей слуха.

Костные нарушения. Неартритные нарушения костей и суставов также лечатся описываемыми здесь рецептор-связывающими агентами. Они охватывают воспалительные нарушения кости или сустава, нарушения остеокластов, приводящие в потере кости, такие как, включая, но не ограничиваясь ими, остеопороз, включая постменопаузный остеопороз, остеоартрит, периодонтит, приводящий в результате к расшатыванию или потере зубов, и ослабление протеза после замены сустава (как правило, ассоциированное с воспалительным ответом на продукты износа), например, остеолиз ортопедического имплантата.

Амилоидные нарушения. Далее, описываемые здесь рецептор-связывающие агенты могут быть использованы для лечения первичного амилоидоза и вторичного амилоидоза, характерного для различных состояний, включая болезнь Альцгеймера, вторичного реактивного амилоидоза; синдрома Дауна; амилоидоза, ассоциированного с диализом. Кроме того, рецептор-связывающие агенты могут быть использованы для лечения амиотрофического бокового склероза (АБС), болезни Хантингтона и болезни Паркинсона. Эти заболевания могут также включать образование агрегатов и амилоидов, которые запускают воспалительные ответы.

Неврологические нарушения. Рецептор-связывающие агенты также могут быть использованы для лечения нейровоспалительных и дегенеративных заболеваний центральной и периферической нервных систем, включая множественный склероз; идиопатическую демиелинизирующую полинейропатию или синдром Гийена-Барре; и хроническую демиелинизирующую полинейропатию. Как считается, эти нарушения имеют иммунную основу и приводят в результате к демиелинизации нервов, как результату, вызванного напрямую повреждением олигодендроцитов или миелина. При множественном склерозе индукция и заболевания вовлекают Т-лимфоциты. Множественный склероз имеет либо возвратно-ремиттирующее течение, либо хроническое прогрессирующее течение. Поражения содержат инфильтраты из микроглиальных клеток, опосредованных преимущественно Т-клетками, и инфильтрирующих макрофагов; CD4⁺ T-лимфоциты являются преимущественным типом клеток в повреждениях. Механизм смерти олигодендроцитных клеток и последующей демиелинизации неизвестен, однако он, по-видимому, приводится в движение Т-лимфоцитами.

Миопатии. Рецептор-связывающие агенты могут быть использованы для лечения миопатий, ассоциированных с воспалением и аутоиммунитетом. Идиопатические воспалительные миопатии, включающие дерматомиозит, полимиозит и другие, являются нарушениями хронического мышечного воспаления неизвестной этиологии, что в результате приводит к мышечной слабости. Мышечное повреждение/воспаление часто является симметричным и прогрессирующим. С большинством форм ассоциированы аутоантитела. Эти антитела, специфичные к миозиту, направлены против функции компонентов, белков и РНК, задействованных в синтезе белка, и ингибируют их.

Васкулитные нарушения. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения васкулитного нарушения, например, системного васкулита. Системный васкулит включает заболевания, в которых первичным поражением является воспаление и последующее повреждение кровеносных сосудов, которое в результате приводит к ишемии/некрозу/дегенерации тканей, снабжаемых пораженными сосудами, и в некоторых случаях возможной дисфункцией конечного органа. Васкулиты также могут иметь место как вторичное повреждение или последствие других заболеваний, обусловленных иммунной системой/воспалением, таких как ревматоидный артрит, системный склероз и т.п., в частности, при заболеваниях, также ассоциированных с образованием иммунных комплексов.

Заболевания группы первичных системных васкулитов включают: системный некрозирующий васкулит: нодозный полиартерит, аллергический ангиит и грануломатоз, полиангиит; грануломатоз Вегенера; лимфоматодный грануломатоз; и гигантоклеточный артерит. Различные васкулиты включают: слизисто-кожный лимфоузелковый синдром (СКЛС или болезнь Кавасаки), изолированный васкулит ЦНС, болезнь Бехчета, облитерирующий тромбоангиит (болезнь Бюргера) и кожный некротизирующий венулит. Считается, что патогенетические механизмы этих васкулитных нарушений связаны, в первую очередь, с отложением иммуноглобулиновых комплексов в стенке сосуда и последующей индукцией воспалительного ответа либо через АЗКЦ, активацию комплемента, либо путем обоих механизмов.

CAPS (криопирин-связанные периодические синдромы). Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения нарушения CAPS, т.е. CIAS1-ассоциированных периодических синдромов. CAPS включает три генетических синдрома: мультисистемное воспалительное заболевание неонатального возраста (NOMID), синдром Макла-Уэлса (MWS) и семейный аутовоспалительный холодовый синдром (FCAS). (Hoffman et al. 2001 Naure 29:301-305; Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203; Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348). CAPS наследуются по аутосомальному доминантному типу по спорадическому или семейному принципу. CIAS1 кодирует NALP3, белковый компонент «инфламмасомы», внутриклеточного ферментного комплекса, который регулирует активность каспазы 1. Мутации в CIAS1 приводят к увеличенной продукции IL-1 и многочисленным патологическим последствиям (Aksentijevich et al. 2002, выше). IL-1 в значительной степени индуцирует продукцию реактантов острой фазы в печени, таких как С-реактивный белок (ЦРБ) и сывороточный амилоид А (САА).

Нарушения CAPS имеют общие клинические характеристики и представлены спектром клинической тяжести. NOMID является наиболее тяжело инвалидизирующим, MWS несколько менее инвалидизирующий, и FCAS является наименее тяжелым. Нарушения CAPS имеют несколько перекрывающихся характеристик, и субъекты могут иметь уникальные сочетания признаков и симптомов. Характеристики, общие для всех этих состояний, включают лихорадки, уртрикаро-подобную сыпь, артрит или артралгию, миалгию, дискомфорт и конъюнктивит.

При NOMID хронический асептический менингит может приводить к умственной отсталости, и эти пациенты могут также страдать от обезображивающего и инвалидизирующего разрастания кости в эпифизах и в коленной чашечке. Эти пациенты также могут страдать от слепоты из-за атрофии зрительного нерва, являющейся результатом повышенного внутричерепного давления. MWS и NOMID обычно ассоциированы с тяжелым воспалением, которое может включать слуховую систему, оболочки головного мозга и суставы. Эти пациенты могут страдать ежедневными лихорадками с высокими пиками и хронической сыпью, которая часто меняет распространение и интенсивность. Пациенты могут страдать от потери слуха или глухоты. Часто наблюдаются конъюнктивит и отек зрительного нерва. Может развиваться амилоидоз и приводить к почечной недостаточности из-за хронического воспаления и избыточной продукции реактантов острой фазы (в частности, СМ). Рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, имеющему NOMID, MWS или FCAS или диагностированному как имеющему генотип, ассоциированный с NOMID, MWS или FCAS. Кроме того, рецептор-связывающий агент может быть введен субъекту, имеющему TRAPS (периодический синдром, связанный с фактором некроза опухолей (TNF receptor associated periodic syndrome).

Дерматологические нарушения. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения дерматологического нарушения, такого как воспалительное дерматологическое нарушение или аутоиммунное или обусловленное иммунной системой кожное заболевание. Примерным нарушением является псориаз. Дополнительное аутоиммунное или обусловленное иммунной системой заболевание, включая буллезные кожные заболевания, мультиформную эритему и контактный дерматит, опосредованы аутоантителами, генезис которых является Т-лимфоцит-зависимым. Псориаз является воспалительным заболеванием, опосредованным Т-лимфоцитами. Повреждения содержат инфильтраты из Т-лимфоцитов, макрофагов и клеток, процессирующих антиген, и некоторого количества нейтрофилов.

Дополнительными нарушениями кожи и слизистых мембран, которые могут быть подвергнуты лечению, включают акантолитические заболевания, включая болезнь Дарье, фолликулярный дискератоз и обыкновенную пузырчатку. Дальнейшие дополнительные нарушения включают: угри, розовые угри, гнездную алопецию, афтозный стоматит, буллезный пемфигоид, ожоги, экзему, эритему, включая мультиформную эритему и буллезную мультиформную эритему (синдром Стивенса-Джонсона), воспалительное кожное заболевание, красный плоский лишай, IgA зависимое линейное буллезное заболевание (хронический буллезный дерматоз у детей), утрата кожной эластичности, поверхностные язвы слизистой оболочки, включая язвы желудка, нейтрофильный дерматит (синдром Свита), дерматомиозит, красный волосистый питириаз, псориаз, гангренозную пиодермию, мультицентрический ретикулогистиоцитоз и токсический эпидермальный некролизис. Другие связанные с кожей состояния, которые можно лечить рецептор-связывающими агентами, включают герпетиформный дерматит (болезнь Дюринга), атопический дерматит, контактный дерматит и крапивницу (включая хроническую идиопатическую крапивницу).

Аллергические нарушения. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения аллергического нарушения, такого как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевая гиперчувствительность, аллергический конъюнктивит (см. также ниже) и крапивница. Эти заболевания часто опосредованы воспалением, индуцированным Т-лимфоцитами, воспалением, опосредованным IgE, или обоими.

Астма является хроническим состоянием, вовлекающим дыхательную систему, при котором дыхательные пути время от времени сжимаются, становятся воспаленными и выстланными избыточным количеством слизи, часто в ответ на один или более спусковых механизмов. Эпизоды могут запускаться такими вещами, как экспозиция к стимулятору (или аллергену) окружающей среды, такому как холодный воздух, теплый воздух, влажный воздух, физическое упражнение или усилие, эмоциональный стресс и вирусное заболевание. Сужение дыхательных путей вызывает симптомы, такие как хрипы, одышка, сдавленность в груди и кашель. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения астмы и для такого лечения может быть включен в состав для топической или легочной доставки, или может доставляться парентерально.

Трансплантация. Рецептор-связывающий агент может быть введен субъекту, которому собираются проводить трансплантацию или проводят трансплантацию, или он восстанавливается после трансплантации. Заболевания, связанные с трансплантацией, включая отторжение трансплантата и заболевание трансплантат-против-хозяина (ЗТПХ), являются зависимыми от Т-лимфоцитов; ингибирование функции Т-лимфоцитов улучшает состояние. Пересадка роговицы может быть связана с неоваскуляризацией, которая может быть облегчена путем лечения рецептор-связывающим агентом. Рецептор-связывающий агент также может быть использован для лечения осложнений, проистекающих от пересадки солидных органов, таких как сердце, печень, кожа, почки, легкие (облитерация дыхательных путей легочного трансплантата) или других трансплантатов, включая трансплантаты костного мозга.

Инфекционные заболевания. Описываемые здесь рецептор-связывающие агенты применимы для лечения протозойных заболеваний, включая малярию и шистосомиаз, и для лечения узловатой лепрозной эритемы; бактериального или вирусного менингита; туберкулеза, включая туберкулез легких; и пневмонита - вторичного по отношению к бактериальной или вирусной инфекции, включая гриппозную инфекцию и инфекционный мононуклеоз.

Также при помощи рецептор-связывающего агента могут лечиться врожденные синдромы периодической лихорадки, включая семейную средиземноморскую лихорадку, синдром гипериммуноглобулина D и периодической лихорадки и периодические синдромы, ассоциированные с рецептором ФНО (TRAPS), и болезнь Стилла у взрослых, синдром Шницлера и фиброзирующий альвеолит.

В некоторых вариантах воплощения рецептор-связывающий агент вводится субъекту для снижения активности или экспрессии IL-6 у субъекта. Например, субъект может иметь нарушение, ассоциированное или опосредованное, по меньшей мере частично, IL-6.

Глазные нарушения и глазная доставка

Описываемые здесь рецептор-связывающие агенты могут быть использованы для лечения глазных нарушений, включая глазные нарушения, поражающие поверхность глаза, воспалительные глазные нарушения и глазные нарушения, опосредованные, по меньшей мере частично, аутоиммунной реакцией.

В некоторых вариантах воплощения глазное нарушение является нарушением сухого глаза, которое поражает поверхность глаза. Это нарушение включает состояния, также называемые сухим кератоконъюнктивитом, сухим кератитом, синдромом сухого глаза, ксерофтальмией, нарушением слезной пленки, сниженной слезной выработкой, недостаточностью слезной жидкости и дисфункцией мейбомиевой железы. Сухой глаз может включать формы, ассоциированные с синдромом Шергена (СШ), например, сухой кератоконъюнктивит, ассоциированный с синдромом Шергена, однако также формы, которые не являются ассоциированными, например, сухой кератоконъюнктивит, не ассоциированный с синдромом Шергена. Пациент может иметь или может не иметь других проявлений системного аутоиммунного нарушения. IL-1 задействован в патогенезе нарушений сухого глаза. См., например, Enriquez de Salamanca et al. (2010), Mol. Vis. 16:862-873.

Субъекты, имеющие синдром сухого глаза, могут демонстрировать воспаление сухого глаза и могут иметь ощущения царапанья, острой боли, зуда, жжения или давления, раздражение, боль и красноту. Сухой глаз может быть ассоциирован как с избыточным слезотечением, так и наоборот, с недостаточной слезной продукцией. Рецептор-связывающий агент может вводиться таким субъектам для улучшения или для предотвращения развития или ухудшения одного или более таких синдромов. Рецептор-связывающий агент также может быть использован для уменьшения боли, например, глазной боли, такой как вызванной воспалением нерва, у субъекта, испытывающего такую боль.

В некоторых вариантах воплощения глазным нарушением является глазное нарушение, ассоциированное с системным аутоиммунным нарушением (таким как синдром Шергена и ревматоидный артрит), или с нарушением, ассоциированным с IL-1 или с другим членом семейства цитокинов IL-1. Пациент может иметь или может не иметь системного аутоиммунного нарушения или других проявлений системного аутоиммунного нарушения.

Рецептор-связывающий агент также может быть использован для лечения других нарушений, поражающих поверхность глаза, такую как роговицу. Такие нарушения включают воспалительные состояния роговицы глаза, корнеальную неоваскуляризацию, кератит, включая периферический язвенный кератит и микробный кератит. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения субъекта, подвергающегося лечению раны роговицы (например, субъекта, имеющего рану роговицы). Рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, которому собираются проводить процедуру, затрагивающую глаз, или он восстанавливается после процедуры, затрагивающей глаз, например, пересадки роговицы/кератопластики, операции по установке протеза роговицы, послойной трансплантации, селективной эндотелиальной трансплантации. См., например, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105:330-43; Dekaris et al. (1999) Curr Eye Res 19(5):456-9; и Dana et al. (1997) Transplantation 63:1501-7. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения нарушений, поражающих конъюнктиву, включая конъюнктивальные рубцовые нарушения и конъюнктивит. Рецептор-связывающий агент может быть использован для лечения других нарушений, таких как пемфигоидный синдром и синдром Стивенса-Джонсона. Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту для модуляции неоваскуляризации в глазу и вокруг него. См., например, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105:330-43.

Рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, имеющему аллергическую реакцию, поражающую глаз, например, субъекту, страдающему от тяжелого аллергического (атопического) глазного заболевания, такого как аллергический конъюнктивит. Например, рецептор-связывающий агент может вводиться топически. См. также, например, Keane-Myers AM et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12):3041-6.

Рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту, имеющему аутоиммунное нарушение, поражающее глаз. Примерные аутоиммунные глазные нарушения включают симпатическую офтальмию, синдром Фогта-Коянаги-Харада (ВКХ), дробьевидную ретинохоридопатию, глазной рубцующийся пемфигоид, гетерохронный иридоциклик Фукса и различные формы увеита. Рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту для лечения любого из вышеуказанных нарушений.

Рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту с диабетической ретинопатией или имеющему риск диабетической ретинопатии. См., например, Demircan et al. (2006) Eye 20:1366-1369 и Doganay et al. (2006) Eye, 16:163-170.

Увеит включает острую и хроническую формы и включает воспаление одного или более из радужной оболочки, реснитчатого тела и хороида. Хронические формы могут быть ассоциированы с системным аутоиммунным заболеванием, например, синдромом Бехчета, анкилозирующим спондилитом, ювенильным ревматоидным артритом, синдромом Рейтера и воспалительным заболеванием кишечника. При переднем увеите воспаление, главным образом, локализуется в радужной оболочке (также ирит). Передний увеит может поражать субъектов, имеющих системное аутоиммунное заболевание, однако также субъектов, не имеющих системного аутоиммунного заболевания. Промежуточный увеит задействует воспаление передней части стекловидного тела, периферию сетчатки и реснитчатое тело, часто с небольшим передним или хориоретинальным воспалением. Промежуточный увеит происходит в результате воспаления плоской части реснитчатого тела (pars plana) между сетчаткой и хороидом. Задний увеит задействует увеальный тракт и, в первую очередь, хороид, и он также носит название хороидит. Задний увеит может быть ассоциирован с системной инфекцией или аутоиммунным заболеванием. Он может персистировать месяцами и даже годами. Рецептор-связывающий агент может вводиться субъекту для лечения одного из вышеупомянутых форм увеита. См. также, например, Tsai et al. (2009) Mol Vis 15:1542-1552 и Trittibach P et al. (2008) Gene Ther. 15(22):1478-88.

В некоторых вариантах воплощения рецептор-связывающий агент используется для лечения субъекта с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) или имеющего риск ВМД. Рецептор-связывающий агент может наноситься топически на глаз, путем инъекции (например, интравитреально) или предоставляться системно. См., например, Olson et al. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17(3):195-200.

Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может вводиться любым способом для лечения глазного заболевания. Агент может доставляться парентеральным способом. Альтернативно или в добавление, агент может доставляться прямо в глаз или в окрестности глаза. Например, белок может вводиться топически или интраокулярно, например, как описано ниже.

Составы и способы глазной доставки

Офтальмологические составы, содержащие рецептор-связывающий агент, могут быть доставлены для топического введения, например, для введения в виде жидких капель или мази, или для имплантации, например, в переднюю камеру глаза или в конъюнктивальный мешок. Жидкие капли могут доставляться с использованием глазной капельницы. При включении в состав для глазной доставки рецептор-связывающий агент может присутствовать в концентрации 0,0001-0,1%, 0,001-5%, например, 0,005-0,5%, 0,05-0,5%, 0,01-5%, 0,1-2% или 1%-5%. Часто офтальмологический состав наносится прямо в глаз, включая топические нанесения на веки или инсталляцию в пространство (свод) между глазным яблоком и веками. Офтальмологический состав может быть разработан с тем, чтобы быстро смешиваться со слезными жидкостями и распределяться по поверхности роговицы и конъюнктивы. При помощи обычной техники введения основная порция препарата откладывается в нижнем своде. Капиллярность, силы диффузии и рефлекс моргания способствуют внедрению препарата в прекорнеальную пленку, из которой он проникает в роговицу и через роговицу.

Офтальмологические составы часто могут включать один или более других агентов, например, противовоспалительный стероид, такой как римексолон, лотепреднол, медризон и гидрокортизон, или нестероидный противовоспалительный агент. Например, стероид может присутствовать в концентрации от 0,001 до 1%. В некоторых вариантах воплощения не присутствует никакой стероид. Например, рецептор-связывающий агент является единственным активным агентом в составе.

Состав также может включать один или более из следующих компонентов: сурфактанты, агенты тоничности, буферы, консерванты, сорастворители и агенты, создающие вязкость. Агенты тоничности могут использоваться для доведения тоничности композиции, например, до таковой, как у естественных слез. Например, хлорид калия, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид кальция, декстроза и/или маннитол могут добавляться для достижения соответствующей тоничности, например, физиологической тоничности. Агенты тоничности могут добавляться в количестве, достаточном для предоставления осмолярности, приблизительно 150-450 мОсм или 250-350 мОсм.

Состав также может включать забуферивание, подходящее для офтальмологической доставки. Буфер может включать один или более забуферивающих компонентов (например, фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, борат натрия или борную кислоту) для изменений в рН, в особенности в условиях хранения. Например, буфер может быть выбран для предоставления целевой рН в диапазоне pH 6,0-7,5, например, 6,5-7,5.

Состав может включать водный или фосфолипидный носитель. В частности, для лечения нарушений сухого глаза состав может включать агенты для обеспечения быстрого облегчения, например, соединения, которые смазывают глаз и помогают в образовании слезы. Например, могут быть использованы фосфолипидные носители (которые включают один или более фосфолипидов) для обеспечения быстрого облегчения. Примеры или композиции искусственных слез, пригодные в качестве носителей искусственных слез, включают коммерческие продукты, такие как для Tears Naturale™ (Alcon Labs, Inc., TX USA). Например, на мл, состав может включать: 1 мг декстрана, 70 и 3 мг гидропропил метилцеллюлозы и, необязательно, консервант, такой как POLYQUAD® (поликватерниум-1) 0,001% (м/о). Примеры составов фосфолипидных носителей включают составы, раскрываемые в US 4804539, US 4883658, US 5075104, US 5278151 и US 5578586.

Состав также может включать другие соединения, который действуют как смазывающий или смачивающий агент. Они включают агенты вязкости, такие как мономерные полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль; полимерные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, различные полимеры семейства целлюлозы: гидроксипропилметилцеллюлозу («ГПМЦ»), карбоксиметилцеллюлозу натрия, гидроксипропилцеллюлозу («ГПЦ»), декстраны, такие как декстран 70; водорастворимые белки, такие как желатин; и виниловые полимеры, такие как поливиниловый спирт, поливинипирролидон, повидон и карбомеры, такие как карбомер 934P, карбомер 941; карбомер 940, карбомер 974P. Дополнительные примеры включают полисахариды, такие как гиалуроновая кислота и ее соли и хондроитин сульфат и его соли, и полимеры акриловой кислоты. В определенных вариантах воплощения состав имеет вязкость от 1 до 400 сП.

Состав может быть упакован для однодозового или многодозового использования, например, в бутылку с совместной капельницей или как набор капельниц для одноразового употребления. Состав может включать один или более консервантов, например, для предотвращения микробной и грибковой контаминации во время использования. Примерные консерванты включают: бензалкония хлорид, хлоробутанол, бензододециниумбромид, метилпарабен, пропилпарабен, фенилэтиловый спирт, двунатрия эдетат, сорбиновую кислоту и поликватерниум-1, и могут включаться в концентрации от 0,001 до 1,0% в/о. Также возможно предоставить состав, содержащий рецептор-связывающий агент, которые является стерильным, хотя и свободным от консервантов. Данный состав может быть приготовлен для одноразового использования.

Могут быть использованы офтальмологические упаковки, предоставляющие пролонгированный контакт офтальмологического состава с глазом. Хлопковый тампон насыщается составом и затем вводится в верхний или нижний свод. Рецептор-связывающий агент также может вводиться путем ионофореза. Эта процедура удерживает раствор в контакте с роговицей на глазном яблоке, несущем электрод. На диффузию препарата воздействует разница электрического потенциала.

Рецептор-связывающий агент также может предоставляться в виде инъекции, например, субконъюнктивальной инъекции. Состав может быть инъецирован под конъюнктиву, способствуя прохождению через склеру и в глаз путем простой диффузии. Состав также может быть инъецирован под конъюнктиву и нижележащую тенонову капсулу в более заднюю часть глаза для доставки агента в реснитчатое тело, хороид и сетчатку. Состав может также быть введен путем ретробульбарной инъекции.

В отношении сухого глаза и других поверхностных нарушений субъекты могут быть оценены с использованием одного или более следующих подходов: индекса заболевания поверхности глаза (ИЗПГ) (Ocular Surface Diseae Index (OSDI)), окрашивания роговицы и конъюнктивы и теста Ширмера.

Индекс заболевания поверхности глаза (ИЗПГ) является вопросником из 12 пунктов, предоставляющий быструю оценку симптомов глазного раздражения, соответствующих воспалительным нарушениям глазной поверхности, включая деструктивные, и их вклада в функцию, связанную со зрением. См., например, Ocul Immunol Inflamm. 2007 Sep-Oct; 15(5):389-93. 12 пунктов вопросника ИЗПГ ранжированы по шкале от 0 до 4. Баллы получают на основе ответов для получения балла ИЗПГ на шкале от 0 до 100, большие баллы представляют большую нетрудоспособность. Отрицательное изменение по сравнению с исходным уровнем указывает на улучшение функции, связанной со зрением, и глазных воспалительных нарушений.

Окрашивания роговицы и конъюнктивы: окрашивание роговицы служит измерением заболевания эпителия или нарушения эпителиального барьера поверхности глаза, как правило, наблюдаемое при воспалительных нарушениях глазной поверхности, таких как сухой глаз. Окрашивание роговицы может иметь место даже без клинически явного сухого глаза, если имеется серьезное заболевание век, такое как задний блефарит. Окрашивание роговицы в значительной степени коррелирует с дискомфортом в глазу у многих, если не у всех пациентов; в целом, окрашивание роговицы ассоциировано с высокими баллами в ИЗПГ, как описано выше. Для окрашивания роговицы флуоресцеином используются полоски с флуоресцеином, смоченные физиологическим раствором, или 1% раствор флуоресцеина натрия, чтобы окрасить слезную пленку. Затем с помощью щелевой лампы с желтым барьерным фильтром (#12 Wratten) и синим кобальтовым освещением исследуется вся роговица. Окрашивание распределяется по степени согласно Оксфордской схеме. Окрашивание конъюнктивы подобно измерению заболевания эпителия или нарушения эпителиального барьера поверхности глаза. Окрашивание конъюнктивы выполняется под щелевой лампой с использованием лиссаминового зеленого. Смоченные физраствором полоски или 1% раствор лиссаминового зеленого используется для окрашивания слезной пленки, и находящееся между веками конъюнктивальное окрашивание оценивается через более чем 30 секунд, но менее чем через 2 минуты спустя. С использованием белого света умеренной интенсивности по Оксфордской схеме оценивается только участок между веками назального и височного конъюнктивального окрашивания.

Тест Ширмера: тест Ширмера выполняется в присутствии и в отсутствие анестезии путем помещения узкой полоски фильтровальной бумаги (полоска 5×3 5 мм из фильтровальной бумаги Whatman #41) во внутренний свод. Этот тест проводится в помещении с тусклым освещением. Пациент осторожно закрывает свои глаза до тех пор, пока не пройдет пять минут, и полоски будут удалены. Поскольку слезный фронт будет продолжать продвигаться на несколько миллиметров после того, как он будет удален из глаза, слезный фронт помечают шариковой ручкой точно через пять минут. Продукция слезной жидкости измеряется по длине в миллиметрах, на которые полоска увлажняется в течение 5 минут. Результаты в 10 мм или менее для теста Ширмера без анестезии и 5 мм или менее для теста Ширмера с анестезией считаются аномальными. Положительное изменение по сравнению с исходным уровнем указывает на улучшение одного или более симптомов описываемого здесь глазного воспалительного нарушения.

Составы и способы легочной доставки

Рецептор-связывающий агент может быть включен в состав для ингаляционного или другого способа легочной доставки, например, для введения агента в ткани респираторного тракта, например, верхнего и нижнего респираторного тракта. Три распространенные системы, которые могут быть использованы для доставки агента локально в легочные дыхательные пути, включают порошковые ингаляторы (ПИ), дозирующие ингаляторы (ДИ) и небулайзеры. ДИ могут быть использованы для доставки рецептор-связывающих агентов в растворимой форме или в форме дисперсии. Обычно ДИ включают фреон или другой пропеллент с относительно высоким давлением пара, который проталкивает лекарственный препарат в форме аэрозоля в респираторный тракт после активации устройства. В отличие от этого, ПИ в основном полагаются на дыхательные усилия пациентов для введения медикамента в форме сухого порошка в легкие. Небулайзеры образуют аэрозоль медикамента, который следует вдохнуть, наделяя жидкий раствор энергией. Агент сможет храниться в лиофилизированной форме (например, при комнатной температуре) и быть восстановленным в виде раствора перед ингаляцией. Также возможными способами доставки являются прямая легочная доставка препаратов во время капельно-жидкого газообмена или легочного лаважа с использованием фторсодержащей среды. Эти и другие способы могут быть использованы для доставки рецептор-связывающего агента. Например, агент доставляется в форме дозированной единицы по меньшей мере приблизительно 0,02; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 5; 10; 20; 40 или 50 мг/впрыскивание, или более.

Рецептор-связывающий агент может быть удобно доставлен в форме представления аэрозольным спреем из находящихся под давления упаковок или небулайзера, с применением подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, дихлорфторметана, трихлорфторметана, диэлилоротетрафтороктлиана, двуокиси углерода или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля единица дозирования может быть определена путем предоставления клапана для доставки контролируемого количества. Капсулы и картриджи для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть разработаны в составе, содержащем порошковую смесь рецептор-связывающего агента и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал, если частица является частицей, входящей в разработанный состав. В добавление к разработанному в составе или не разработанному в составе рецептор-связывающему агенту, другие материалы, такие как 100% L-альфа-фосфатидилхолин дипальмитоил (DPPC), или другие сурфактанты могут быть смешанными вместе для содействия в доставке и диспергировании разработанному в составе или не разработанному в составе рецептор-связывающему агенту. Размер частиц также может варьировать для контроля того, осуществляется ли доставка в нижний или верхний дыхательный тракт. Например, могут быть использованы частицы в диапазоне размеров 1-5 микрон или 10-50 микрон для, соответственно, нижнего и верхнего респираторного трактов.

Усилители доставки, такие как сурфактанты, могут быть использованы для дальнейшего усиления легочной доставки. Сурфактант, в общем, является соединением, имеющим гидрофильную и липофильную функциональную группу, которое способствует абсорбции препарата путем взаимодействия с интерфазой между двумя несмешивающимися фазами. Сурфактанты полезны в сухих частицах из-за нескольких причин, например, снижения агломерации частиц и снижения фагоцитоза макрофагами. Сурфактанты хорошо известны в области техники и включают фосфоглицериды, например, фосфатидилхолины, L-альфа-фосфатидилхолин дипальмитоил (DPPC) и дифосфатидил глицерин (DPPG); гексадеканол; жирные кислоты; полиэтиленгликоль (ПЭГ); полиоксиэтилен-9-; ауриловый эфир; пальмитиновую кислоту; олеиновую кислоту; сорбитан триолеат (Span 85); гликохолат; сурфактин; полоксомер; жирнокислотный эфир сорбитана; сорбитан триолеат; тилоксапол; и фосфолипиды.

Также здесь характеризуются антитела, которые специфически распознают описываемый здесь гибридный домен цитокина. Например, такие антитела предпочтительно связываются с гибридным доменом, родственным любому родительскому домену цитокина. Например, специфическое антитело может связываться с эпитопом, что включает соединение между сегментом из первого родительского цитокина и второго родительского цитокина.

Доставка нуклеиновой кислоты

Рецептор-связывающий агент может быть предоставлен субъекту путем доставки нуклеиновой кислоты, которая кодирует и может экспрессировать рецептор-связывающий агент. Например, последовательность, кодирующая рецептор-связывающий агент, может быть помещена под контроль последовательностей, контролирующих транскрипцию, и помещена в вектор нуклеиновых кислот для доставки гена, например, в вирусный вектор. Примерные вирусные векторы включают аденовирусные, ретровирусные или адено-ассоциированные вирусные векторы. Векторы могут быть в форме плазмиды или линейной молекулы, например, линейной двунитчатой ДНК. Доставляемая нуклеиновая кислота может быть сконструирована для инкорпорации в геном клетки-мишени, например, для интеграции в геном клетки-мишени. Альтернативно, доставляемая нуклеиновая кислота может быть сконструирована таким образом, что после доставки она существует в клетке автономно.

Последовательности транскрипционного контроля могут быть созданы для предоставления временной или конститутивной экспрессии. Временный контроль может включать контроль, регулируемый экзогенным агентом, например, путем использования элементов транскрипционного ответа для факторов транскрипции, отвечающих на экзогенные агенты (например, стероидный гормон или FK506) или сигналы окружающей среды.

Экспрессия генов, предоставляемых на доставляемой нуклеиновой кислоте, может быть оценена, например, путем детекции белка, кодируемого геном (например, используя антитела), или путем детекции мРНК, например, используя ПЦР или нозерн-гибридизацию. Доставляемая нуклеиновая кислота в основном сконструирована таким образом, что транскрипционные и трансляционные регуляторные ДНК позиционированы соответствующим образом по отношению к кодирующей последовательности для рецептор-связывающего агента так, что транскрипция начинается и данный протеин транслируется из получаемой в результате команды. Нуклеиновая кислота может включать последовательности нуклеиновой кислоты, регулирующие транскрипцию и трансляцию, из клеток млекопитающих, в частности, людей. Такие последовательности включают, например, промоторные последовательности, сайты, связывающие рибосомы, последовательности начала и окончания транскрипции и энхансеры или активаторы последовательностей.

Кроме того, экспрессирующий вектор может включать дополнительные элементы. Например, для интегрирующих экспрессирующих векторов, экспрессирующий вектор может содержать по меньшей мере одну или две последовательности, гомологичные геному клетки-хозяина, например, фланкирующую экспрессирующую конструкцию. Интегрирующий вектор может быть направлен на специфический локус в клетке-хозяина путем отбора соответствующей гомологической последовательности для включения в вектор. Конструкции для интегрирующих векторов хорошо известны в области техники.

Примерные аденовирусные векторы включают модифицированные версии человеческих аденовирусов, таких как Ad2 или Ad5, в которых удалены генетические элементы, необходимые для репликации вируса in vivo. Например, может быть удален участок E1 и геном далее может быть модифицирован для приема экспрессирующей кассеты, кодирующей рецептор-связывающий агент.

Примерные ретровирусные векторы включают LNL6, LXSN, LNCX и лентивирусные векторы. Конкретные лентивирусные векторы описаны Pawliuk et al. (2001) Science 294:2368 и Imren et al. (2002) PNAS 99:14380 и включают, ограничиваясь, вирус иммунодефицита человека (например, HIV-1, HIV-2), вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV) и вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV). Эти векторы могут быть сконструированы и созданы с тем, чтобы быть безопасными, например, путем выделения необходимых генов (например, gag и pol) в отдельные векторы и путем придания дефектности репликации ретровирусов. Ретровирусы, дефектные по репликации, затем упаковываются в вирионы путем использования вируса-помощника или упаковочной клеточной линии при помощи стандартных методик. Протоколы для получения рекомбинантных ретровирусов и для инфицирования клеток такими вирусами in vitro или in vivo можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 и других стандартных лабораторных руководствах. Ретровирусный вектор может включать, в добавление к последовательностям для экспрессии рецептор-связывающего агента, левый (5') ретровирусный длинный концевой повтор LTR; ретровирусный экспортный элемент, необязательно, элемент обратного ответа (RRE); промотор и контрольный участок локуса (LCR) или другая последовательность-инсулятор транскрипции, и правый (3') ретровирусный LTR. Ретровирусные векторы могут далее содержать центральный полипуриновый участок (cPPT) или ДНК флэп для повышения вирусных титров и эффективности трансдукции.

Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующая рецептор-связывающий агент, может быть доставлена в любую соответствующую клетку-мишень, например, ex vivo или in vivo. Примерные клетки-мишени включают синовиальные клетки, гематопоэтические клетки, клетки дермы и так далее. Нуклеиновая кислота может быть доставлена в клетки мишени, ассоциированные с глазом, например, эпителиальные клетки роговицы. Доставка может включать удаление омертвевших тканей или выскабливание эпителия роговицы для экспозиции базального слоя эпителия. Затем добавляется нуклеиновая кислота для доставки. В другом варианте воплощения нуклеиновая кислота доставляется в эндотелиальные клетки роговицы, клетки трабекулярной сети за периферией роговицы, клетки хороидного слоя глаза, клетки сетчатки, склеры или реснитчатого тела, клетки ретинальной или глазной васкулатуры или клетки стекловидного тела, или клетки хрусталика, например, эпителия хрусталика.

Способы доставки включают, например, ретровирусную инфекцию, аденовирусную инфекцию, трансформацию плазмидами, трансформацию липосомами, содержащими экзогенную нуклеиновую кислоту, биолистическую доставку нуклеиновой кислоты (например, нагружая нуклеиновую кислоту на частицы золота или другого металла и внедрение или инъекцию в клетки), инфекцию аденоассоциированным вирусом и инфекцию вирусом Эпштейна-Барр. Доставка может происходить в клетки или ткани любым способом, включая игольную инъекцию, безыгольный инжектор, электропорацию или генную пушку.

Другие способы для генной доставки можно найти в, например, Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; и Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8.

Примерные вторые агенты

Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может вводиться вместе со вторым агентом. Два агента могут быть введены совместно или введены отдельно, например, используя различные режимы. Примерные вторые агенты включают противовоспалительный агент.

В одном варианте воплощения вторым агентом является антагонист IL-17 (охватывающий антагонисты всех членов семейства IL-17, например, антагонисты IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D и IL-17E). Примерные антагонисты IL-17 включают: агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с IL-17 (включая IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D и IL-17E) и которые служат антагонистами опосредованной IL-17 передачи сигнала; агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с одним или более рецепторов для IL-17, таких как IL-17RA и IL-17RC, и которые служат антагонистами опосредованной IL-17 передачи сигнала; агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с комплексом, содержащим IL-17 и по меньшей мере одну субъединицу рецептора, например, IL-17 и Il-17RA или IL-17, IL-17RA и IL-17RC, и которые служат антагонистами опосредованной IL-17 передачи сигнала; и агенты, такие как растворимые рецепторы, которые включают один или более растворимых внеклеточных доменов IL-17RA и IL-17RC, и которые служат антагонистами опосредованной IL-17 передачи сигнала.

В другом варианте воплощения вторым агентом является антагонист IL-12. Примерные антагонисты IL-12 включают: агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с IL-12 (включая p35 и p40), и которые служат антагонистами опосредованной IL-12 передачи сигнала; агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с одним или более рецепторов для IL-12, таких как IL-12Rβ1 или IL-12Rβ2, и которые служат антагонистами опосредованной IL-12 передачи сигнала; агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с комплексом, содержащим p35, p40 и по меньшей мере одну субъединицу рецептора, например, IL-12Rβ1 или IL-12Rβ2, и которые служат антагонистами опосредованной IL-12 передачи сигнала; и агенты, такие как растворимые рецепторы, которые включают один или более растворимых внеклеточных доменов IL-12Rβ1 или IL-12Rβ2, и которые служат антагонистами опосредованной IL-12 передачи сигнала.

В другом варианте воплощения вторым агентом является антагонист IL-23. Примерные антагонисты IL-23 включают: агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с IL-23 (включая p19 и p40), и которые служат антагонистами опосредованной IL-23 передачи сигнала; агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с одним или более рецепторов для IL-23, такие как IL-12Rβ1 или IL-23R, и которые служат антагонистами опосредованной IL-23 передачи сигнала; агенты (такие как антитела и другие связывающие белки), которые связываются с комплексом, содержащим p19, p40 и по меньшей мере одну субъединицу рецептора, например, IL-12Rβ1 или IL-23R, и которые служат антагонистами опосредованной IL-23 передачи сигнала; и агенты, такие как растворимые рецепторы, которые включают один или более растворимых внеклеточных доменов IL-12Rβ1 или IL-23R, и которые служат антагонистами опосредованной IL-23 передачи сигнала.

Примерные антитела к IL-23 описаны. См., например, Beyer et al., J. Mol. Biol. (2008), doi:10.1016/j.jmb.2008.08.001.

Модели на животных

Рецептор-связывающий агент может быть оценен в модели на животных человеческого заболевания, например, человеческого аутоиммунного и/или человеческого воспалительного заболевания. Агент может иметь специфичность в отношении соответствующего таргетного белка у животного.

Модели ревматоидного артрита. Рецептор-связывающий агент может быть оценен в модели на животных ревматоидного артрита, например, коллаген-индуцированного артрита (КИА). См., например, McIndoe et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2210-2214; Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569; и Current Protocols in Immunology, Unit 15.5, Coligan et al. (eds.), John Wiley&Sons, Inc. Модель получают путем иммунизации чувствительных линий крысы/мыши нативным коллагеном II типа. Коллаген эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) и вводят внутрикожно (100 мкг коллагена:100 мкг ПАФ/мышь) в основание хвоста. Контрольным мышам инъецируют внутрикожно 0,05 мл дистиллированной воды/эмульсии ПАФ. Бустерную инъекцию коллагена в неполном адъюванте проводят через 21 день после первичной иммунизации. Заболевание вызывается аутоиммунным ответом, индуцированным иммунизацией коллагеном.

Суставы можно оценить в баллах в отношении артрита, воспаления, паннуса, повреждения хряща и резорбции кости, используя определенную шкалу. Например, тяжесть артрита можно оценить в баллах следующим образом: 0=отсутствие видимых эффектов артрита; 1=отек и эритема пальца и сустава; 2=отек и эритема двух суставов; 3=отек и эритема более двух суставов; 4=тяжелый артрит всей лапки и пальцев, сопровождающийся анкилозом лодыжки и деформацией конечности. Баллы для каждой конечности суммируются и записываются в виде индекса артрита (ИА) для каждого отдельного животного. Могут также быть использованы другие схемы подсчета баллов для этих и других критериев.

Множественный склероз. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) является пригодной мышиной моделью для множественного склероза. Рецептор-связывающий агент может быть оценен в модели ЭАЭ. ЭАЭ является аутоиммунным заболеванием, опосредованным Т-клетками, которое характеризуется воспалением с Т-клетками и мононуклеарными клетками с последующей демиелинизацией аксонов в центральной нервной системе. (См., например, Bolton, C., 1995, Multiple Sclerosis, 143.) Примерные протоколы можно найти в Current Protocols in Immunology, Unit 15.1 and 15.2; Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. Также имеются модели миелинового заболевания, при котором олигодендриты или шванновские клетки трансплантируются в центральную нервную систему, например, как описано в Duncan et al., 1997, Molec. Med. Today, 554-561.

Трансплантат. Рецептор-связывающий агент может быть оценен в модели на животных отторжения кожного трансплантата, например, используя трансплантаты кожи хвоста. Отторжение кожного трансплантата опосредовано Т-клетками, Т-клетками хелперами и эффекторными Т-клетками киллерами. См., например, Current Protocols in Immunology, Unit 4.4; Coligan et al. (eds.), 1995, John Wiley&Sons, Inc. Также могут быть использованы другие модели отторжения трансплантата. См., например, Tinubu et al., 1994, J. Immunol., 4330-4338.

Модели воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и колита. Примерная модель воспалительного заболевания кишечника является использованием клеток, богатых CD4+ CD45Rb, пересаженных мышам SCID. См., например, Hirano et al., J Pharmacol Sci. 2009 Jun; 110(2):169-81, и использование трансгенных мышей, дефицитных по IL-10. См., например, Inaba et al., Inflamm Bowel Dis., DOI: 10.1002/ibd.21253 (2010). Еще одна примерная модель колита использует декстран сульфат натрия (ДСН) для индукции острого колита. Например, колит может быть индуцирован у мышей путем введения 5% (вес/объем) ДСН (молекулярная масса 30-40 кДа; ICN Biomedicals, Aurora, OH) в питьевой воде ad libitum. Симптомы, развивающиеся в результате этой обработки - кровавый понос, потеря веса, сокращение толстой кишки и образование язв в слизистой оболочке с инфильтрацией нейтрофилами. Колит, индуцированный ДСН, характеризуется гистологически инфильтрацией воспалительных клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишечника, с лимфоидной гиперплазией и образованием язв эпителия. Эти изменения, как считается, развиваются вследствие токсического эффекта ДСН на эпителий и путем фагоцитоза клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишечника и продукции ФНО-альфа и гамма-интерферона. См., например, Hassan et al. PLoS One. 2010 Jan 25; 5(1):e8868.

Модели заболевания сухого глаза. Рецептор-связывающий агент может быть оценен в мышиной модели для заболевания сухого глаза. Сухой глаз может быть индуцирован у мышей путем подкожной инъекции скополамина и последующего помещения мышей в камеры с контролируемой окружающей средой. Посредством конкретного примера, у нормальных мышей-самок C57BL/6 возрастом от 6 до 10 недель может быть индуцирован сухой глаз путем непрерывной экспозиции к сухой окружающей среде в камере с контролируемой окружающей средой. Камера имеет низкую относительную влажность менее 30% (в основном приблизительно 19%), сильный поток воздуха (15 литров/минуту) и постоянную температуру (приблизительно 22°C). Мышей, помещенных в камеру, также обрабатывают скополамином для подавления слезной секреции. Трансдермальные полоски с длительным высвобождением скополамина можно получить от Novartis (Summit, N.J.). Одна четвертая полоски накладывается на депилированную середину хвоста каждый 48 часов. Комбинация камеры с контролируемой окружающей средой и скополамина приводит к тяжелому сухому глазу в относительно короткий период времени (приблизительно 2-4 дня). Камера с контролируемой окружающей средой может быть подготовлена, как описано в Barbino et al., Invest. Ophthal. Vis. Sci., 46:2766-2711 (2005), и она делает возможным контроль потока воздуха, влажности и температуры.

Можно проводить мониторинг мышей на предмет признаков сухого глаза, например, путем выполнения: a) теста с хлопчатобумажной нитью для измерения продукции слезной жидкости, который, как правило, снижен у пациентов с сухим глазом; b) окрашивания роговицы флуоресцеином, который является маркером повреждения поверхности роговицы; и общего офтальмологического обследования.

Тест с хлопчатобумажной нитью: слезную продукцию можно оценить при помощи теста с хлопчатобумажной нитью, импрегнированной феноловым красным (Zone-Quick, Lacrimedics, Eastsound, Wash.). Под увеличивающей флуоресцентной лампой нить держат ювелирным пинцетом и помещают в латеральный кантус конъюнктивального свода правого глаза на 30 или 60 секунд. Под микроскопом учитывается слезное расстояние в мм с использованием шкалы гемоцитометра.

Окрашивание роговицы флуоресцеином: окрашивание роговицы флуоресцеином может быть оценено путем нанесения микропипеткой 1,0 мкл 5% флуоресцеина в нижний конъюнктивальный мешок глаза. Роговица исследуется с помощью биомикроскопа с щелевой лампой с использованием кобальтового синего света через 3 минуты после инстилляции флуоресцеина. Усиленное окрашивание записывается маскированным образом с использованием стандартизированной системы оценок Национального Института Глаза (National Eye Institute (NEI)) от 0 до 3 для каждой из пяти зон, на которые была поделена поверхность роговицы.

Диагностические и другие применения

Описываемый здесь рецептор-связывающий агент может быть использован для обнаружения IL-1R1 в образце или в клетке, экспрессирующей такой рецептор. Например, агент может метиться прямо или непрямо при помощи функциональной группы, которая является меткой или продуцирует сигнал, например, ферментом, радиометкой, эпитопом или флуоресцентным белком (таким, как белок с зеленой флуоресценцией). Агент может контактировать с образцом или с клетками для определения того, присутствует ли рецептор в образце или в клетках, например, с использованием стандартного иммуноблоттинга, иммунофлуоресценции, иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммуноанализа (РИА), переноса энергии флуоресценции, вестерн-блоттинга и других методик диагностики и детекции.

Рецептор-связывающий агент также может метиться для детекции in vivo и быть вводимым субъекту. Субъект может быть исследован визуализационным способом, например, путем ЯМР или другими томографическими средствами. Например, связывающий агент может быть помечен радиометкой, такой как ¹³¹I, ¹¹¹In, ¹²³I, ^99mTc, ³²P, ¹²⁵I, ³H, ¹⁴C и ¹⁸⁸Rh, флуоресцентными метками, такими как флуоресцеин и родамин, метками, активными для ядерного магнитного резонанса, изотопами, испускающими позитроны, которые могут обнаруживаться сканнером позитронной эмиссионной томографии ("ПЭТ"), веществами, активными в хемилюминесценции, такими как люциферин, и ферментными маркерами, такими как пероксидаза или фосфатаза. Агент может быть помечен контрастным агентом, таким как парамагнитные агенты и ферромагнетик или суперпарамагнетик (которые, главным образом, изменят ответ T2).

Рецептор-связывающий агент также может быть использован для очистки клеток, экспрессирующих рецептор, с которым он связывается. Например, рецептор-связывающий агент может быть присоединен к иммобилизированной подложке (например, магнитным шарикам или матрице колонки) и приведен в контакт с клетками, которые могут экспрессировать рецептор. Подложка может быть отмыта, например, при помощи физиологического буфера, и клетки могут быть восстановлены из подложки.

Рецептор-связывающий агент также может быть использован для очистки растворимых форм рецептора, с которым он связывается. Например, образцы, содержащие растворимый рецептор, могут быть приведены в контакт с иммобилизированным рецептор-связывающим агентом и затем, например, после отмывания, могут быть восстановлены из иммобилизированного агента.

Следующие не имеющие ограничительного характера примеры далее иллюстрируют варианты воплощения описываемых здесь изобретений.

Примеры

Пример 1

Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки с аминокислотными последовательностями, перечисленными в Таблице 4 (ниже), были сконструированы в pET векторе, содержащем промотор T7 и ампициллин- (серия pET31) или канамицин-резистентные гены (серия pET28) (EMD Chemicals, Gibbstown NJ, USA), и экспрессированы. Примеры кодирующих последовательностей, которые могут быть использованы для экспрессии, предоставлены в Таблице 5.

Таблица 4 Примерные гибридные белки SEQ ID NO: P01 APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESNDKIPVALGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVDPKNYPKKKMDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS 17 P02 APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQGEESNDKIPVALGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS 18 P03 apvrslafriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfirsdsgpttsfesaacpgwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkftmqfvss 19 P04 apvrslafriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaacpgwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkftmqfvss 20 P05 apvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfymqfvss 21 P06 APVRSLNCTLWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSMEADQPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS 23 P07 APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGQDITDFTMQFVSS 24

Примерные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вышеуказанные белки, перечислены в Таблице 5. В некоторых вариантах воплощения последовательность нуклеиновой кислоты далее включает ATG перед первым нуклеотидом, указанным выше. В некоторых вариантах воплощения последовательность нуклеиновой кислоты далее включает стоп-кодон (такой как TAA, TAG или TGA) после последнего нуклеотида, указанного ниже.

Таблица 5 Нуклеиновые кислоты, кодирующие примерные гибридные белки SEQ ID NO: P01 GcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagatagatgtgTcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcatccatggagggaagatgtgcctgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccagctggaggcagttGatcccaaaaattacccaaagaagaagatggacaagcgcttcgccttcatccgctcagacagcggccccaccaccagttttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacAtgcaatttgtgtcttcc 25 P02 gcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagatagatgtgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcatccatggagggaagatgtgcctgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccagctggaggcagttgatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctgagttttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacatgcaatttgtgtcttcc 26 P03 gcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagttctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcatccgctcagacagcggccccaccaccagttttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattcaccatgcaatttgtgtcttcc 27 P04 gcacctgtacgatcactggccttcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagTtctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgccgcctgccccggttggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattcaccatgcaatttgtgtcttcc 28 P05 gcacctgtacgatcactgaactgcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagttctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgcccagttccccaactggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctacatgcaatttgtgtcttcc 29 P06 gcacctgtacgatcactgaactgcacgctctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcgagcaacaagtggtgttctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgcccagttccccaactggtacatcagcacctctatggaagctgaccagcccgtcttcctgggagggaccaaaggcggccaggatataactgacttcaccatgcaatttgtgtcttcc 30 P07 GcacctgtacgatcactgaactgcagaatctgggatgttaaccagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagTtctccatgtcctttgtacaaggagaagaaagtaatgacaaaatacctgtggccttgggcctcaaggaaaagaatctgtacctgtcctgcgtgttgaaagatgataagcccactctacagctggagagtgtagatcccaaaaattacccaaagaagaagatggaaaagcgatttgtcttcaacaagatagaaatcaataacaagctggaatttgagtctgcccagttccccaactggttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcCaggatataactgacttcaccatgcaatttgtgtcttcc 31

Белки могут включать ряд различных остатков из IL-1β и IL-1Ra, как проиллюстрировано ниже. Среди примеров P01, P02, P03, P04 и P05, домены цитокинов могут иметь 48-70% остатков из IL-1β и 55-78% остатков из IL-1Ra. (Из-за того, что количество аминокислотных остатков сохраняется между двумя белками, сумма процентной идентичности к IL-1β и IL-1Ra может быть большей чем 100%.)

Таблица 6 Остатки
IL-1β Остатки
IL-1RA Всего остатков % IL-1β % IL-1RA P06 130 62 152 85,5 40,8 P07 113 80 153 73,9 52,3 P05 108 85 153 70,6 55,6 P04 104 89 153 68,0 58,2 P03 94 99 153 61,4 64,7 P02 85 108 153 55,6 70,6 P01 74 119 153 48,4 77,8

Пример 2

Белки, содержащие метку гекса-гистидин, были экспрессированы в клетках E. coli штамма BL21(DES) путем индукции 1 мМ изопропилтиогалактозидом (IPTG) при 37°C в течение 3 часов в бульонной среде Лурия-Бертани. Клетки лизировали в 20-50 мМ Tris, 0,5 М NaCl, 2,5 мМ ЭДТА, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Лизаты подвергали аффинной хроматографии на иммобилизированных ионах металла (IMAC) с использованием заполненной колонки HiTrap® (GE Healthcare, Piscataway NJ, USA). Белок наносили в буфере с 20 мМ фосфата натрия, 0,5 M NaCl, 10 мМ имидазола, pH 7,4. Он был элюирован буфером с 200 мМ имидазола, 20мМ фосфата натрия, 0,5 M NaCl, pH 7,4. Элюированный белок активно диализировали против ЗФФ, 0,1% полисорбат 80, pH 7,4, концентрировали с использованием фильтра Amicon Ultra® (10K) и хранили при 4° или -80°C.

Белки, у которых отсутствовала метка гекса-гистидин, очищали ионообменной хроматографией. Белок P05 очищали ионообменной хроматографией. Лизаты из экспрессирующих клеток наносили на колонку GigaCapS™ (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA, USA) при низком pH (приблизительно pH 5,5) в отсутствие соли (проводимость приблизительно 1 мС/см). Колонку затем элюировали градиентом рН (Буфер A=10 мМ уксусная кислота, pH 5,5; Буфер B=20 мМ Tris pH 8). Фракцию в 5 мл, содержащую элюированный белок, затем разводили 5 мл H₂O и 5 мл 20 мМ Tris pH 8) и затем наносили на ионообменную смолу CaptoQ™ (GE Healthcare, Piscataway NJ, USA) и элюировали градиентом NaCl от 0 мМ до 250 мМ в 20 мМ Tris pH 8,0. Элюированный белок активно диализировали против 1,25X ЗФФ 0,1% TWEEN® 80 или 1,25X ЗФФ без TWEEN® и хранили. См. Фиг. 6. Белки P03 и P04 очищали, используя подобные способы.

Клетки, экспрессирующие P05, также выращивали на бульоне TEKNOVA™ Terrific Broth со свободной от животных компонентом добавкой сои soytone (# T7660), обогащенном 10 г/л глюкозы, 10 мМ MgSO₄, микроэлементами (1 мг/мл TEKNOVA™ 1000X Trace Elements, #T1001) и антибиотиками в Sartorius 2L BIOSTAT™ A+, и они были индуцированы при кислородном обеднении 35-40 1 мМ IPTG в течение приблизительно 6 часов. Клетки выращиваются при 37°C с 30% растворенным кислородом при pH 7,0, и помешивании при 200-800 об/мин с барботажем кислородом при 2 л/мин. Клетки подкармливали 9 г глюкозы/л/час, когда происходило истощение глюкозы, как это обнаруживалось по повышению рН. Подкормку снижают до 6 г глюкозы/л/час, когда рН снижается (приблизительно через 2,5 часа после индукции).

Клетки собирали и лизировали в лизирующем буфере (20 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton, pH 8,0; 20 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton, pH 7,0; 50 мМ MOPS, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton, pH 6,5; или 50 мМ MOPS, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Triton, pH 6,0). Лизат наносили на катионную ионообменную среду Poros XS® (Life Technologies Corp., Carlsbad CA USA) при pH 5,3 и 3 мС/см (35 мг продукта на мл ионообменной смолы колонки).

В примерной процедуре белок P05 элюируется этапом на рН 7,0, с использованием буфера, содержащего 100 мМ MOPS 25 мМ NaCl pH 7,0. Первый пик элюции отбрасывали, и второй пик элюции был собран в пулы и содержал белок P05. Ранние пулы были обогащены интактным белком P05 относительно видов des-Ala. Этот элюированный материал затем пропускали через анионообменную смолу CaptoQ™. Собирали порцию, которая проходит и содержит интактный белок P05.

В другой примерной процедуре среда отмывается 100 мМ (MOPS); 20 мМ NaCl pH 6,0. Белок P05 элюируется этапом на pH 6,0 с использованием буфера, содержащего 100 мМ MOPS 50-58 мМ NaCl pH 6,0. Первый пик элюции отделяли от последующих пиков, и он содержал интактный белок P05. Этот элюированный материал затем пропускали через анионообменную смолу CaptoQ™. Собирали порцию, которая проходит и содержит интактный белок P05.

Пример 3

Белки или супернатанты, содержащие белки, оценивали в тесте на активность IL-1, основанном на клетках. Для мониторинга активности IL-1β использовали клетки HEK-Blue™, отвечающие на IL-1β (доступны от InvivoGen Inc., San Diego CA, USA). Эти клетки включают ген-репортер SEAP под контролем минимального промотора IFN-β, слитый с пятью NF-κB и пятью AP-1-связывающих сайтов. Вовлечение IL-1β рецепторов IL-1 на клеточной поверхности приводит к активации NF-κB и продукции SEAP. Репортерная активность SEAP может быть обнаружена, например, путем использования QUANTI-Blue™ (InvivoGen Inc., San Diego CA, USA) и спектрофотометрического анализа. Клеточную суспензию A HEK-Blue IL-1β готовили из клеток, культивированных до достижения 70-80% конфлюэнтности. Ресуспендированные клетки доводили до ~330000 клеток/мл в свежей ростовой среде (DMEM, 4,5 г/л глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 10% (о/о) термоинактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (30 мин при 56°C), 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл NormocinT).

Реагенты добавляли в лунки плоскодонного 96-луночного планшета для культивирования клеток: 10 мкл IL-1β при 20 нг/мл, 1 мкл исследуемого агента и 30 мкл клеточной культуральной среды до конечного объема 50 мкл. Параллельно готовили положительные и отрицательные контрольные образцы. Затем 150 мкл клеточной суспензии HEK-Blue IL-1β (~50000 клеток) добавляли в каждую лунку и планшет культивировали в течение ночи при 37°C в инкубаторе для тканевых культур с 5% CO₂. Обычно конечная концентрация IL-1β (в конечном объеме 200 мкл) составляла 0,1 нг/мл. Активность IL-1β оценивалась на следующий день (12-15 часов спустя). Перед количественным определением готовили реагент QUANTI-Blue™ в соответствии с инструкциями производителя. Был подготовлен плоскодонный 96-луночный тестовый планшет, в котором в каждую лунку добавили 150 мкл раствора QUANTI-Blue™. 50 мкл кондиционированной среды из лунок 96-луночного планшета для культивирования тканей было добавлено в каждую лунку тестового планшета. Планшет инкубировали при 37°C в течение приблизительно 15-20 минут. Затем с использованием спектрофотометра измеряли уровни SEAP при 620-655 нм.

Результаты. Как показано на Фиг. 7A, в этом тесте белок P06 вел себя как агонист IL-1RI, белок P07 вел себя как частичный агонист, и белок P01 проявил неспособность выступать в роли агониста. Фактически, белок P01 вел себя как антагонист при анализе в присутствии IL-1β. Фиг. 7B демонстрирует антагонизм активности IL-1β P01 в диапазоне концентраций белка IL-1β с использованием описанного выше клеточного анализа HEKBlue™. Антагонизм повышался с повышенными количествами P01 (ось x отражает микролитры супернатанта, содержащего P01).

Белки P01, P02, P03, P04 и P05, каждый проявляет антагонизм в отношении активности IL-1β. См., например, Фиг. 8A и 8B. IC50 P05 был менее чем приблизительно 5 нг/мл. P05 был тестирован на способность служить агонистом IL-1RI в этом тесте и, как наблюдалось, не обладал никакой обнаруживаемой агонистической активностью даже при наивысших тестируемых концентрациях, 1 мг/мл. P01, P02, P03, P04 и P05 также ингибировали индуцированную IL-1β экспрессию IL-6 в клетках MG-63, клеточной линии остеосаркомы человека, отвечающей на IL-1β. В мышиной модели заболевания сухого глаза P05 с меткой гекса-гистидином, как наблюдалось, обладал биологической активностью. См. также Пример 8 ниже в отношении немеченого P05.

Пример 4

Связывающие свойства белков в отношении растворимого рекомбинантного человеческого IL-1RI (относящегося к внеклеточному домену IL-1RI) были оценены с использованием поверхностного плазмонного резонанса с двухканальной SPR системой Reichert SR7000DC Dual Channel SPR system. Связывание оценивалось в забуференном фосфатами физрастворе с 0,005% Tween 20. Как показали наблюдения, IL-1β имел K_D между 8-9 нМ и константу диссоциации (K_d) между 2-3×10^-3 сек^-1, и в другом эксперименте K_D приблизительно 2 нМ, константу ассоциации 1,3-1,5×10⁶ M^-1 сек^-1, и константу диссоциации (K_d) приблизительно 2,9-3,0×10^-3 сек^-1. См. Фиг. 9A. Белок P01 связывался с такой же кинетикой ассоциации, как и IL-1β, однако не диссоциировал во время фазы диссоциации эксперимента на связывание (приблизительно 180 секунд). Таким образом, в одинаковых условиях белок P01 связывается с IL-1RI с большей аффинностью, чем IL-1β.

Как показали наблюдения, связывание IL-1Ra имело K_D приблизительно 0,33 нМ, константу ассоциации (K_a) приблизительно 2×105 M^-1 сек^-1 и константу диссоциации (K_d) приблизительно 6,6×10^-5 сек^-1. См. Фиг. 9B. Как показали наблюдения, гибридные домены цитокинов P01, P02, P03, P04 и P05 имели K_D в диапазоне приблизительно 12-1700 пМ, константу ассоциации (K_a) в диапазоне от приблизительно 3×10⁴ M^-1 сек^-1 до 3×10⁶ M^-1 сек^-1 и константу диссоциации (K_d) в диапазоне от приблизительно 2×10^-5 до 1×10^-3 сек^-1. См., например Фиг. 9C и 9D и Таблицу 7 ниже.

Таблица 7 Белок k_a (M^-1 сек^-1) K_d (сек^-1) K_D (пМ) IL-1β 1,47×10⁶ M^-1 сек^-1 2,95×10^-3 сек^-1 2010 IL-1Ra 2,01×10⁵ M^-1 сек^-1 6,58×10^-5 сек^-1 326 P01 4,93×10⁴ M^-1 сек^-1 2,32×10^-5 сек^-1 470 P02 3,39×10⁴ M^-1 сек^-1 2,16×10^-5 сек^-1 636 P03 4,1×10⁶ M^-1 сек^-1 1,2×10^-3 сек^-1 290 P04 3,00×10⁴ M^-1 сек^-1 5,14×10^-4 сек^-1 1714 P05 3,47×10⁶ M^-1 сек^-1 4,15×10^-5 сек^-1 12 P06 4,8×10⁶ M^-1 сек^-1 1,7×10^-3 сек^-1 410 P07 1,58×10⁴ M^-1 сек^-1 1,46×10^-3 сек^-1 92553

Пример 5

Дополнительные примерные гибридные белки семейства IL-1 также включают следующее:

P08 apvrslAFriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqge
esndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrf
vfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfy
mqfvss SEQ ID NO:32 P09 apvrsQAFriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqge
esndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrf
vfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfy
mqfvss SEQ ID NO:33 P10 apvrslAFriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekIDVsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfymqfvss SEQ ID NO:34 P11 apvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekIDVsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfymqfvss SEQ ID NO:35 P12 apvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfTmqfvss SEQ ID NO:36 P13 apvrslAFriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfyFQED SEQ ID NO:37 P14 apvrslNCriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfyFQED SEQ ID NO:38

Полипептид, указанный ниже, является гибридным доменом, который включает по меньшей мере два сегмента из IL-1α и по меньшей мере два сегмента из IL-1Ra.

SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYILENQA SEQ ID NO:39

Пример 6

Гибридный домен IL-1 с круговыми перестановками может быть сконструирован путем присоединения N-конца к С-концу молекулы с использованием линкерной последовательности и выбора новой локализации для каждого из концов. Для белков, имеющих концы, полученные от IL-1β, длина линкера может быть между пятью и десятью, например, приблизительно семь аминокислот. Предпочтительными локализациями для новых концов являются локализации в петлях, которые направлены в сторону от рецепторов, таких как петля β6-β7 (например, аминокислоты, соответствующие 71-80 SEQ ID NO:1) или петля β7-β8 (например, аминокислоты, соответствующие 84-99 SEQ ID NO:1).

Примеры таких гибридных доменов IL-1 с круговыми перестановками включают:

dkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfymqfvssggSgggSapvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkd (SEQ ID NO:40)

и

nypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvtkfymqfvssggsgggsapvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpk (SEQ ID NO:41)

Пример 7

Белки P03, P04, P05, mIL-1Ra (метионил IL-1Ra) и IL-1β были приготовлены в забуференном фосфатами физрастворе (ЗФФ), pH 7,4, при 0,5 мг/мл. Белки были соединены с оранжевым красителем SYPRO (Invitrogen, CA) при разведении исходной концентрации 1:500 и подвергнуты дифференциальной сканирующей флуориметрии. См., например, He et al. (2010) J. Pharm. Sciences, 99 1707-1720. Измерения флуоресценции прослеживали с использованием прибора Agilent Mx3005 QPCR при повышении температуры с 25°C до 95°C со скоростью 1°C в минуту. Значения температуры плавления (T_m) получали из максимального значения первого производного флуоресцентного перехода. По результатам наблюдения белки P03, P04 и P05 имели начало разворачивания более 50°C и достигающее 59°C, и T_m, большую чем 59, 60, 62 и 64°C. Результаты показаны в Таблице 8 ниже и на Фиг. 10A и 10B:

Таблица 8 Белок T_m (°C) Начало разворачивания (°C) mIL-1Ra 56 48 IL-1β 56 41 P03 65 59 P04 60 51 P05 65 59

P04 имеет T_m, которая приблизительно на 4 градуса выше, чем у mIL-1Ra и IL-1β, и демонстрирует начало разворачивания приблизительно на 3 градуса выше, чем mIL-1Ra и приблизительно на 10 градусов выше, чем IL-1β. P03 и P05 имеют T_m, которая приблизительно на 9 градусов выше, чем у mIL-1Ra и IL-1β, и демонстрирует начало разворачивания приблизительно на 11 градусов выше, чем mIL-1Ra и приблизительно на 18 градусов выше, чем IL-1β.

Пример 8

Очищенный P05 (с отсутствующей меткой гекса-гистидин) был приготовлен в 1,25x ЗФФ и протестирован на мышиной модели заболевания сухого глаза. В этой модели мышей-самок C57BL/6 возрастом от 6 до 10 недель из Jackson Laboratories (акклиматизированных в течение от 1 до 2 недель в комнате для содержания животных с относительной влажностью ≥30%, с пищевой добавкой гидрогелем и обогащением окружающей среды envirodry) были подвергнуты предварительному скринингу на окрашивание флуоресцеином в День 0. Для окрашивания флуоресцеином свежеприготовленный флуоресцеин, разведенный в Н₂О для инъекций при 10 мг/мл, вводился в дозе 0,4 мкл в каждый глаз. Приблизительно через 8-13 минут глаза оценивали в баллах с использованием флуоресцентной препаровальной лупы Olympus. Усиленное окрашивание записывалось с использованием стандартизированной системы оценок Национального Института Глаза (National Eye Institute (NEI)) от 0 до 3 для каждой из пяти зон, на которые была поделена поверхность роговицы (диапазон оценок от 0 до 15 на глаз). С использованием мостика обучения, два учетчика, проводящих маскированные оценки, оценивали мышь в одно и то же время для предоставления единичного коллективного балла для каждого глаза.

Мыши с количеством баллов ≤7 для каждого глаза (вне максимального балла, равного 15) помещались в камеру сухого глаза (влажность 20%±2% и постоянный поток воздуха ~21 л/мин/клетку) в день 1 и содержались в этой камере в течение эксперимента (кроме для исследования). В день 3 мышей снова оценивали в баллах и рандомизировали в группы лечения с от 8 до 10 мышей/группу. Мышей рандомизировали таким образом, что каждая клетка из от 4 до 5 мышей имела один и тот же средний балл заболевания. Начиная с дня 3 после рандомизаци•и мышам топически вводили P05 или носитель (1,25X ЗФФ) в глазной капле при 3 мкл/глаз с частотой дважды в день. Мышей исследовали и оценивали в баллах в дни 7, 9 и 11 в отношении окрашивания роговицы флуоресцеином, как описано выше. В течение эксперимента баллы были маскированы в отношении групп лечения.

Фиг. 11A является столбиковой диаграммой среднего балла окрашивания роговицы ± стандартная ошибка среднего в день 0, 3, 7, 9 и 11 для мышей из двух идентичных экспериментов при следующих лечениях дважды в день: без лечения, носитель (1,25X ЗФФ) и 10 мг/мл (1%) P05. 10 мг/мл P05 значительно понижали окрашивание роговицы в дни эксперимента 7, 9 и 11. Эффективность, как было оценено по снижению окрашивания роговицы, также наблюдалась даже с дозами до 0,1 мг/мл P05. Рекомбинантный IL-1Ra, продуцируемый в E. coli, также умеренно снижал окрашивание роговицы в модели на животных.

Как показано на Фиг. 11B, эффект 10 мг/мл P05 был специфически основан на сравнении с 10 мг/мл мышиного сывороточного альбумина в том же носителе. Никакого эффекта не наблюдалось с 10 мг/мл мышиного сывороточного альбумина (МСА) по отношению к носителю, и эффект 10 мг/мл P05 был статистически значимым по отношению к 10 мг/мл мышиного сывороточного альбумина. Как показано на Фиг. 11C, 10 мг/мл P05 также сравнивали с 0,05% циклоспорином в офтальмологической эмульсии (Restasis®). В то время как P05 снижал окрашивание роговицы, никакого эффекта не наблюдалось для 0,05% офтальмологической эмульсии циклоспорина через ~1 неделю после дозирования дважды в день.

Пример 9

Для очистки P05, продуцируемого путем ферментации в клетках BLR(DE3) E. coli, был разработан этап получения. Были определены условия элюирования путем статистического расчета экспериментального подхода (РЭП) на 1 мл колонку. Оптимизированные условия выполнялись на промежуточной шкале (10 мл колонка).

Продукт экстрагируют путем микрофлюидизации в лизирующем буфере, состоящем из 20 мМ Tris при pH 7,0 с добавлением 10 мМ ЭДТА. Осветленный лизат доводится до pH 5,3 и проводимости 3 мС/см. Кондиционированный лизат нагружается на PorosXS (сильная катионообменная смола) со временем удержания 2 мин на колонку с емкостью 25-30 мг P05/мл. Колонка промывается равновесным буфером для удаления популяции примесей. Выполняется второе промывание при pH 6,0 и 3 мС/см для удаления популяции примесей. Продукт элюируется при pH 6,0 и 6,6 мС/см. Виды, относящиеся к продукту, элюируются при pH 6,0 и 12,4 мС/см. Колонка очищается буфером с высоким содержанием солей и NaOH.

P05 является белком 17 кДа с pI 6,58. Значение pI видов des-ALA равно 6,8, и это легко решается аналитической слабокатионообменной хроматографией. Эти виды, по-видимому, являются продуктом активности аминопептидазы P, обнаруживаемой в E. coli. Эти виды могут быть идентифицированы способами масс-спектроскопии, пептидного картирования и ВЭЖХ.

Хроматографические материалы. PorosXS основан на шариках из перекрестно-сшитого поли(стирол-дивинилбензола) с номинальным размером частицы 50 мкм. Хроматографическая матрица обладает химией сульфопропиловой поверхности и была разработана с тем, чтобы допускать повышенные уровни соли во время связывания. Материал для PorosXS (CN 4404339, Life Technologies) был приобретен в виде объемного сорбента и упакован в 5×50 мм колонки Tricorn (CN 28-4064-09, GE Healthcare) с конечным объемом колонки 1 мл (высота слоя 5 см) или в 10×150 мм колонки Tricorn (CN 28-4064-16, GE Healthcare), упакованные до окончательного объема 10,5 мл (высота слоя 13,4 см).

Буферы. Все буферы готовили с водой MilliQ объемным способом. Для достижения желаемого pH для титрования буфера добавляли либо 10 н HCl либо 1 M NaOH (приготовленного из исходного раствора 10 M NaOH). После приготовления все буферы титровали через 0,2-мкм полиэтилсульфоновые фильтры. Все измерения рН и проводимости проводили при комнатной температуре (~20-25ºC).

Буферы PorosXS: Равновесный буфер КОХ - 10 мМ уксусной кислоты (HoAC) с 21 мМ NaCl готовили путем добавления 0,57 мл ледяной уксусной кислоты и 2,44 г NaCl на литр буфера. Конечная рН составляла 5,3, и конечная проводимость была 3 мС/см.

Промывочный буфер КОХ - 100 мМ MOPS с 22 мМ NaCl готовили путем добавления 19,5 г свободной кислоты MOPS, 1,5 г натриевой соли MOPS и 1,28 г NaCl на литр буфера. Конечная рН составляла 5,7-6,6 (как требовалось), и конечная проводимость была 3 мС/см.

Элюирующий буфер КОХ - 100 мМ MOPS с 118 мМ NaCl готовили путем добавления 19,5 г свободной кислоты MOPS, 1,5 г натриевой соли MOPS и 6,93 г NaCl на литр буфера. Конечная рН составляла 5,7-6,6 (как требовалось), и конечная проводимость была 12,4 мС/см.

Десорбирующий буфер КОХ - 10 мМ уксусной кислоты с 3 M NaCl готовили путем добавления 0,57 мл ледяной уксусной кислоты и 175 г NaCl на литр буфера. Конечная рН составляла 5,3, и конечная проводимость была 188 мС/см.

Приготовление лизата. рН лизата доводили, используя 200 мМ уксусную кислоту при pH 4,5, приготовленную путем смешивания 11,5 мл ледяной уксусной кислоты на литр буфера. Раствор титровали до конечной рН 4,5, используя 1 M NaOH. Этот раствор использовали, чтобы избежать локализированного осаждения из-за низкой рН концентрированных или сильных кислот.

Нагрузочным материалом для этих экспериментов служил экстракт из цикла биореактора с 2-литровой подпиткой. Экстракция продукта из клеточного осадка проводилась с использованием 20 мМ Tris при pH 7,0 с добавлением 10 мМ ЭДТА. Свежий экстракт разводили до проводимости 3 мС/см водой MilliQ (как правило, разведение 1:1-1,5). Разведенный экстракт замораживали при -20°C в аликвотах по 41 мл. Для приготовления нагрузки аликвоту размораживали при комнатной температуре и титровали до рН 5,3, используя 200 мМ уксусную кислоту при pH 4,5. Небольшие доводки проводимости после титрования выполняли путем добавления воды MilliQ, когда это было необходимо. В конечном счете, нагрузка была разведена 2,5× до концентрации ~1,7 г/л, используя равновесный буфер КОХ. Нагрузку подвергали стерильному фильтрованию через фильтр 0,8/0,2 мкм. Кондиционированная нагрузка была использована в тот же день, когда она была приготовлена.

Определение белка клетки-хозяина. Уровни белка клетки-хозяина (БКХ) определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа (ИФА), специфичного для экспрессирующей E. coli (CN F410, Cygnus Technologies). Протокол, поставляемый с набором, выполнялся в точности. Образцы, которые намеревались оценивать на уровни БКХ, разводили, используя разбавитель образца (CN I028, Cygnus Technologies) с минимальным разведением 10×. Образцы обычно исследовали в двух разведениях, и для каждого разведения наносили на планшет в дубликате. Уровни БКХ представлены в значениях частей на миллион (parts per million (ppm)) или нг-БКХ/мг-продукта.

Анализ способом ДСН-ПААГ электрофореза. Для анализа чистоты способом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) использовали, соответственно, либо 1 мМ×10 лунок, либо 1 мМ×15 лунок 4-12% BisTris гели NuPAGE (соответственно, CN NP0322Box и NP0323Box, Invitrogen). Электродным буфером является 1× 2-N-морфолиноэтансульфоновая кислота (MES) ДСН, приготовленным из 20× концентрата (CN NP0002, Invitrogen). Предварительно окрашенные стандарты белка Novex sharp (CN 57318, Invitrogen) используются в качестве индикаторов молекулярного веса. Образцы для анализа готовили путем разбавления водой MilliQ до конечного объема 30 мкл и 10 мкл 4× додецил сульфат лития (ДСЛ) (CN NP0008, Invitrogen) было добавлено до конечной концентрации 1×. Образцы перемешивали с помощью вортекса в течение 5 сек. На основе рассчитанной из измерения A280/A320 концентрации белка был нанесен таргетный объем в 3 мкг на лунку.

сКОХ. P05 оценивалась в слабокатионообменной хроматографии (сКОХ) с использованием колонки Dionex ProPac® WCX-10 4×250 мМ (Product Number 054993), со скоростью потока 1,2 мл/мин с использованием растворов мобильной фазы 10 мМ ацетата натрия pH 5,5 (буфер A) и 10 мМ ацетата натрия pH 5,5, 250 мМ NaCl (буфер B). Градиент выполняется от 10%B до 25%B в течение 20 минут. Интактный P05 элюимуется приблизительно через от 1,5 до 2,5 минут перед видами des-Ala в более поздней части градиента.

Катионообменная захватная хроматография. Хромаграфия проводилась на хроматографической системе AKTA Explorer 100. Была упакована 10-мл колонка PorosXS. Материал был нагружен при 40 мг P05/мл, или мог быть нагружен при 25-30 мг P05/мл. Хроматографический способ суммирован в Таблице 9. Время удержания сохранялось постоянным во время этапов нагрузки и элюирования и составляло 2 мин. Были сделаны пробные пулы элюции и проверены на выход продукта, уровень БКХ и % интактного белка. Всего было выполнено 2 пробега на 10-мл колонке с % B в 30% и 35% при pH 6,0.

Таблица 9 Этап Объемы колонок (ОК) Буфер Уравновешивание 10 10 мМ HoAC+21 мМ NaCl pH 5,3 Нагрузка 40 Кондиционированный лизат,
3 мС/см pH 5,3 Промывание № 1 5-10 10 мМ HoAC+21 мМ NaCl pH 5,3 Промывание №2 9-10 100 мМ MOPS+22 мМ NaCl pH 6,0
(3 мС/см) Элюирование №1 30 100 мМ MOPS+22 мМ NaCl pH 6,0
(3 мС/см) смешанные с 30-35%
100 мМ MOPS+118 мМ NaCl pH 6,0 Элюирование № 2 6 100 мМ MOPS+118 мМ NaCl pH 6,0 Снятие 5-6 10 мМ HoAC+3 M NaCl pH 5,3 Очистка 20 1 M NaOH Нейтрализация (NaCl) 10 100 мМ MOPS+118 мМ NaCl pH 6,0 Повторное уравновешивание 20 10 мМ HoAC+21 мМ NaCl pH 5,3

Промывание № 2 приводит в результате к пику, состоящему, в основном, из примесей. Элюирования № 1 с 30% и 35% B приводят в результате к >95% чистому продукту по данным анализа в ДСН-ПААГ электрофорезе. Концентрация соли Промывания № 2 может быть увеличена на небольшое количество для удаления плеча пика элюции.

Пример 10

P04 был очищен и кристаллы дифракционного качества были выращены в 25% ПЭГ1500, 0,1 M полихлорбифениле (ПХБ) (pH 4,0) при 20ºC. Белок кристаллизовался в пространственной группе P2₁2₁2₁, с типичными постоянными решетками a=44,5, b=46,4, c=64,8. Кристаллы дифрагировали до высокого разрешения и был собран набор данных, распространяющихся до 1,47 Å, на источнике фотонов Advanced Photon Source, канал синхронного излучения LS-CAT 21ID-F (Chicago IL, USA). Рентгеновская структура P04 была решена путем молекулярной замены с использованием модели, включающей релевантные части известных структур IL-1β и IL-1Ra из структур базы данных белков (БДБ) 1ITB и 1IRA (Vigers et al., (1997) Nature 386:190-194 и Schreuder et al., (1997) Nature 386:194-200). Окончательная модель была уточнена до Rраб./Rсвоб. 17,6%/20,4% и содержит одну молекулу P04 (140 остатков) и 98 молекул воды (Таблица 10). Остатки P04 1-2, 48-49 и 85-93 были невидимы в электронной плотности, и они отсутствуют в окончательной модели.

Таблица 10 Набор данных кристаллографии и статистика детализации Статистика набора данных
Пространственная группа
Постоянные решетки
a, b, c (Å)
α, β, γ (°)
Длина волны (Å)
Разрешение (Å)
Rслияния
I/σI
Полнота (%)
Неопределенность
Статистика детализации
Разрешение (Å)
Кол-во отражений
Rраб./Rсвобод
Среднее B (Å)
Среднее квадратичное отклонение длин (Å)
Среднее квадратичное отклонение углов связи (°) P2₁2₁2₁
44,5; 46,4; 64,8
90, 90, 90
0,9787
50,0-1,47 (1,52-1,47)
0,039 (0,56)
37,7 (2,9)
99,8 (100)
6 (5,9)
28,64-1,47 (1,53-1,47)
22926
17,6/20,4
22,3
0,007
1,137 Числа в круглых скобках указывают на наивысшую оболочку разрешения
Rслиян=∑_изл [∑i│I_i - <I>│/∑_iI_i]
R_раб.=∑_изл ǁ F_набл│-│F_расч ǁ/∑_изл│F_набл│, где F_набл и F_расч являются наблюдаемыми и расчетными структурными факторами.
Rсвоб. был расчитан из поднабора отражений (5%), не использованных для детализации.

Кристаллическая структура P04 имеет складку, подобную той, которая предсказывалась моделированием. Вид данной структуры указан на Фиг. 1. Наложение двух структур показано на Фиг. 12A. Среднее квадратичное отклонение для углеродов остова равнялось 1,41 Å и 1,09 Å для сегментов IL-1β и IL-1Ra, по сравнению с теми же остатками в соответствующих родительских молекулах. P04 имеет по меньшей мере один уникальный солевой мостик и две уникальных водородных связи, которые приводят к взаимодействию между остатком, происходящим из IL-1β, и противной стороной, происходящей из IL-1Ra: (i) Glu39-Lys64 (Glu39 из IL-1RA; Lys64 из IL-1β), как показано на Фиг.12B, (ii) Arg9-Gln149 (Arg9 из IL-1RA; Gln149 из IL-1β), как показано на Фиг. 12C, и (iii) Ser152-Lys40 (Ser152 из IL-1RA; Lys50 из IL-1β), как показано на Фиг. 12C. Эти уникальные взаимодействия могут объяснить повышенную термальную стабильность P04, так как эти взаимодействия отсутствуют в структурах IL-1β и IL-1Ra. Остатки, вовлеченные в эти взаимодействия, также присутствуют в P03 и P05, в белках, которые, подобным образом, обладают повышенной термальной стабильностью.

Другие варианты воплощения охватываются обьемом следующих пунктов формулы изобретения.

--->

Список последовательностей

<110> ИЛЭВЭН БАЙОТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.

<120> АГОНИСТЫ И АНТАГОНИСТЫ ГИБРИДНОГО РЕЦЕПТОРА IL-1 I ТИПА

<130> D2046-7025WO

<140> PCT/US2011/045995

<141> 2011-07-29

<150> 61/493,966

<151> 2011-06-06

<150> 61/493,967

<151> 2011-06-06

<150> 61/436,184

<151> 2011-01-25

<150> 61/436,178

<151> 2011-01-25

<150> 61/368,799

<151> 2010-07-29

<160> 58

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys

1 5 10 15

Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln

20 25 30

Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln

35 40 45

Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu

50 55 60

Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu

85 90 95

Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe

100 105 110

Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu

115 120 125

Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr

130 135 140

Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 2

<211> 159

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg

1 5 10 15

Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile

20 25 30

Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu

35 40 45

Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp

50 55 60

Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met Pro

85 90 95

Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe

100 105 110

Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His Pro

115 120 125

Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp Val Cys Leu Ala Gly

130 135 140

Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gln Ile Leu Glu Asn Gln Ala

145 150 155

<210> 3

<211> 151

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp

1 5 10 15

Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala

20 25 30

Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val

35 40 45

Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys

50 55 60

Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu

65 70 75 80

Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys

85 90 95

Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp

145 150

<210> 4

<211> 160

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu

1 5 10 15

Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser

20 25 30

Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys

35 40 45

Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly

50 55 60

Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys

65 70 75 80

Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His

85 90 95

Lys Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn

100 105 110

Met His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val

115 120 125

Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser

130 135 140

Ser Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr

145 150 155 160

<210> 5

<211> 154

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

Val Leu Ser Gly Ala Leu Cys Phe Arg Met Lys Asp Ser Ala Leu Lys

1 5 10 15

Val Leu Tyr Leu His Asn Asn Gln Leu Leu Ala Gly Gly Leu His Ala

20 25 30

Gly Lys Val Ile Lys Gly Glu Glu Ile Ser Val Val Pro Asn Arg Trp

35 40 45

Leu Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Ile Leu Gly Val Gln Gly Gly Ser

50 55 60

Gln Cys Leu Ser Cys Gly Val Gly Gln Glu Pro Thr Leu Thr Leu Glu

65 70 75 80

Pro Val Asn Ile Met Glu Leu Tyr Leu Gly Ala Lys Glu Ser Lys Ser

85 90 95

Phe Thr Phe Tyr Arg Arg Asp Met Gly Leu Thr Ser Ser Phe Glu Ser

100 105 110

Ala Ala Tyr Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Val Pro Glu Ala Asp Gln

115 120 125

Pro Val Arg Leu Thr Gln Leu Pro Glu Asn Gly Gly Trp Asn Ala Pro

130 135 140

Ile Thr Asp Phe Tyr Phe Gln Gln Cys Asp

145 150

<210> 6

<211> 158

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Glu Lys Ala Leu Lys Ile Asp Thr Pro Gln Gln Gly Ser Ile Gln

1 5 10 15

Asp Ile Asn His Arg Val Trp Val Leu Gln Asp Gln Thr Leu Ile Ala

20 25 30

Val Pro Arg Lys Asp Arg Met Ser Pro Val Thr Ile Ala Leu Ile Ser

35 40 45

Cys Arg His Val Glu Thr Leu Glu Lys Asp Arg Gly Asn Pro Ile Tyr

50 55 60

Leu Gly Leu Asn Gly Leu Asn Leu Cys Leu Met Cys Ala Lys Val Gly

65 70 75 80

Asp Gln Pro Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Asp Ile Met Asp Leu Tyr

85 90 95

Asn Gln Pro Glu Pro Val Lys Ser Phe Leu Phe Tyr His Ser Gln Ser

100 105 110

Gly Arg Asn Ser Thr Phe Glu Ser Val Ala Phe Pro Gly Trp Phe Ile

115 120 125

Ala Val Ser Ser Glu Gly Gly Cys Pro Leu Ile Leu Thr Gln Glu Leu

130 135 140

Gly Lys Ala Asn Thr Thr Asp Phe Gly Leu Thr Met Leu Phe

145 150 155

<210> 7

<211> 157

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Asn Pro Gln Arg Glu Ala Ala Pro Lys Ser Tyr Ala Ile Arg Asp

1 5 10 15

Ser Arg Gln Met Val Trp Val Leu Ser Gly Asn Ser Leu Ile Ala Ala

20 25 30

Pro Leu Ser Arg Ser Ile Lys Pro Val Thr Leu His Leu Ile Ala Cys

35 40 45

Arg Asp Thr Glu Phe Ser Asp Lys Glu Lys Gly Asn Met Val Tyr Leu

50 55 60

Gly Ile Lys Gly Lys Asp Leu Cys Leu Phe Cys Ala Glu Ile Gln Gly

65 70 75 80

Lys Pro Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Asn Ile Met Asp Leu Tyr Val

85 90 95

Glu Lys Lys Ala Gln Lys Pro Phe Leu Phe Phe His Asn Lys Glu Gly

100 105 110

Ser Thr Ser Val Phe Gln Ser Val Ser Tyr Pro Gly Trp Phe Ile Ala

115 120 125

Thr Ser Thr Thr Ser Gly Gln Pro Ile Phe Leu Thr Lys Glu Arg Gly

130 135 140

Ile Thr Asn Asn Thr Asn Phe Tyr Leu Asp Ser Val Glu

145 150 155

<210> 8

<211> 169

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Arg Gly Thr Pro Gly Asp Ala Asp Gly Gly Gly Arg Ala Val Tyr

1 5 10 15

Gln Ser Met Cys Lys Pro Ile Thr Gly Thr Ile Asn Asp Leu Asn Gln

20 25 30

Gln Val Trp Thr Leu Gln Gly Gln Asn Leu Val Ala Val Pro Arg Ser

35 40 45

Asp Ser Val Thr Pro Val Thr Val Ala Val Ile Thr Cys Lys Tyr Pro

50 55 60

Glu Ala Leu Glu Gln Gly Arg Gly Asp Pro Ile Tyr Leu Gly Ile Gln

65 70 75 80

Asn Pro Glu Met Cys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Gly Glu Gln Pro Thr

85 90 95

Leu Gln Leu Lys Glu Gln Lys Ile Met Asp Leu Tyr Gly Gln Pro Glu

100 105 110

Pro Val Lys Pro Phe Leu Phe Tyr Arg Ala Lys Thr Gly Arg Thr Ser

115 120 125

Thr Leu Glu Ser Val Ala Phe Pro Asp Trp Phe Ile Ala Ser Ser Lys

130 135 140

Arg Asp Gln Pro Ile Ile Leu Thr Ser Glu Leu Gly Lys Ser Tyr Asn

145 150 155 160

Thr Ala Phe Glu Leu Asn Ile Asn Asp

165

<210> 9

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val

1 5 10 15

Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val

20 25

<210> 10

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 10

Asn Leu Glu Glu Lys

1 5

<210> 11

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 11

Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln

1 5 10 15

Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys

20 25 30

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro

1 5

<210> 13

<211> 28

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn

1 5 10 15

Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr

20 25

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile

1 5 10

<210> 15

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 15

Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe

1 5

<210> 16

<211> 73

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro

1 5 10 15

Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu

20 25 30

Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn

35 40 45

Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu

50 55 60

Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser

65 70

<210> 17

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

"

<400> 17

Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile His Gly Gly

50 55 60

Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ala Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Asp Lys

85 90 95

Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 18

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 18

Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile His Gly Gly

50 55 60

Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ala Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Ser Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 19

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 19

Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 20

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 20

Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 21

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 21

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 22

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 22

Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp

1 5 10

<210> 23

<211> 152

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 23

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp

130 135 140

Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 24

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 24

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Gln Asp Ile Thr

130 135 140

Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 25

<211> 459

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 25

gcacctgtac gatcactggc cttcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60

aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120

atagatgtgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180

atccatggag ggaagatgtg cctgtcctgt gtcaagtctg gtgatgagac cagactccag 240

ctggaggcag ttgatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggacaagcg cttcgccttc 300

atccgctcag acagcggccc caccaccagt tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc 360

ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420

gtcatggtca ccaaattcta catgcaattt gtgtcttcc 459

<210> 26

<211> 459

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 26

gcacctgtac gatcactggc cttcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60

aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120

atagatgtgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180

atccatggag ggaagatgtg cctgtcctgt gtcaagtctg gtgatgagac cagactccag 240

ctggaggcag ttgatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300

aacaagatag aaatcaataa caagctgagt tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc 360

ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420

gtcatggtca ccaaattcta catgcaattt gtgtcttcc 459

<210> 27

<211> 459

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 27

gcacctgtac gatcactggc cttcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60

aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120

ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180

ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240

ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300

atccgctcag acagcggccc caccaccagt tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc 360

ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420

gtcatggtca ccaaattcac catgcaattt gtgtcttcc 459

<210> 28

<211> 459

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 28

gcacctgtac gatcactggc cttcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60

aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120

ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180

ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240

ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300

aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc 360

ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420

gtcatggtca ccaaattcac catgcaattt gtgtcttcc 459

<210> 29

<211> 459

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 29

gcacctgtac gatcactgaa ctgcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60

aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120

ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180

ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240

ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300

aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg cccagttccc caactggttc 360

ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420

gtcatggtca ccaaattcta catgcaattt gtgtcttcc 459

<210> 30

<211> 456

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 30

gcacctgtac gatcactgaa ctgcacgctc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60

aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcgagca acaagtggtg 120

ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180

ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240

ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300

aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg cccagttccc caactggtac 360

atcagcacct ctatggaagc tgaccagccc gtcttcctgg gagggaccaa aggcggccag 420

gatataactg acttcaccat gcaatttgtg tcttcc 456

<210> 31

<211> 459

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 31

gcacctgtac gatcactgaa ctgcagaatc tgggatgtta accagaagac cttctatctg 60

aggaacaacc aactagttgc tggatacttg caaggaccaa atgtcaattt agaagaaaag 120

ttctccatgt cctttgtaca aggagaagaa agtaatgaca aaatacctgt ggccttgggc 180

ctcaaggaaa agaatctgta cctgtcctgc gtgttgaaag atgataagcc cactctacag 240

ctggagagtg tagatcccaa aaattaccca aagaagaaga tggaaaagcg atttgtcttc 300

aacaagatag aaatcaataa caagctggaa tttgagtctg cccagttccc caactggttc 360

ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc 420

caggatataa ctgacttcac catgcaattt gtgtcttcc 459

<210> 32

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 32

Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 33

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 33

Ala Pro Val Arg Ser Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 34

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 34

Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 35

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 35

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 36

<211> 153

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 36

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser

145 150

<210> 37

<211> 151

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 37

Ala Pro Val Arg Ser Leu Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp

145 150

<210> 38

<211> 151

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 38

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys

1 5 10 15

Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly

20 25 30

Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys

50 55 60

Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys

85 90 95

Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp

145 150

<210> 39

<211> 165

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 39

Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg

1 5 10 15

Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe

20 25 30

Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn

35 40 45

Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys

50 55 60

Asp Asp Ala Lys Ile Thr Val Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gln Leu

65 70 75 80

Tyr Val Thr Ala Gln Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys Glu Met

85 90 95

Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe

100 105 110

Phe Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Val Ala His

115 120 125

Pro Asn Leu Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser

130 135 140

Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Ile

145 150 155 160

Leu Glu Asn Gln Ala

165

<210> 40

<211> 160

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 40

Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro

1 5 10 15

Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn

20 25 30

Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Phe Leu Cys

35 40 45

Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp

50 55 60

Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val Ser Ser Gly

65 70 75 80

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Arg Ile

85 90 95

Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val

100 105 110

Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Phe Ser

115 120 125

Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala

130 135 140

Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp

145 150 155 160

<210> 41

<211> 160

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<400> 41

Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile

1 5 10 15

Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp

20 25 30

Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn

35 40 45

Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Met Gln Phe Val

50 55 60

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn

65 70 75 80

Cys Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn

85 90 95

Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu

100 105 110

Lys Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile

115 120 125

Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val

130 135 140

Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys

145 150 155 160

<210> 42

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетическая метка 6xHis

<400> 42

His His His His His His

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 43

Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 44

Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser

1 5

<210> 45

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 45

Arg Ser Leu Ala Phe Arg

1 5

<210> 46

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 46

Ile Asp Val Ser Phe Val

1 5

<210> 47

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 47

Lys Lys Met Asp Lys Arg

1 5

<210> 48

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 48

Lys Phe Tyr Met Gln Phe

1 5

<210> 49

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 49

Asn Lys Leu Ser Phe Glu

1 5

<210> 50

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 50

Glu Glu Lys Phe Ser Met

1 5

<210> 51

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 51

Arg Phe Val Phe Ile Arg

1 5

<210> 52

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 52

Val Thr Lys Phe Thr Met

1 5

<210> 53

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 53

Phe Glu Ser Ala Ala Cys

1 5

<210> 54

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 54

Val Thr Lys Phe Thr Met

1 5

<210> 55

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 55

Leu Asn Cys Arg Ile Trp

1 5

<210> 56

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 56

Pro Asn Trp Phe Leu Cys

1 5

<210> 57

<211> 141

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Источник

<223> Синтетический полипептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(3)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(14)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(14)

<223> Эта область может содержать от 8 до 9 остатков

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(18)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(49)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(49)

<223> Эта область может содержать от 8 до 9 остатков

<220>

<221> MOD_RES

<222> (52)..(58)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (63)..(65)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (67)..(69)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (74)..(74)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (76)..(84)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(84)

<223> Эта область может содержать от 8 до 9 остатков

<220>

<221> MOD_RES

<222> (86)..(87)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (91)..(91)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (93)..(102)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (107)..(108)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (110)..(110)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (112)..(114)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (116)..(121)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (124)..(124)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (126)..(131)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> misc_feature

<222> (126)..(131)

<223> Эта область может содержать от 5 до 6 остатков

<220>

<221> MOD_RES

<222> (133)..(135)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (137)..(137)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (139)..(140)

<223> Любая аминокислота

<400> 57

Asp Xaa Xaa Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala

1 5 10 15

Xaa Xaa Leu Gln Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

35 40 45

Xaa Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ser Cys Val Xaa Xaa

50 55 60

Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Leu Gln Leu Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

65 70 75 80

Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Lys Arg Phe Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa

85 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Glu Ser Ala Xaa Xaa Pro Xaa Trp Xaa

100 105 110

Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Val Xaa Leu Xaa Xaa Xaa

115 120 125

Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Phe Xaa Xaa Gln

130 135 140

<210> 58

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 58

Ala Pro Val Arg Ser

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим белкам на основе химерных доменов белков семейства интерлейкина-1 (IL-1), и может быть использовано в медицине для лечения аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или рака, а также для лечения индивида, страдающего сухим глазом или аллергическим конъюнктивитом или имеющим риск развития указанной патологии. На основе доменов IL-1бета и IL-1Ra сконструирован химерный белок. Изобретение позволяет получить белок, который связывается с рецептором I IL-1 (IL-1RI) и ингибирует его активность. 13 н. и 32 з.п. ф-лы, 12 ил., 10 табл., 10 пр.

1. Выделенный белок, который связывается с рецептором I IL-1 (IL-1RI) и ингибирует активность рецептора I IL-1 (IL-1RI), и который содержит химерный домен цитокина семейства интерлейкина-1 (IL-1), где домен цитокина имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:21.

2. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:17.

3. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:18.

4. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:19.

5. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:20.

6. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:21.

7. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:17.

8. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:18.

9. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:19.

10. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:20.

11. Белок по п.1, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID NO:21.

12. Белок по п.1, где белок имеет 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 замены относительно SEQ ID NO:17.

13. Белок по п.1, где белок имеет 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 замены относительно SEQ ID NO:18.

14. Белок по п.1, где белок имеет 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 замены относительно SEQ ID NO:19.

15. Белок по п.1, где белок имеет 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 замены относительно SEQ ID NO:20.

16. Белок по п.1, где белок имеет 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 замены относительно SEQ ID NO:21.

17. Белок по п.1, где белок идентичен SEQ ID NO:17.

18. Белок по п.1, где белок идентичен SEQ ID NO:18.

19. Белок по п.1, где белок идентичен SEQ ID NO:19.

20. Белок по п.1, где белок идентичен SEQ ID NO:20.

21. Белок по п.1, где белок идентичен SEQ ID NO:21.

22. Белок по любому из пп.1-21, где белок имеет большую термостабильность, чем IL-1β и IL-1Ra.

23. Белок по любому из пп.1-22, где T_m белка по меньшей мере на 2 градуса больше, чем T_m IL-1β и IL-1Ra.

24. Белок по любому из пп.1-23, где белок имеет T_m по меньшей мере 58°C.

25. Белок по любому из пп.1-24, где IC₅₀ белка меньше чем 10 нг/мл для ингибирования IL-1β (при 0,1 нг/мл) в клеточном тесте на передачу сигнала.

26. Белок по любому из пп.1-25, где белок не начинает разворачиваться по меньшей мере до 50°C.

27. Белок по любому из пп.1-26, где белок имеет большую термостабильность, чем IL-1β и IL-1Ra в физиологическом буфере или в фосфатно-физиологическом растворе.

28. Белок по любому из пп.1-27, где белок связывается с IL-1RI с большей аффинностью K_D, меньшей скоростью диссоциации и/или более быстрой скоростью ассоциации, чем человеческий IL-1Ra.

29. Белок по любому из пп.1-28, где белок связывает IL-1RI с K_D менее чем 5 нМ.

30. Белок по любому из пп.1-29, где белок дополнительно содержит гекса-гистидиновую метку.

31. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунного заболевания у индивида, содержащая терапевтически эффективное количество белка по любому из пп.1-30 и фармацевтически приемлемый носитель.

32. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания у индивида, содержащая терапевтически эффективное количество белка по любому из пп.1-30 и фармацевтически приемлемый носитель.

33. Фармацевтическая композиция по п.31 или 32, где фармацевтическая композиция составлена для парентерального, офтальмологического или местного введения.

34. Фармацевтическая композиция по любому из пп.31-33, где фармацевтическая композиция является водной и содержит белок в концентрации от 0,001 до 5%.

35. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.31-34 для лечения аутоиммунного заболевания у индивида.

36. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.31-34 для лечения воспалительного заболевания у индивида.

37. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.31-34 для лечения рака у индивида.

38. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.31-34 для лечения индивида, страдающего системным аутоиммунным заболеванием или имеющим риск его развития.

39. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.31-34 для лечения индивида, страдающего сухим глазом или имеющим риск его развития.

40. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.31-34 для лечения индивида, страдающего аллергическим конъюнктивитом или имеющим риск его развития.

41. Выделенная нуклеиновая кислота кодирующую белок по любому из пп.1-30.

42. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.41, который функционально связан с последовательностью, контролирующей транскрипцию.

43. Рекомбинантная клетка-хозяин для продукции белка, где клетка-хозяин содержит вектор по п.42.

44. Клетка-хозяин по п.43, где клетка-хозяин является клеткой-хозяином E. coli.

45. Способ получения рекомбинантного белка, который содержит химерный домен цитокина семейства интерлейкина-1 (IL-1) и связывается с рецептором I IL-1 (IL-1RI) и ингибирует активность рецептора I IL-1 (IL-1RI), где способ включает:

культивирование клетки-хозяина по п.43 или 44 в условиях, при которых возможна экспрессия рекомбинантного белка;

очистку рекомбинантного белка от клеточного лизата или клеточной среды.