ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА YERSINIA Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и касается выделения и идентификации возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза (К. pseudotuberculosis и Y. enterocolytica).

Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз являются инфекционными заболеваниями, вызываемыми Yersinia spp., передающимися алиментарным путем и характеризующиеся полиморфизмом клинических проявлений и многообразием клинических форм. На территории Российской Федерации и в мире ежегодно регистрируются групповые и спорадические случаи иерсиниозов, возникающие в детских дошкольных учреждениях, школах, интернатах, в загородных детских коллективах, воинских частях, на предприятиях и в учебных заведениях, объединенных единым источником питания.

Наиболее достоверный результат, подтверждающий диагноз, получают микробиологическим выделением иерсиний из патологического материала («золотой стандарт» диагностики). Однако изоляция и идентификация иерсиний связаны с определенными трудностями и прежде всего с длительностью процесса. Это обуславливает необходимость совершенствовать методы выделения и идентификации У. pseudotuberculosis и Y. enterocolytica путем создания эффективных дифференциально-диагностических питательных сред.

Схема микробиологического выделения иерсиний, принятая в настоящее время, состоит из последовательных этапов: обогащения, первичного посева на чашки Петри с питательными средами (типа сред Серова, №67, Эндо, Левина, Мориса и др.), вторичный отсев с твердых питательных сред на пробирки с одной из дифференциальных сред, содержащих мочевину, в виде скошенного столбика (Клиглера, Олькеницкого и др.). На этих средах иерсинии растут в виде матового сухого налета на скошенной поверхности и по ходу укола по всей высоте столбика с разложением мочевины и образования щелочи (столбик через 24 часа инкубации приобретает малиновый цвет). Выделенные культуры в дальнейшем используются для дальнейшей идентификации на биохимических тестах и серологическом тепированию (рис.1).

Известны питательные среды для диагностики бактерий рода YERSINIA.

1)Дифференциально-диагностическая комбинированная питательная среда для выделения иерсиний (СБТС), выпускаемая ГосНИИ прикладной микробиологии (Оболенск, Московская обл.).

Состав среды: питательный агар рН 7,8; для культивирования микроорганизмов - 35,0 г

желчь очищенная - 6,0 г

глюкоза- 10, 0 г

мочевина-5,0 г

бромтимоловый синий воднорастворимый - 0,128 г

двузамещенный фосфорнокислый калий (КзНРОд) - 1,0 г.

Способ приготовления: компоненты вносят в 1,0 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят 5 мин на медленном огне. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр, вновь кипятят 1-2 мин, охлаждают до 45-50°С и разливают в чашки Петри. Хранят среду в течение 7-10 дней при 4-7°С.

2) Среда с мочевиной по Преусу (в модификации ЦНИИВС им. И.И. Мечникова) с индикатором бромтимоловым синим и по Кристенсену с индикатором бромфеноловым красным.

Использование указанных сред сделало более надежным определение уреазной активности бактерий, для чего параллельно с посевом в комбинированную среду делают посев в пробирку со средой Кристенсена (Преуса).

3) Среда Кристенсена с мочевиной, состав:

Раствор I. Пептон - 1,0 г

Натрий хлористый - 5,0 г

Глюкоза - 1,0 г

Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0 г

Феноловый красный (раствор 1:500) - 6,0 мл

Мочевина - 20,0 г

Дистиллированная вода- 100,0 мл

Раствор II.

Агар-агар- 15,0 г

Дистиллированная вода - 900,0 мл

Стерилизуют при 0,5 атм 15 минут.

Приготовление. К охлажденному до 50-55°С раствору II добавляют 100 мл раствора I, перемешивают, разливают асептически в стерильные пробирки, среду охлаждают в наклонном положении для получения столбика и косяка. Готовая среда желтого цвета.

Ход исследования.

Делают массивный посев по всей поверхности косяка. Инкубируют при 37°С. Проводят учет через 2, 4, 6 часов и на следующий день. В отдельных случаях при отрицательных результатах наблюдают до 4-7 дней (возможны замедленные реакции). Положительный результат - красное окрашивание.

Однако использование дополнительных сред с мочевиной удлиняет выявление и идентификацию иерсиний еще на 1-2 суток.

Таким образом, микробиологическая идентификация иерсиний занимает 5 суток, что неприемлемо долго для принятия клинического. Кроме того, значительно возрастает себестоимость бактериологического исследования.

В качестве прототипа заявитель выбрал хорошо известную и широко используемую 3-сахарную среду Олькеницкого и ее модификацию. Использование этой питательной среды регламентировано соответствующими методическими документами (Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий. Инструкция, утв. МЗ СССР 30.10.1990 г.,№15-6/42; Профилактика иерсиниоза. Санитарно-эпидемиологические правила, СП 3 3.1.7.2617-10, утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 26.04.2010 г.,№37; Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Методические указания. МУ 3.1.12438-2009).

Состав среды Олькеницкого в классическом и модифицированном вариантах прописан в Приказе МЗ СССР №535-84 г.(табл.1)

Таблица 1
Состав среды Олькеницкого в классическом и модифицированном вариантах Ингредиенты Классический Модифицированный Питательный агар, рН 7,2-7,4, мл 1000   Лактоза, г 1,0   Сахароза, г 10,0 10,0 Глюкоза, г 1,0 1,1 Мочевина, г 10,0 10,0 Натрий тиосульфат (гипосульфит), г 0,3 1,0 Аммоний-железо (II) сульфат (Соль Мора) 0,2 0,2 Феноловый красный, 0,4% водн.р-р, мл 4,0   Среда Гиса с лактозой и индик. (ВР), г   45,0 Дистиллированная вода, мл   до 1000,0

Среду стерилизуют при 0,5 атм 20 минут или текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Среду охлаждают в скошенном положении для получения столбика высотой 2,5 см и косяка длиной 4 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

Ход исследования

Сеют штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Инкубируют при 37°С 18-24 часа. Кислотообразование вызывает появление желтой окраски, разложение мочевины (увеличение рН) - покраснение.

Недостатком является то, что основное предназначение данной среды -идентификация бактерий семейства Enterobacteriacea, которое включает 12 родов и более 300 видов микроорганизмов. Следовательно, среда Олькеницкого не решает задачу дифференциально-диагностического выделения бактерий рода Yersinia, (рис.2).

Задачей данного изобретения является создание простой дифференциально- диагностической питательной среды с высокой разрешающей способностью, которая позволяет определить принадлежность выделенной культуры к роду Yersinia без использования дополнительных сред, в результате происходит значительное сокращение сроков исследования.

Поставленная задача решается путем приготовления дифференциально-диагностической питательной среды для идентификации бактерий рода Yersinia, содержащей микробиологический агар (сухой), лактозу, глюкозу, мочевину, краситель феноловый красный и дистиллированную воду, согласно изобретению питательная среда дополнительно содержит краситель метиленовый синий и хлористый кальций при следующем соотношении компонентов, г/100 мл:

Сухой агар-3,0

Лактоза - 1,0

Глюкоза -0,15

Мочевина - 0,3

Хлористый кальций - 0,2

Феноловый красный (1% спиртовый р-р) - 0,2 мл

Метиленовый синий (1% спиртовый р-р) - 0,1 мл

Дистиллированная вода - до 100 мл

рН - 7,0-7,2.

В качестве растворителя для красителей феноловый красный и метиленовый синий используют этиловый спирт.

При разработке предлагаемой питательной среды учтены и использованы биохимические особенности рода Yersinia и отдельных видов этого рода.

Одновременное использование в составе заявляемой питательной среды спиртового раствора метиленового синего и фенолового красного позволяет получить специфическое окрашивание (столбик малиновый, скошенная часть фиолетовая) характерное исключительно для бактерий рода Yersinia. Следовательно, предлагаемая питательная среда может рассматриваться как простая, а также их биохимические свойства.

Композиция из двух красителей - дифференциально-диагностическая среда с высокой разрешающей способностью для бактерий рода Yersinia

Введение в питательную среду хлористого кальция, не являющегося компонентом питания иерсений, обеспечивает ее изотоничность, предохраняя бактериальные клетки от осмотического шока.

При этом существенными признаками предлагаемого предложения следует считать качественный и количественный состав питательной среды, с высокой разрешающей способностью, т.к. величины содержания компонентов в заявляемой питательной среде являются оптимальными и обусловливают относительную сбалансированность стоимости среды с ее ростовыми характеристиками. Под понятием высокая разрешающая способность питательной среды заявитель подразумевает возможность выделения бактерий рода Yersinia в ходе одного посева на заявляемую питательную среду без использования дополнительных тестов, в результате чего сроки исследования сокращаются до 18-24 часов.

Питательную среду готовят следующим образом.

Сухие ингредиенты среды растворяют в дистиллированной воде в любой последовательности. После растворения агара смесь нагревают до кипения и добавляют индикаторы (феноловый красный и метиленовый синий). Устанавливают рН среды в пределах 7,0-7,2 и разливают по пробиркам по 5-6 мл, стерилизуют автоклавированием 15 мин под давлением 0,5 атм.

В горячем виде среда имеет грязно-зеленый цвет, а сразу после автоклавирования приобретает желто-оранжевую окраску в результате восстановления метиленового синего.

Пробирки со средой осторожно встряхивают и устанавливают в наклонном положении под углом 45° (для получения скашивания, оставляя вертикальный столбик высотой 1,5-2,0 см и косую поверхность 4-5 см). При остывании среды она вновь приобретает грязно-зеленную окраску вследствие окисления индикатора атмосферным кислородом.

Застывшая питательная среда должна в течение 2-3 дней «дозреть» - приобрести однотонную равномерную окраску, что свидетельствует об окислении индикатора по всей глубине среды.

Посев материала проводят по всей скошенной поверхности (косяку) и последующим уколом в столбик среды.

При культивировании на данной среде через сутки различные представители семейства Enterobacteriaceae вызывают характерные изменения в окраске предлагаемой среды (табл.2).

Таблица 2
Изменения предлагаемой питательной среды при культивировании бактерий семейства Enterobacteriaceae Бактерии Столбик Скошенная часть Характер роста на косяке Наличие газа Шигеллы Зеленый Фиолетовый Нежный, с синим оттенком Нет Сальмонеллы Желтый Фиолетовый Пышный, с белесым оттенком Есть Эшерихия 0₁₂₄ Желтый Фиолетовый Пышный, с белесым оттенком Есть Эшерихии Желтый Зеленый Пышный, с белесым или зеленым Есть       оттенком   Протей Малиновый Фиолетовый Сливной, с сиреневым оттенком Есть* Иерсинии Малиновый Фиолетовый Сливной, с сиреневым оттенком Нет

Примечание: *) - по ходу укола.

Иерсинии ферментируют глюкозу с образованием кислоты (облигатный признак для всех представителей семейства Enterobacteriaceae) расщепляют мочевину и восстанавливают метиленовый синий индикатор. Однако конечные химические и окислительно-восстановительные сдвиги в столбике и на скошенной поверхности среды (косяке) существенно различаются по окраске. В столбике происходит увеличение значения рН за счет ощелачивания среды (результат расщепления мочевины), в результате чего восстановленный метиленовый синий индикатор обесцвечивается. При этом столбик окрашивается феноловым красным индикатором в малиновый цвет (рис.3).

Следовательно, предлагаемая питательная среда может рассматриваться как дифференциально-диагностическая. На скошенной части столбика также происходит расщепление (гидролиз) мочевины и, следовательно, ощелачивание среды. Феноловый красный индикатор окрашивается в малиновый цвет, который, смешиваясь с метиленовым синим, дает интенсивно-фиолетовую окраску среды.

Таким образом, различные представители бактерий семейства Enterobacterioceae, имеющие разные биохимические свойства по отношению к лактозе, глюкозе, мочевине и метиленовому синему, изменяют цвет среды при различных значениях рН. Иерсинии дают четкую картину, как правило, уже через 18-24 часа, а другие представители семейства вызывают характерные изменения среды и в более короткие сроки.

Заявляемая питательная среда соответствует критериям изобретения:

«новизна» - в заявляемой питательной среде одновременно используют два индикатора феноловый красный и метиленовый синий, которые усиливают дифференциально-диагностические свойства среды и при наложении друг на друга дают малиновый и фиолетовый цвет, что и позволяет дифференцировать бактерии иерсинии от различных представителей бактерий семейства Enterobacterioceae);

«изобретательский уровень» из определенного заявителем уровня техники не выявлена известность одновременного использования двух красителей для диагностики бактерий иерсинии.

«промышленная применимость» - данная питательная среда проста в исполнении и может быть использована как для научно-исследовательских целей, так и для диагностики заболевания в лечебных учреждениях.

Изобретение относится к биотехнологии, к микробиологии, и касается выделения и идентификации возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза (У. Pseudotuberculosis и Y. Enterocolytica). Питательная среда содержит микробиологический агар (сухой), лактозу, глюкозу, мочевину, хлористый кальций, 1%-ный спиртовой раствор фенолового красного, 1%-ный спиртовой раствор метиленового синего и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки исследования. 3 ил.. 2 табл.

Дифференциально-диагностическая питательная среда для идентификации бактерий рода Yersinia, содержащая микробиологический агар (сухой), лактозу, глюкозу, мочевину, краситель феноловый красный и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что питательная среда дополнительно содержит краситель метиленовый синий и хлористый кальций при следующем соотношении компонентов, г/100 мл.
Сухой агар 3,0 Лактоза 1,0 Глюкоза 0,15 Мочевина 0,3 Хлористый кальций 0,2 Феноловый красный (1% спиртовой раствор) 0,2 мл Метиленовый синий (1% спиртовой раствор) 0,1 мл Дистиллированная вода до 100 мл