СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СЕКРЕТОРНЫХ АНТИТЕЛ К F-1 АНТИГЕНУ ПРИ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВОИЕРСИНИОЗНЫМ ИММУНОГЕННЫМ ПРЕПАРАТОМ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/555 

Изобретение относится к области микробиологии и иммунологии и может быть использовано при изучении ответной реакции экспериментальных животных и людей, вакцинированных иммуногенным препаратом, защищающим от патогенных иерсиний.

Многолетний опыт инфектологии свидетельствует о том, что борьба с инфекционными заболеваниями остается одной из главных задач человечества (Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни - важнейший фактор биоопасности // Эпидем. и инф. болезни. - 2003. - №3. - С.4-16). Иерсиниозы относятся к числу инфекционных заболеваний, которые требуют внимания и изучения. Среди возбудителей, вызывающих эти заболевания, патогенными для человека являются близкородственные бактерии чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза.

Предварительные исследования показали возможность использования культур некоторых штаммов псевдотуберкулезного микроба для иммунизации лабораторных животных, которые обеспечивают защиту от последующего заражения патогенными иерсиниями. В качестве необходимого этапа конструирования вакцинного штамма доказана необходимость аттенуации природных штаммов псевдотуберкулезного микроба и передачи в бактерии таких аттенуированных штаммов генетической детерминанты F1-антигена - одного из основных иммуногенов чумного микроба (Янов С.Н., Погорельский И.П., Маракулин И.В. Генетические основы конструирования поливалентной вакцины, защищающей от иерсиниозов // Материалы научной сессии Кировского филиала РАЕ и КОО РАЕН 30-31 марта 2004 г. - Киров: Изд-во Бюро мед. статистики и информатики, 2004. - С.154-155). В итоге проведенных экспериментов был получен рекомбинантный штамм псевдотуберкулезного микроба (Yersinia pseudotuberculosis 172) со стабильно наследуемой способностью синтезировать F1-антиген на уровне 256...512 АЕ, по данным, полученным с помощью реакции диффузионной преципитации. Продукция F1-антигена в этих же экспериментах бактериями вакцинного штамма EV линии НИИЭГ чумного микроба достигала также 512 АЕ (Конструирование штамма псевдотуберкулезного микроба, перспективного для получения поливалентной вакцины / Маракулин И.В., Янов С.Н., Погорельский И.П. и др. // Биотехнология. - 2004. - №4. - С.67-71).

Изучение иммуногенных свойств нового вакцинного штамма на морских свинках показало, что при подкожной и пероральной иммунизации обеспечивается защита не менее 80% животных при последующем заражении патогенными иерсиниями.

Бактерии вакцинного штамма EV линии НИИЭГ чумного микроба в соответствующих опытах не защищали иммунизированных морских свинок от инфицирования культурами возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза несмотря на то, что серологическими методами антитела к F1-антигену у морских свинок, выработанные в процессе иммунизации, определялись. Специфичность развития у иммунизированных морских свинок псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза была подтверждена выделением чистых культур соответствующих возбудителей из внутренних органов погибших животных.

В настоящее время разработана технология получения иммуногенного препарата на основе штамма Y.pseudotuberculosis 172 и проведены его экспериментально-лабораторные испытания.

Ввиду того, что при псевдотуберкулезе и кишечном иерсиниозе ведущим является алиментарный путь заражения, необходимо было в эксперименте установить, вырабатываются ли антитела в ответ на иммунизацию животных иммуногенным препаратом, и если вырабатываются, то появляются ли они на поверхности слизистой оболочки кишечника (так называемые фекальные или секреторные антитела). Как известно, слизистая оболочка кишечника является эффективной системой сигнализации, охватывающей весь организм. Продуцируемый секреторный иммуноглобулин A (s-IgA) активно транспортируется в иммунном организме через эпителий слизистой оболочки и оказывает защитный эффект (Gizurarson S., Sigurdoardottir M., Stanzeit В. Selective augmentation of antibodies in various mucosal regions after intranasal immunization with diphtheria in mice. - J. Pharm. Sci. - 1988. - Vol.87, № 11. - P 1267-1269).

Поскольку бактериальные клетки вакцинного штамма псевдотуберкулезного микроба - У. pseudotuberculosis 172, на основе которого получен иммуногенный препарат, синтезируют F1-антиген чумного микроба, о наличии иммунного ответа у экспериментальных животных можно судить, определяя антитела к F1-антигену в копрофильтратах. При вакцинации против чумы животных или людей чумной живой вакциной на основе штамма EV линии НИИЭГ секреторные антитела в копрофильтратах не определяют, а выявляют антитела против F1-антигена в крови вакцинируемых и судят о напряженности иммунитета (Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В.Наумова, Л.В.Самойловой. - Саратов: Изд-во ГосНИПЧИ "Микроб", 1992. - 278 с.; Домарадский И.В. Чума. - M.: Медицина, 1998. - 176 с; Hill J., Williamson E.D., Titball R.W. Vaccine against Yersinia comprising one or two antibodies, one specific for Yersinia pestis Fl-antigen and the other one for Yersinia pestis V-antigen. - Международная заявка на изобретение WO 2004019980 от 03.11.2004). Аналогичным образом определяют антитела против F1-антигена в крови у лиц, переболевших чумой (постинфекционный иммунитет).

Иммуногенный препарат, созданный на основе штамма Y. pseudotuberculosis 172, защищает иммунизированных животных, в частности морских свинок, от заражения культурами возбудителей чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Использование в экспериментах указанного вида животных связано с тем, что морские свинки весьма эффективно реагируют на введение как микробных клеток, так и изолированных антигенных комплексов. При этом количество антигенов, на которые выявлен гуморальный иммунный ответ у морских свинок как при чуме, так и при псевдотуберкулезе, значительно (в 5...6 раз) больше, чем у белых мышей (Спектр антител при введении чувствительным животным бактерий Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis /В.И.Дробков, И.В.Маракулин, И.П.Погорельский и др. // Ж. микробиол. - 1996. - № 2. - С.81-85). В этой связи весьма важно в эксперименте получить данные о гуморальном иммунном ответе как на основе изучения сывороточных антител, так и секреторных антител, обнаруживаемых в копрофильтратах вакцинированных иммуногенным препаратом морских свинок. Тем более что данные о динамике секреторных (фекальных) антител можно иметь, проводя ежедневные исследования копрофильтратов иммунизированных животных без постоянного забора и исследования крови, являющегося довольно трудоемкой процедурой.

Ввиду того, что иммуногенный препарат на основе штамма Y.pseudo-tuberculosis 172 создан впервые и его аналогов не существует, важно иметь в арсенале средств контроля за развитием поствакцинального иммунитета у людей простой в исполнении и надежный способ определения секреторных антител. В этом случае разработанный способ определения секреторных антител в копрофильтратах иммунизированных людей позволит иметь ежедневно информацию о нарастании титров специфических антител против F1-антигена и в последующем сопоставлять их с титром антител против того же F1-антигена в сыворотке крови.

Наиболее близким к заявляемому способу является метод определения фекальных антител класса иммуноглобулинов A (IgA) против Y.enterocolitica у мышей, вакцинированных и инфицированных перорально (Fecal immunoglobulin A (IgA) antibodies to Yersinia enterocolitica in mice orally vaccinated and infected / S.Kazuyuki, K.Kenichi, H.Hideki, O.Masuo // Jap.Vet. Sci. - 1989. - Vol.51, № 2. - P.273-277). Авторы метода с целью изучения защитной роли фекальных антител при кишечной патологии, вызываемой бактериями кишечного иерсиниоза, многократно иммунизировали мышей инактивированными клетками Y.enterocolitica серовара ОЗ биотипа 3 в дозе 100 мг сырого веса в объеме 0,1 мл стерильного физиологического раствора на мышь, с четырехдневными интервалами между вакцинацией. В последующем вакцинированных и интактных мышей заражали перорально культурой того же штамма Y.enterocolitica в дозе 1·10⁷ живых микробов на мышь в объеме 0,1 мл физиологического раствора. Ежедневно от каждой мыши отдельно отбирали фекалии, которые анализировали на наличие IgA-антител методом иммуноферментного анализа и экскрецию бактерий Y.enterocolitica серовара ОЗ биотипа ОЗ. Авторами было установлено, что к 21 дню после первой иммунизации уровень специфических IgA-антител резко возрастал и оставался высоким в течение 10 дней, а потом снижался. Заражение мышей на 32 день после первой иммунизации живой культурой Y.enterocolitica приводил к некоторому подъему титра IgA-антител. Обнаруженные фекальные антитела ингибировали колонизацию Y.enterocolitica в кишечнике вакцинированных мышей.

При заражении животных контрольной группы авторы в первые 2 недели обнаруживали незначительное выведение из организма бактерий Y.enterocolitica и отсутствие, или очень низкие титры IgA-антител. К 20 дню наблюдались резкий подъем уровня секреторных IgA-антител и одновременно активная экскреция бактерий Y.enterocolitica (до 1-10 на 1 г фекалий). Анализ полученных данных позволил авторам выявить различия поствакцинального и постинфекционного иммунитета при кишечном иерсиниозе.

Описанный метод определения фекальных антител класса иммуноглобулинов A (IgA) позволяет выявлять антитела против бактерий того штамма Y.enterocolitica, которым иммунизировали мышей и которым впоследствии инфицировали животных. Однако тест-система, реализующая потенциальные возможности описанного метода, не определяет антитела класса иммуноглобулинов против гетерологичных штаммов иерсиний, в частности, против F1-антигена рекомбинантного штамма У. pseudotuberculosis 172, составляющего основу иммуногенного препарата.

Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего обнаруживать секреторные антитела в копрофильтратах вакцинированных иммуногенным препаратом экспериментальных животных. Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого способа, заключается в том, что у вакцинированных иммуногенным препаратом экспериментальных животных, а в последующем - у людей, можно в динамике изучать нарастание титров специфических антител против F1-антигена и судить о состоянии поствакцинального противоиерсиниозного иммунитета. Поставленная задача достигается тем, что антитела к F1-антигену определяются в копрофильтрате у каждого вакцинированного иммуногенным препаратом животного в реакции непрямой гемагглютинации с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного сухого (Инструкция по применению диагностикума эритроцитарного чумного иммуноглобулинового сухого и жидкого. Diagnosticum erythrocytarum pesticum immunoglobulinum siccum et fluidum / Комитет Госсанэпиднадзора Российской Федерации. - Утв. 25.07.1995 г.). Согласно Инструкции... диагностикум дает положительную реакцию непрямой гемагглютинации с агглютинирующей сывороткой, прилагаемой в комплект ингредиентов, в разведении 1:200000 для реакции макрометодом. Аналогичное определение проводится с образцами копрофильтратов животных контрольной группы, которым в одинаковые с опытными животными сроки вводится подкожно стерильный изотонический раствор хлористого натрия.

Методически определение секреторных антител проводится следующим образом. Во флакон с 1 г фекалий животного вносится 2,0 мл изотонического раствора хлористого натрия. Содержимое флакона перемешивается до гомогенного состояния, после чего во флакон добавляется еще 3,0 мл изотонического раствора хлористого натрия. Флакон закрывается пробкой, интенсивно встряхивается и оставляется на 30 мин при комнатной температуре для оседания плотных частиц. Спустя указанный промежуток времени из флакона пипеткой отбираются 0,5 мл надосадочной жидкости и переносятся в пробирку с 4,5 мл изотонического раствора хлористого натрия. Содержимое пробирки тщательно перемешивается и используется для определения титра секреторных (фекальных) антител против F1-антигена.

Для определения титров секреторных антител используют полистироловые пластины с лунками. В 7 лунок пластины, исключая первую, вносят 0,4 мл раствора твина-80 в разведении 1:50 000. В первую лунку вносят 0,4 мл суспензии из пробирки, приготовленной как указано выше и включающей определенный объем надосадочной жидкости из тестируемой пробы фекалий. Во вторую лунку с 0,4 мл раствора твина-80 также вносят 0,4 мл суспензии из той же пробирки, из которой аналогичный объем суспензии был внесен в первую лунку. После перемешивания суспензии во второй лунке отбирают 0,4 мл и переносят в третью лунку. Делая таким образом двукратные разведения исследуемой суспензии путем переноса 0,4 мл разведенной суспензии из одной лунки в другую, завершают процесс разведения на седьмой лунке, из которой 0,4 мл смеси суспензии удаляют. Восьмая лунка используется для контроля диагностикума. Во все восемь лунок добавляется 0,05 мл диагностикума эритроцитарного чумного антигенного 2,5%-ной концентрации. Содержимое лунок перемешивают покачиванием полистироловой пластины. Пластину оставляют на 2...2,5 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Результат считается положительным, когда эритроциты выпали на дно лунок равномерным слоем, занимая не менее 2/3 сферической поверхности лунок. При отрицательном результате реакции непрямой гемагглютинации эритроциты выпадают на дно лунки в виде "пуговки" или узкого колечка с ровным краем, как в контроле (восьмая лунка). За титр специфических секреторных антител в исследуемой суспензии принимается то ее максимальное разведение, при котором еще регистрируется положительный результат.

Титр секреторных (фекальных) антител определяется у каждого животного опытной и контрольной групп отдельно, а затем полученные результаты обсчитываются согласно руководству (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.).

Экспериментально установлено, что в фекалиях животных контрольной группы специфических секреторных антител против F1-антигена обнаружить не удалось. Как в первой, так и в последующих лунках эритроциты диагностикума выпадают на дно лунок в виде узкого колечка с ровным краем (отрицательный результат в РНГА).

В опытной группе животных, вакцинированных иммуногенным препаратом, в первые 4 дня после вакцинации секреторные (фекальные) антитела против F1-антигена также не определялись.

Появление антител против F1-антигена было зарегистрировано на 5 сутки после иммунизации животных опытной группы. На дне лунок определялся хорошо выраженный равномерный слой выпавших в осадок эритроцитов диагностикума в виде "перевернутого зонтика". Уровень специфических антител против F1-антигена нарастает к 18...20 дню после иммунизации (титр антител 1:160...1:320), а затем, несколько снижаясь, остается довольно высоким в течение 30 дней (срок наблюдения).

Экспериментальные данные, полученные при пероральной вакцинации иммуногенным препаратом морских свинок, свидетельствуют о формировании у животных надежной защиты от возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза именно при пероральном инфицировании. Очевидно, что вырабатываемые в организме животных секреторные антитела, в том числе против F1-антигена, выделяются слизистой оболочкой кишечника и ингибируют колонизацию патогенных иерсиний, внося тем самым существенный вклад в поствакцинальный иммунитет.

Заявляемый способ позволяет избежать нескольких трудоемких этапов исследования, связанных с ежедневным взятием крови, приготовлением сыворотки, которые на 24 ч отодвигают постановку реакции непрямой гемагглютинации для определения специфических антител против F1-антигена.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и иммунологии. О наличии секреторных антител у иммунизированных животных судят по определению в копрофильтратах антител к F1-антигену в реакции непрямой гемагглютинации с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного сухого. Использование способа позволяет обнаруживать секреторные антитела в копрофильтратах вакцинированных иммуногенным препаратом экспериментальных животных и оценивать напряженность гуморального иммунного ответа.

Способ обнаружения секреторных антител к F1-антигену при вакцинации противоиерсиниозным иммуногенным препаратом, включающий иммунизацию животных, ежедневный отбор фекалий и подготовку на изотоническом растворе хлорида натрия копрофильтратов животных опытной и контрольной групп, отличающийся тем, что о наличии секреторных антител судят по определению в копрофильтратах антител к F1-антигену в реакции непрямой гемагглютинации с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного сухого.