СТИМУЛЯТОР РОСТА Yersinia pseudotuberculosis Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 C12N1/10 C12N1/38 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам культивирования бактерий Yersinia pseudotuberculosis.

Бактерии Yersinia pseudotuberculosis являются возбудителями острого инфекционного заболевания, характеризующегося полиморфизмом клинических проявлений с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, кожи и опорно-двигательного аппарата. В течение длительного времени в середине XX в. эпидемический характер заболеваемости псевдотуберкулезом на Дальнем Востоке дал основание для описания его в качестве «дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки». Однако выраженные адаптационные свойства возбудителя Yersinia pseudotuberculosis привели к широкому распространению этой инфекции не только по всей территории России, но и по странам ближнего зарубежья и Скандинавии.

В последние десятилетия, несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенеза и создании новых методов диагностики кишечного и экстратестинальных (псевдотуберкулеза) иерсиниозов, актуальность указанных инфекций сохраняется. В связи с этим разработка стимуляторов роста этих бактерий способствует быстрой и правильной диагностики заболеваний псевдотуберкулезом.

Известно использование питательной среды Хоттингера, которая является основой для культивирования иерсиний, в качестве стимуляторов роста веществ, входящих в состав гидролизатов мяса (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./Под ред. М.О.Биргера, М., 1967, с.53-54).

Недостатком этих стимуляторов роста является использование дорогостоящих пищевых продуктов, на качество которых оказывают влияние негативные факторы среды, в которой выращиваются животные, трудоемкость и длительность изготовления, а также необходимость внесения их в среду в значительных количествах.

Известен стимулятор роста микроорганизмов рода Yersinia (Y.pestis и Y.pseudotuberculosis (шт. И-199)) - дрожжевой автолизат (50 г/л) или ферментативный гидролизат пекарских дрожжей (350-380 г/л), который служит питательной основой, содержащей вещества, обладающие ростстимулирующими свойствами (патент РФ №2360962 C2, C12N1/20, опубл.10.07.2009).

Недостатком данных стимуляторов роста является то, что они вносятся в среду в больших количествах, дорогостоящи и трудоемки в способе получения, в котором используется ферментный комплекс, выделенный из отхода производства холерной вакцины. Кроме того, эти стимуляторы имеют узкий спектр действия.

Известен стимулятор роста Yersinia pestis на основе эмбриональных и внезародышевых тканей куриного яйца. При добавлении его в производственные питательные среды (агар Хоттингера и водно-сывороточную среду) можно получить максимальный прирост бакмассы при минимальных его дозировках (3 мг/л) без изменения основной рецептуры традиционных питательных сред (Панова Н.В. Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий. - Автореф. канд. дисс., 2006, с.11).

Недостатком указанного стимулятора является то, что он вносится дополнительно в дорогостоящие питательные среды, уже содержащие факторы роста, а также сложность его получения (комплекс технологических приемов включает инкубацию куриного яйца 8 дней, облучение куриного эмбриона лазером на 5, 6, 7 и 8-й день инкубации для увеличения массы эмбриона и его печени, необходимость выдерживания эмбрионов при 2-4°С не менее 7 суток и т.д.). Кроме того, яйцо нельзя отнести к подходящему сырью для получения стимулятора роста, поскольку оно может содержать побочные вещества (антибиотики, гормоны и др.).

Наиболее близким к заявляемому стимулятору роста Yersinia pseudotuberculosis можно отнести летучие метаболиты сапрофитных бактерий почв. Наибольшую стимулирующую активность на рост псевдотуберкулезных бактерий оказывали летучие метаболиты бактерий рода Aeromonas (Сидоренко М.Л. Влияние абиотических и биотических факторов почвенных экосистем на рост и размножение патогенной микрофлоры. - Дисс. канд. биол. наук, с.101-106).

Недостатком стимуляторов - летучих метаболитов сапрофитных бактерий почв - является узкий спектр действия, т.е. они не стимулируют рост всех штаммов Yersinia pseudotuberculosis. Кроме того, использование данных стимуляторов для роста штамма Yersinia pseudotuberculosis позволяет дать утвердительный ответ только о том, что стимуляция роста есть, и качественно оценить размножение, но не позволяет определить эффективную концентрацию стимулятора и количественно оценить его действие (т.е. метод является скрининговым - аэромонады засевали на чашки с голодным агаром, растительным агаром или питательным агаром, а псевдотуберкулезный микроб - на питательный агар, затем чашки с аэромонадами и чашки с псевдотуберкулезным микробом попарно герметично упаковывали, чтобы летучие метаболиты аэромонад воздействовали на рост псевдотуберкулезного микроба, опыты проводили при комнатной температуре, наблюдение вели визуально в течение 7 дней). Таким образом, получение летучих метаболитов азромад как стимуляторов в готовом виде практически невозможно, а сам процесс воздействия на микробы псевдотуберкулеза является длительным. Вследствие этого использование летучих метаболитов азромад для диагностики псевдотуберкулеза не получило широкого практического применения.

Известно влияние экзометаболитов морских микроводорослей на размножение патогенных бактерий. Экзометаболиты из культуральной жидкости, в частности, микроводоросли Phaeodactylum tricornutum, выделяли путем последовательной экстракции тремя растворителями (гексан, бензол и этилацетат). Исследователями было установлено, что полученные экзометаболиты оказывали влияние на размножение патогенных бактерий. Однако при этом экзометаболиты, полученные данным способом, не оказывали стимулирующего эффекта на псевдотуберкулезный микроб Yersinia pseudotuberculosis (Бузолева Л.С., Терехова В.Е., Кривошеева А.М. и Айздайчер Н.А. Микробиология, 2010, №2, стр. 96-99).

Поставленная задача решается путем применения экзометаболитов морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum, выделенных из культуральной жидкости, полученной в процессе выращивания, экстракции этилацетатом с последующей сушкой этилацетатного экстракта в качестве стимулятора роста Yersinia pseudotuberculosis.

Выделение стимулятора роста проводили путем экстракции КЖ этилацетатом, удаления растворителя из этилацетатного экстракта (ЭАЭ) в роторном испарителе, высушивания в эксикаторе над осушителем (силикагель) до постоянного веса. Полученный таким образом стимулятор роста хранится при -20°С в течение 3-х лет.

Полученный стимулятор роста, являющийся экзометаболитами морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum, оказывает ростстимулирующий эффект на различные штаммы Yersinia pseudotuberculosis, в частности шт. 282, 512, 907, 2781, Н-3515.

Заявляемый стимулятор позволяет получить прирост биомассы для всех пяти штаммов Yersinia pseudotuberculosis при культивировании на простой минеральной среде с глюкозой в 1,5-2 раза уже на 1-3 сутки и в 2-3 раза максимально на 9 сутки культивирования при температуре 20-22°С по сравнению с контролем (та же среда без стимулятора роста).

Дополнительная очистка ЭАЭ КЖ от ростингибирующих и нейтральных веществ позволяет повысить активность стимулятора Yersinia pseudotuberculosis. Такая очистка может быть проведена любым известным способом, в частности можно провести фракционирование на колонке с силикагелем (40-60 мкм) путем элюирования тройным объемом колонки системой растворителей, например гексан-этилацетат 1:1.

Принципиальным отличием заявляемого стимулятора роста бактерий Yersinia pseudotuberculosis является простой способ получения из экологически чистого природного сырья (чистая культура морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum, чистая морская вода, стерилизованная через бактериальный фильтр (0,22 мкм), экстракция КЖ свежеперегнанными растворителями или имеющими марки: х.ч. (химически чистые), ч.д.а. (чистые для анализа). Использование в качестве сырья чистой культуры морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum не вносит в получаемый стимулятор никаких посторонних примесей, в связи с чем обеспечивает ему высокую степень чистоты.

Полученные стимуляторы имеют широкий спектр действия в отличие от известных в литературе препаратов.

Появление у препарата новых свойств, т.е. широкого спектра стимулирующего действия, обеспечивает изобретению соответствие критерию «изобретательский уровень», что дополняется также тем, что стимулятор является экологически чистым продуктом, полученным простым способом.

Свойство «практическая применимость» иллюстрируется примерами.

Способ получения осуществляется следующим образом.

Пример 1. Получение стимулятора роста из КЖ морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum

Клетки Phaeodactylum tricornutum (2-5·10⁴ кл/мл) выращивают на модифицированной среде Гольдберга (Кабанова Ю.Г. О культивировании в лабораторных условиях планктонных диатомовых и перидиниевых водорослей.//Тр. Ин-та океанологии. - М.: Изд-во АН СССР. 1961. Т.47. С.203-215), содержащей природную морскую воду, до начала стационарной фазы роста при температуре 20-22°С с использованием светотемнового режима - 12 ч:12 ч при освещении люминесцентными лампами 3500 Лкс в течение 15 суток (получают 1,1-1.3·10⁷ кл/мл). Затем клетки морской микроводоросли осаждают центрифугированием, КЖ экстрагируют в делительной воронке дважды по 3 часа этилацетатом (на 1 л КЖ берут 100 мл этилацетата). Этилацетат удаляют из этилацетатного экстракта культуральной жидкости (ЭАЭ КЖ) в роторном испарителе, остаток высушивают в вакуумном эксикаторе над осушителем (силикагель) до постоянного веса. В результате получают препарат стимулятора роста бледно-желтого цвета (из 1 литра КЖ получают 7,8 мг сухого стимулятора роста).

Пример 2. Получение стимулятора из этилацетатного экстракта КЖ (ЭАЭ КЖ)

Берут 22 мг сухого препарата стимулятора роста (ЭАЭ КЖ Phaeodactylum tricornutum) растворяют в 1 мл этилацетата, раствор наносят на колонку высотой 20 см и диаметром 2 см, заполненную силикагелем (размер гранул 40-60 мкм), после чего элюируют 200 мл смеси растворителей гексан-этилацетат 1:1 (трехкратным объемом колонки), после элюирования растворители удаляют и остаток высушивают, как описано в примере 1. В результате получают 1,7 мг очищенного препарата стимулятора роста.

Пример 3. Действие стимулятора, полученного из КЖ морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum

Для культивирования бактерий Y.pseudotuberculosis (шт. 282, 512, 907, 2781, Н-3515) используют среду Патерсона-Кука: на 1 л дистиллированной воды берут Na₂HPO₄ - 8,5 г и KH₂PO₄ - 2 г, добавляют глюкозу до концентрации 0,1%. Температура культивирования +20-22°С. В пробирку с питательной средой (4 мл) добавляют дозу стимулятора роста, полученного по примеру 1, растворенного в 1 мл среды и стерилизованного через бактериальный фильтр (0,22 мкм). Затем добавляют чистую культуру одного из штаммов псевдотуберкулезного микроба в 1 мл стерильной среды до оптической плотности ОП исх=0,1. Конечная концентрация стимулятора роста в среде (6 мл) составляет 100 мкг/мл. В контрольные пробирки вместо стимулятора вносили равный объем (1 мл) среды. Прирост биомассы оценивали по приросту оптической плотности, измеренной на спектрофотометре 170 UV/VIS Spectrometer PG Instruments Ltd (Англия) при 600 нм. Результаты действия стимулятора приведены в таблице 1.

Таблица 1

Действие стимулятора роста Y.pseudotuberculosis из КЖ морской микроводоросли P.tricornutum (ЭАЭ КЖ) в % к контролю (контроль взят за 100%)

Штаммы 1 сутки 2 сутки 3 сутки 6 сутки 9 сутки 282 +38,9 +64,2 +60,9 +95,6 +103,2 512 +50,9 +76,2 +88,2 +132,4 +190,6 907 +49,1 +60,0 +73,3 +121,2 +128,6 2781 +46,0 +48,2 +59,5 +63,3 +119,8 Н-3515 +61,2 +66,1 +115,0 +143,6 +204,7

Как видно из таблицы 1, экзометаболиты морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum, выделенные из культуральной жидкости (КЖ), оказывают ростстимулирующее действие на различные штаммы Y.pseudotuberculosis. Максимумы роста культур псевдотуберкулезного микроба приходятся в основном на 2-е сутки культивирования (ОП=0,19-0,20).

Пример 4. Действие стимулятора, полученного из ЭАЭ КЖ морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum

В питательную среду, приготовленную для Y. pseudotuberculosis (шт. 2781) согласно примеру 3, добавляли дозу стимулятора, полученного по примеру 2, до конечной концентрации 40 мкг/мл. В контрольную пробирку вместо стимулятора вносили равный объем среды. Оценку прироста биомассы проводили также, как в примере 3. Сравнительные результаты действия стимулятора роста, полученного по примеру 1 и 2, на первые сутки приведены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнительное действие стимулятора, полученного по примеру 1 и по примеру 2, на рост шт. 2781 Y.pseudotuberculosis

Действие стимулятора роста, полученного по примеру 1, на 1 сутки культивирования в % к контролю Действие стимулятора роста, полученного по примеру 2, на 1 сутки культивирования в % к контролю +46,0 +81,8

Как видно из таблицы 2, уже на первые сутки отмечается значительное усиление действия стимулятора роста, полученного по примеру 2, на 35,8% по сравнению со стимулятором роста, полученным по примеру 1, при этом концентрация стимулятора уменьшилась в 2,5 раза.

Этот факт еще раз подтверждает, что в сложных диагностических случаях, заявляемый стимулятор может быть успешно использован для ускорения роста Y.pseudotuberculosis и, как следствие, можно быстро поставить правильный диагноз и оперативно начать лечение больных псевдотуберкулезом.

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к применению экзометаболитов морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum. Экзометаболиты, выделенные из морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum путем экстракции этилацетатом культуральной жидкости, получаемой в процессе выращивания морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum с последующим удалением растворителя из этилацетатного экстракта и сушкой этилацетатного экстракта до постоянного веса, применяются в качестве стимулятора роста Yersinia pseudotuberculosis. При необходимости осуществляют дополнительную очистку этилацетатного экстракта. Изобретение позволяет расширить арсенал стимуляторов роста Yersinia pseudotuberculosis. 2 табл., 4 пр.

Применение экзометаболитов морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum, выделенных из культуральной жидкости, полученной в процессе выращивания, экстракции этилацетатом с последующей сушкой этилацетатного экстракта и дополнительной очисткой этилацетатного экстракта, в случае необходимости, в качестве стимулятора роста Yersinia pseudotuberculosis.