ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ФЕРМЕНТ РИБОНУКЛЕАЗУ И ГЛИЦИРРИЗИНОВУЮ КИСЛОТУ ИЛИ ЕЕ СОЛИ: ГЛИЦИРРИЗИНАТ АММОНИЯ, ИЛИ ДИКАЛИЯ, ИЛИ ТРИНАТРИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61K38/46 A61K31/704 A61P31/14 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической композиции, содержащей фермент рибонуклеазу (РНК-азу) и глицирризиновую кислоту или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия, которая может быть использована в медицине для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, такими как вирус гриппа, парагриппа, паротита, кори, респираторно-синцитиальный вирус, вирус краснухи, риновирус и другие.

Известны лекарственные средства для местного применения, используемые для лечения и профилактики герпесвирусных инфекций, содержащие противовирусные компоненты, не являющиеся ферментами, например крем Зовиракс™ (ацикловир) (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/zovirax~27174.htm); капсулы и лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения Фосфоглив™ (фосфолипиды и тринатриевая соль глицирризиновой кислоты) (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/phosphogliv.htm); спрей Эпиген-интим™ (глицирризиновая кислота) (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/epigen-intim.htm); мази: алпизарин (http://alpizarin.ru/), хелепин (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/helepin-d_20830.htm), флакозид (http://ru.wikipedia.org/wiki/%D4%EB%E0%EA%EE%E7%E8%E4), содержащие экстракты растений.

Известен препарат Интерферон альфа-2а, идентичный человеческому лейкоцитарному интерферону альфа-2 и обладающий иммуномодулирующим, противовирусным и противоопухолевым действием. (Справочник "Лекарственные средства" под редакцией М.А. Клюева, 2001 г.)

Известно косметическое средство бальзам для губ Ла-Кри™, содержащее экстракт солодки и бисаболол, используемое для смягчения кожи губ. (http://vertex.spb.ru/catalog/68/34/la-kri_balyzam_dlya_gub.html)

Известен бальзам для губ Uriage Barierderm, содержащий масло каритэ, масло огуречника, неомыляемые фракции масла авокадо, стеарилглицирретинат, аскорбилпальмитат, токоферол, используемое для восстановления поврежденной кожи губ. (http://www.krason.ru/catalog-bariederm/1740-3620-balzam-dlya-gub.aspx?perf=1)

Известен препарат Глицирам (глициррризинат аммония), используемый в виде таблеток для лечения бронхиальной астмы и гипофункции надпочечников. (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/glycyram-tablets-0.05_27575.htm)

Известен комбинированный препарат Гексализ, содержащий в качестве противомикробных компонентов - биклотимол и лизоцим, эноксолон, выделенный из глицирризиновой кислоты в качестве противовоспалительного компонента. (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/hexalyse~22640.htm)

Известны косметические средства для местного применения, используемые для профилактики герпеса, содержащие противовирусные компоненты, не являющиеся ферментами, например, экстракты лекарственных растений и германийорганические соединения (Помада профилактическая противогерпетическая "Антигерпес" (Р16915891585471.100.70) 292472. ТУ 9124-001-00358210-96), глицирризиновая кислота мазь «Герпинат» мазь; бан. 20 мл; №77.01.12.915.П.02970.02.00 от НИИ атеросклероза РАЕН (Россия), ИНАТ-ФАРМА (Россия) (http://www.biomedservice.ru/publish/pub16.htm)

Известна косметическая фермент-содержащая композиция, где фермент выбран из группы протеиназ, включающей в себя трипсин, химотрипсин, бромелаин, папаин и фицин, а также из лизоцима, эластазы, α-липазы и α-амилазы, которая применяется для лечения акне, ухода за кожей и очистки кожи (DE 4305460). Описанная композиция не содержит ферментов нуклеаз, обладающих прямой противовирусной активностью, и, следовательно, не может быть использована для профилактики вирусных инфекций.

Известен фармацевтический препарат «Дезоксирибонуклеаза», выпускаемый в виде лиофилизированного порошка в герметично укупоренных флаконах и ампулах по 0,005; 0,01; 0,025 и 0,05 г. Этот препарат назначают при герпетических кератитах, аденовирусных конъюктивитах, для уменьшения вязкости и улучшения эвакуации мокроты и гноя при бронхоэктатической болезни и используют местно в виде 0,2% раствора на изотоническом растворе натрия хлорида (Справочник "Лекарственные средства" под редакцией М.А. Клюева, 2001 г.).

Известен фармацевтический препарат «Рибонуклеаза», выпускаемый в виде лиофилизированного порошка в герметично укупоренных флаконах по 0,01 г. Этот препарат назначают при заболеваниях дыхательных путей с трудно отделяемой мокротой, пародонтозе, гингивите, гнойных ранах, трофических язвах, клещевом энцефалите, тромбофлебите, при местном применении присыпают раневую поверхность в количестве 0,025-0,05 г. (Справочник "Лекарственные средства" под редакцией М.А. Клюева, 2001 г.).

Фармацевтические композиции, содержащие фермент РНК-азу и глицирризиновую кислоту или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия, используемые при профилактике вирусных инфекций не описаны.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить фармацевтическую композицию, содержащую фермент РНК-азу и глицирризиновую кислоту или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия, которая может быть использована для профилактики вирусных инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, такими как вирус гриппа, парагриппа, паротита, кори, респираторно-синцитиальный вирус, вирус краснухи, риновирус и другие.

Согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая в качестве активного ингредиента 0,001-0,5 мас.% рибонуклеазы (РНК-азы) 0,001-0,5 мас.% и глицирризиновую кислоту или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия 0,001-0,5 мас.% и приемлемые носители и эксципиенты.

В качестве предпочтительного воплощения заявленного изобретения предложена композиция, указанная выше, дополнительно содержащая противомикробный или противовирусный ингредиент.

Наиболее предпочтительной является композиция, содержащая РНК-азу и или глицирризиновую кислоту или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия качестве активного ингредиента и приемлемые носители и эксципиенты, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

РНК-аза 0,001-0,5 глицирризиновая кислота   или ее соли: глицирризинат аммония   или дикалия, или тринатрия 0,001-0,5 сангвиритрин или интерферон, или лизоцим 0,001-5,0 β-циклодекстрин или гидрогенизированный лецитин 0,001-5,0 консервант 0,5-1,0 полимерный носитель 0,05-1,0 регулятор pH 0,05-1,0 вода деминерализованная 1,00-5,00 гидрофильной основы   (Полиэтиленоксид 400 и Полиэтиленоксид 1500   в массовом соотношении 70:30) 86,00-98,397

Активными ингредиентами заявленной фармацевтической композиции являются фермент: РНК-аза и глицирризиновая кислота или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия. РНК-аза обладает способностью задерживать развитие вирус гриппа, парагриппа, паротита, кори, респираторно-синцитиальный вирус, вирус краснухи, риновирус и других РНК-содержащих вирусов, не повреждая при этом РНК клеток макроорганизма (Машковский М.Д. Лекарственные средства, Том 2, Москва, Новая Волна, 2000, стр.111-112). Глицирризиновая кислота и ее соли используются как противовирусное средство для наружного и местного применения. Глицирризиновая кислота активна в отношении ДНК- и РНК-содержащих вирусов, включая различные штаммы вирусов Herpes simplex, Varicella zoster, вирусов папилломы человека, цитомегаловирусов. Противовирусное действие связано, по-видимому, с индукцией образования интерферона. Прерывает репликацию вирусов на ранних стадиях, вызывает выход вириона из капсида, тем самым не допуская его проникновение в клетки. Это обусловлено селективным дозозависимым ингибированием фосфорилирующей киназы Р. Взаимодействует со структурами вируса, изменяя различные фазы вирусного цикла, что сопровождается необратимой инактивацией вирусных частиц (находящихся в свободном состоянии вне клеток), блокированием внедрения активных вирусных частиц через клеточную мембрану внутрь клетки, а также нарушением способности вирусов к синтезу новых структурных компонентов. Ингибирует вирусы в концентрациях, нетоксичных для нормально функционирующих клеток. Штаммы вирусов, резистентные к ацикловиру и йодоуридину, высокочувствительны к глицирризиновой кислоте. Оказывает также противовоспалительное, анальгезирующее и улучшающее регенерацию тканей действие, как при ранних проявлениях вирусной инфекции, так и при язвенных формах (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/act_1347.htm).

Интерферон. Представляет собой высокоочищенный стерильный белок, содержащий 165 аминокислот. Идентичен человеческому лейкоцитарному интерферону альфа-2а. Обладает противовирусной, противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью. Возможно, что механизм противовирусного и противоопухолевого действия связан с изменением синтеза РНК, ДНК и белков. Ингибирует репликацию вирусов в инфицированных вирусами клетках. Повышает фагоцитарную активность макрофагов и усиливает специфическое цитотоксическое действие лимфоцитов на клетки-мишени (http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/act_549.htm)

Сангвиритрин® обладает широким спектром противомикробной активности, действуя на грамположительные и грамотрицательные бактерии (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Shigella spp., Escherichia spp., Salmonella spp., Proteus spp., Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Klebsiella spp., Antracoides spp., Cryptococcus spp.), патогенные грибы рода Microsporum, Trichophyton, Nocardia, Aspergillus, дрожжеподобные грибы рода Candida (в т.ч. полирезистентные штаммы), а также Actinomycetes и некоторые патогенные простейшие (Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis). В основе механизма противомикробного действия сангвиритрина лежит подавление бактериальной нуклеазы, нарушение процессов проницаемости клеточных стенок, перегородок деления, строения нуклеоида. http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/sanguiritrin~21839.htm)

Лизоцим (от греч. lysis - растворение, распад и zyme - закваска), мурамидаза, фермент класса гидролаз; разрушает стенку бактериальной клетки, в результате чего происходит ее растворение (лизис). В организме играет роль неспецифического антибактериального барьера, особенно в местах контакта с внешней средой (слезы, слюна, слизистая оболочка носа). Лизоцим открыт в 1922 А. Флемингом в слизи из полости носа и затем обнаружен во многих тканях и жидкостях человеческого организма (хрящи, селезенка, лейкоциты, слезы), в растениях (капуста, репа, редька, хрен), в некоторых бактериях и фагах и, в наибольшем количестве, в яичном белке. Лизоцимы из разных источников различаются по строению, но близки по действию. Лизоцим яичного белка - первый фермент, для которого методом рентгеноструктурного анализа установлена трехмерная структура и выявлена связь между строением и механизмом действия (1965); эти исследования - существенный вклад в представления о механизмах ферментативного катализа в целом.

Лизоцим - белок с молекулярной массой около 14000; единственная полипептидная цепь состоит из 129 аминокислотных остатков и свернута в компактную глобулу (30'30'45 Å). Трехмерная конформация полипептидной цепи поддерживается 4 дисульфидными (-S-S-) связями. (В лизоциме молока человека их 3, яичного белка гуся - 2, в лизоциме фага Т₄ их нет; чем больше дисульфидных групп, тем лизоцим более устойчив, но менее активен.) Глобула лизоцима состоит из двух частей, разделенных щелью; в одной части большинство аминокислот (лейцин, изо-лейцин, триптофан и др.) содержит гидрофобные группы, в др. преобладают аминокислоты (лизин, аргинин, аспарагиновая к-та и др.) с полярными группами. Полярность окружения влияет на ионизацию двух карбоксильных групп (-СООН), расположенных на поверхности щели молекулы с разных ее сторон. Лизоцим действует на один из основных компонентов бактериальной стенки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров. Полисахарид сорбируется на молекуле лизоцима в щели на границе гидрофобной и гидрофильной ее частей таким образом, что с ферментом связывается 6 колец аминосахаров, а одна из соединяющих их гликозидных связей (между 4 и 5 кольцами) оказывается между карбоксилами. Благодаря взаимодействиям между карбоксилами лизоцима и атомами, образующими гликозидную связь, а также искажению валентных углов субстрата, происходит активация и разрыв связи. Это ведет к разрушению оболочки бактериальной клетки.

(Филлипс Д., Трехмерная структура молекулы фермента, в сборнике: Молекулы и клетки, пер. с англ., в. 3, М., 1968; Химия белка, М., 1969; Бернхард С., Структура и функция ферментов, пер. с англ., М., 1971).

Таким образом, осуществляется комплексное противовирусное действие: прерывание репликации вируса на ранних стадиях, стимуляция выхода вириона из капсида, гидролиз вирусной РНК и индукция образования интерферона, а также подавление вторичной микрофлоры и воспаления в области поражения и ускорение эпителизации.

Для приготовления композиции используют лекарственный ферментный препарат «Рибонуклеаза». Препарат получен из поджелудочной железы крупного рогатого скота путем экстракции из измельченного сырья с последующей очисткой и лиофильной сушкой. Лиофильно высушенный порошок «Рибонуклеаза» используется при заболеваниях дыхательных путей с трудно отделяемой мокротой, пародонтозе, гингивите, гнойных ранах, трофических язвах, клещевом энцефалите, тромбофлебите.

РНК-азу в форме указанного препарата не применяют для лечения и профилактики вирусных инфекций вследствие его затрудненного всасывания через неповрежденную кожу и низкого уровня потребительских свойств, а также отсутствия стабильности при содержании влаги свыше 3% и в растворе, с потерей активности фермента в течение суток.

Неожиданно обнаружено, РНК-аза и гидрогенизированный лецитин или бета-циклодекстрин могут быть включены в состав стабильной композиции с сохранением активности указанного фермента в течение длительного времени, несмотря на то, что такая композиция содержит значительное количество воды (до 5%).

Композицию по настоящему изобретению обычно изготавливают общепринятыми способами, используя твердые или жидкие приемлемые носители или эксципиенты, выбранные из эмульгаторов, диспергирующих агентов, консервантов, ароматизаторов, регуляторов pH, полимерных носителей и других эксципиентов, которые целесообразны для приготовления композиций для местного применения. Композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в форме помады, раствора для инъекций, глазных капель, суппозиториев, геля, крема, пасты, мази и тому подобного.

Дополнительными преимуществами указанной композиции являются повышенная стабильность, потенцированное комплексное противовирусное действие, удобство применения, а также легкость дозирования.

Заявленная композиция обладает стабильностью в отношении активности ферментов, входящих в ее состав, при длительном хранении, которая достигается путем иммобилизации ферментов на носителях, содержащихся в указанной композиции. В качестве указанных носителей могут быть использованы любые лецитины, циклодекстрины и полимеры, способные связываться с ферментами с образованием комплексов фермент-носитель. Примерами таких полимерных носителей являются камеди, поливинилпирролидон, каррагинаны, натрия альгинат, полиэтиленгликолевый эфир хитозана, натрий карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилат.

Активность заявленной композиции обусловлена активностью входящего в ее состав фермента и глицирризиновой кислотой или ее солями: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия. Обнаружено, что композиция для местного применения, содержащая РНК-азу 0,001-0,5 мас.%, обладает стабильностью в отношении активности фермента при ее длительном хранении, в то время как активность этого фермента, приготовленных в виде раствора, быстро падает. Глицирризиновая кислота или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия являются устойчивыми соединениями и стабилизации не требуют. Следовательно, заявленная композиция может быть использована для эффективной профилактики РНК-содержащих вирусов, таких как вирус гриппа, парагриппа, паротита, кори, респираторно-синцитиальный вирус, вирус краснухи, риновирус и Другие.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Композиция в виде геля на основе РНК-азы и глицирризината аммония имеет следующий состав:

РНК-аза 0,5 Глицирризинат аммония 0,5 β-циклодекстрин 5,0 эмульгатор 0,5 консервант 1,0 лизоцим 5,0 полимерный носитель 1,0 регулятор pH 1,0 вода деминерализованная 85,50

Указанную композицию готовят по следующей методике. В деминерализованной воде растворяют РНК-азу, β-циклодекстрин, глицирризинат аммония, лизоцим, добавляют эмульгатор, консервант, полимерный носитель, регулятор pH. Полученный гель перемешивают, вакуумируют и гомогенизируют.

ПРИМЕР 2

Композиция в виде глазных капель на основе РНК-азы и глицирризината дикалия имеет следующий состав.

РНК-аза 0,001 Глицирризинат дикалия 0,001 Гидрогенизированный лецитин 0,001 эмульгатор 0,5 консервант 1,0 интерферон 0,001 полимерный носитель 1,0 регулятор pH 1,0 вода деминерализованная 96,496

Указанную композицию готовят по следующей методике. В деминерализованной воде растворяют РНК-азу, глицирризинат дикалия, интерферон, добавляют эмульгатор, консервант, полимерный носитель, Гидрогенизированный лецитин, регулятор pH. Полученный раствор фильтруют и стерилизуют.

ПРИМЕР 3

Композиция в виде суппозиториев основе РНК-азы и глицирризината тринатрия имеет следующий состав:

ДНК-аза 0,5 Глицирризинат тринатрия 0,5 β-циклодекстрин 5,0 эмульгатор 0,5 консервант 1,0 сангвиритрин 5,0 полимерный носитель 1,0 суппозиторная основа 80,5 регулятор pH 1,0 вода деминерализованная 5,0

Указанную композицию готовят по следующей методике. Расплавляют суппозиторную основу при температуре 40°C, в деминерализованной воде растворяют РНК-азу, β-циклодекстрин, глицирризинат тринатрия, сангвиритрин, добавляют эмульгатор, консервант, полимерный носитель, регулятор pH. Полученную массу, перемешивают, гомогенизируют и выливают в форму и охлаждают.

ПРИМЕР 4

Композиция в виде раствора для инъекций для внутривенного и внутримышечного введения на основе РНК-азы и глицирризината аммония имеет следующий состав.

РНК-аза 0,001 Глицирризинат аммония 0,001 Гидрогенизированный лецитин 0,001 эмульгатор 0,5 консервант 1,0 интерферон 0,001 полимерный носитель 1,0 регулятор pH 1,0 вода деминерализованная 96,496

Указанную композицию готовят по следующей методике. В деминерализованной воде растворяют РНК-азу, глицирризинат аммония, интерферон, добавляют эмульгатор, консервант, полимерный носитель, Гидрогенизированный лецитин, регулятор pH. Полученный раствор фильтруют и стерилизуют.

ПРИМЕР 5

Оценка стабильности фермента.

Поскольку главным недостатком РНК-азы является ее нестабильность в присутствии воды от 3%, была проведена сравнительная оценка сохранения активности ферментов при хранении в виде нативного раствора и в виде композиций из ПРИМЕРОВ 1-4.

Активность РНК-азы определяли по следующей методике.

Определение активности РНК-азы проводили по методу Кунитца. За единицу активности РНК-азы принимают наименьшее количество фермента, которое при воздействии его на субстрат в условиях опыта освобождает такое количество кислорастворимых продуктов, которое приводит к возрастанию оптической плотности при длине волны 260 нм на одну единицу. В контрольную и две опытные пробирки вносят по 0,5 мл субстрата (РНК) и по 0,3 мл 0.2М трис-буфера (pH=7). В опытные, предварительно прогретые пробирки, вносят 0,2 мл раствора фермента. Пробы термостатируют в течение 30 минут при температуре 37,5°C. Затем к пробам прибавляют 1 мл охлажденного в ледяной бане 1н раствора хлорной кислоты (HClO₄), в контрольную - 0,2 мл раствора фермента. Пробирки встряхивают и выдерживают в ледяной бане 16-25 минут. Образовавшиеся осадки отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. Из надосадочного слоя отбирают 0,5 мл раствора, добавляют 2,5 мл воды и измеряют оптическую плотность при λ=260 нм.

Результаты приведены в следующей таблице.

Таблица 1 Исследуемые образцы Основные ингредиенты Стабильность при хранении 1 2 3 Гель №1 Согласно Примеру 1 Активность РНК-азы 90% в течение 5 лет наблюдения Глазные капли №2 Согласно Примеру 2 Активность РНК-азы 92% в течение 5 лет наблюдения Суппозитории №3 Согласно Примеру 3 Активность РНК-азы 92% в течение 5 лет наблюдения Раствор для инъекций №4 Согласно Примеру 4 Активность РНК-азы 85% в течение 5 лет наблюдения Раствор нативного фермента (без носителя) - Активность 5% для РНК-азы в течение 1 суток

Как видно из представленной таблицы, использование полимерных носителей и стабилизаторов в композиции позволяет получить стабильные композиции с сохранением активности фермента. в течение 5-х лет наблюдения, благодаря созданию устойчивой конформации фермента β-циклодекстрином, гидрогенизированным лецитином и полимером-носителем.

ПРИМЕР 6

Изучение противогриппозной активности

Изучение противогриппозной активности проводили на белых рандомбредных мышах-самцах массой 18-20 г. Препараты вводили мышам в дозах:

- Композиция, согласно ПРИМЕРУ 4 - 5 мл/кг и 25 мл/кг внутрибрюшинно на протяжении (0.1 мл и 0.5 мл на мышь соответственно) на протяжении 10 дней до заражения вирусом.

- Композиция, согласно ПРИМЕРУ 3 - 100 мг/кг и 500 мг/кг ректально на протяжении 10 дней до заражения вирусом.

- Изопринозин - 500 мг/кг в виде водной взвеси таблеток в расчете на содержание в них активного компонента на протяжении 10 дней до заражения вирусом. Эта доза экстраполирована на мышей с рекомендуемой суточной дозы для человека путем умножения на коэффициент межвидового переноса, равный 10.

В каждой группе использовали по 20 мышей. Контрольная группа мышей (без профилактики) получала дистиллированную воду в объеме 0.5 мл на мышь (25 мл/кг). На 11 день после начала введения препаратов мышей заражали интраназально под легким эфирным наркозом патогенным для них штаммом вируса гриппа A/Pr/8/34 (H0N1) в объеме 0,05 мл на мышь. Летальную дозу вируса определяли в предварительном опыте путем титрования вируса на мышах с последующим вычислением ЛД₅₀.

Результаты опыта оценивали на 5 день, регистрируя летальность мышей в контрольной и опытных группах.

Оценку результатов испытания проводили на основании следующих показателей:

- сравнения процента погибших мышей в контрольной и опытных группах;

- определения индекса защиты испытуемого препарата. Для определения индекса защиты (ИЗ) вычисляли кратность или коэффициент защиты (КЗ) мышей препаратом.

Расчет индекса защиты (ИЗ) осуществляли следующим образом:

.

Результаты испытания противогриппозного профилактического действия препаратов в опытах на мышах представлены в таблице 2.

Профилактическая противовирусная активность препаратов в опытах на мышах, инфицированных вирусом гриппа A/Pr/8/34

Таблица 2 Условия опыта Доза, мг/кг (мл/кг) Количество зараженных животных Из них отмечена гибель Коэффициент защиты (КЗ) Индекс защиты (ИЗ), % Количество % Вода + вирус             гриппа A/Pr/8/34 25 20 16 80 0 0 (группа без             Композиция, согласно             ПРИМЕРУ 2 + 500 20 7 35 2.28 56 вирус гриппа             Композиция,             согласно ПРИМЕРУ 2 + 100 20 8 40 2.0 50 вирус гриппа             Композиция,             согласно             ПРИМЕРУ 4 + 25 20 11 55 1.45 31 вирус гриппа             A/Pr/8/34             Композиция,             согласно ПРИМЕРУ 4 + 5 20 12 60 1.3 24 вирус гриппа            

Изопринозин +             вирус гриппа 500 20 6 30 2.7 63 A/Pr/8/34            

Согласно данным таблицы 2 в контрольной группе вирус A/Pr/8/34 вызывал 80%-ную гибель мышей. Введение животным композиций из ПРИМЕРОВ 2 и 4 снижало процент летальности мышей и увеличивало индекс защиты.

ПРИМЕР 7

Оценка эффективности композиции в отношении вируса гриппа

Для оценки эффективности композиции было проведено исследование композиции из ПРИМЕРА 1. В исследовании принимали участие 50 пациентов в возрасте от 18 до 50 лет, имеющих клинические проявления гриппа. 25 пациентам интраназально вводили трижды в день в течение 7 дней композицию из ПРИМЕРА 1, 25 пациентам было назначено симптоматическое лечение. В данном исследовании выявлены следующие клинические эффекты композиции из ПРИМЕРА 1: отмечено ускорение купирования лихорадки и преобладание во всех возрастных группах критического типа снижения температуры (в среднем у 53% пациентов). Этот эффект объясняется противовирусным действием композиции и подтверждается в сокращении длительности выявления вирусного антигена в мазках со слизистой оболочки носа. Достоверно сокращается длительность насморка и кашля. Выраженная клиническая эффективность композиции из ПРИМЕРА 1 сопровождалась протективным эффектом в отношении последующих заболеваний в течение 6 месяцев. Число эпизодов гриппа на одного наблюдаемого пациента оказалось в 3 раза меньше у получавших терапию композиции из ПРИМЕРА 1. Важным преимуществом терапии композицией из ПРИМЕРА 1 явился профилактический эффект в отношении наслоения вторичной бактериальной флоры: у получавших композицию из ПРИМЕРА 1 осложнения регистрировались достоверно реже (23,7%) в отличие от группы сравнения (45%) (p<0,05). Оценка трансформации формы ринита в гнойный достоверно подтвердила указанный эффект - 7,9% на фоне терапии композицией из ПРИМЕРА 1 и 20% - группа сравнения.

Оценка противовирусного эффекта композиции из ПРИМЕРА 1 проводилась на основании данных ПЦР-диагностики, осуществляемой в 1-2-й и 5-6-й дни болезни. У половины пациентов, получавших композицию из ПРИМЕРА 1, этиологический агент на 5-6-й день болезни не обнаруживался, тогда как в группе сравнения - у трети больных (p<0,05).

Аналогичные данные получены при исследовании композиций из ПРИМЕРОВ 1-3. Таким образом, на основании полученных данных, можно сделать вывод о противовирусном, в т.ч. и профилактическом действии композиций из ПРИМЕРОВ 1-4 в отношении вируса гриппа.

ПРИМЕР 8

Оценка эффективности композиции в отношении вирусов парагриппа. эндемического паротита, кори и краснухи

В работе использовали композицию из ПРИМЕРА 4. Аликвоты композиции из ПРИМЕРА 4 разводили в среде для клеточных культур. В качестве референс-препарата использовали рибавирин в концентрациях 30-300 мкг/мл. В работе были использованы вирус парагриппа человека, вирус эндемического паротита, вирус кори и вирус краснухи. Вирусы культивировали в клетках МА-104. Из исходного вируссодержащего материала готовили серию десятикратных разведении от 10^-1 до 10^-6 на среде MEM. Клетки инфицировали в отдельности вирусом парагриппа человека, вирусом эндемического паротита, вирусом кори и вирусом краснухи в присутствии исследуемых препаратов. Зараженные клетки культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в газопроточном инкубаторе. Срок культивирования составлял 72 часа. Клетки промывали 2 раза нейтральным фосфатным буфером, фиксировали 10 минут при +4°C раствором 80% ацетона, промывали 5 минут дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Продукцию вирусных белков в фиксированных клетках оценивали при помощи иммуноферментного анализа. Первичные типоспецифические антитела против вирусов парагриппа, эндемического паротита, кори и краснухи растворяли в фосфатном буфере с добавлением 5% обезжиренного сухого молока (для блокирования сайтов неспецифического связывания антител с белковыми детерминантами) до концентрации 5 мкг/мл и инкубировали с фиксированными клетками в течение 1 часа при 37°C (0,1 мл на лунку). Клетки промывали 3 раза по 0,1 мл/лунку фосфатного буфера и инкубировали с раствором антимышиного иммуноглобулина, меченного пероксидазой, в разведении 1:10000 (0,1 мл на лунку) в течение 1 часа при 37°C. Несвязавшиеся антитела отмывали 3 раза по 0,1 мл/лунку фосфатного буфера и проводили цветную реакцию с раствором 3,3,5,5-тетраметилбензидина с добавлением 0,03% раствора перекиси водорода в ацетатном буфере pH 5,0 (0,1 мл на лунку). Реакцию останавливали раствором 2М серной кислоты (0,1 мл на лунку) и измеряли оптическую плотность в ячейках при длине волны 450 нм на микропланшетном ридере. Реакцию считали положительной, если оптическая плотность в ячейках превышала фоновые значения для интактных клеток вдвое (такую дозу вируса принимали за 50% экспериментальную инфекционную дозу, EID₅₀) и больше. Репликация вируса в присутствии препаратов была дополнительно изучена по проявлению цитопатогенного действия вируса в культуре клеток. Вирусы культивировали в присутствии препаратов, как описано выше, клетки были промыты 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буфером, и количество живых клеток было оценено при помощи микротетразолиевого теста (МТТ), характеризующего интенсивность митохондриального дыхания живых клеток. С этой целью в лунки планшетов было добавлено по 100 мкл раствора (5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида на физиологическом растворе. Клетки были инкубированы при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 часов и промыты в течение 5 минут фосфатно-солевым буфером. Осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на многофункциональном ридере при длине волны 535 нм. Тест на наличие вируса считали положительным, если оптическая плотность в лунке была в два и более раз меньше, чем в контрольных лунках без вируса. За титр вируса в обоих тестах принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию в половине инфицированных лунок планшета. Титр выражали в логарифмах 50% цитотоксической дозы (Ig CTD₅₀). О вирусингибирующем действии соединений судили по снижению титра вируса в присутствии препарата по сравнению с соответствующими контрольными лунками без препаратов. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и стандартных отклонений, а также расчет 50% эффективных доз при помощи линейной регрессии) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность отличий оценивали по критерию Стьюдента. Достоверными считали различия между группами, если параметр «p» не превышал 0,05. В настоящем исследовании противовирусная активность композицию из ПРИМЕРА 4 в отношении вирусов парагриппа, эндемического паротита, кори и краснухи была изучена при помощи метода иммуноферментного анализа (ИФА).

Данные по влиянию композицию из ПРИМЕРА 4 на продукцию специфических вирусных белков в культуре клеток суммированы в таблице 3.

Таблица 3 Противовирусная активность композицию из ПРИМЕРА 4 в отношении вирусов пара-гриппа, эндемического паротита, кори и краснухи по результатам иммуноферментного анализа Препарат, концентрация Оптическая плотность (1000XOD₄₅₀) в лунках при разведении вируса Титр вируса, Ig ЭИД₅₀* 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 0 (контроль препарата) Композиция из ПРИМЕРА 4 500 м кг/мл 895±27 854±33 826±6 152±11 136±2 4,0±0,0 Композиция из ПРИМЕРА 4 170 м кг/мл 978±3 866±17 853±10 169±8 137±2 4,3±0,3 Композиция из ПРИМЕРА 4 50 м кг/мл 965±14 862±8 849±24 829±13 156±6 4,7±0,3 Рибавирин 50 м кг/мл 890±16 851±21 754±14 212±9 142±5 4,3±0,3 Контроль вируса 947±6 867±8 836±17 829±14   5,0±0,0 Контроль клеток 137±5 - Примечание. * - титр вируса вычислен из трех параллелей на планшете.

По результатам ИФА применение композиции из ПРИМЕРА 4 приводило к 10-кратному снижению вирусной продукции в культуре клеток, при этом активность композиции из ПРИМЕРА 4 в максимальной концентрации вдвое превосходила активность препарата сравнения - рибавирина. При помощи регрессионного анализа была рассчитана 50% эффективная доза (ЕС₅₀) композиции из ПРИМЕРА 4 для вирусов парагриппа, эндемического паротита, кори и краснухи, составившая 203 мкг/мл. Из ранее полученных данных 50% цитотоксическая доза композиции из ПРИМЕРА 4 составляет>1000 мкг/мл, что дает индекс селективности >5. Исходя из полученных результатов, композицию из ПРИМЕРА 4 следует характеризовать как препарат против вирусов парагриппа, эндемического паротита, кори и краснухи. Аналогичные данные получены при исследовании композиций из ПРИМЕРОВ 1-3.

ПРИМЕР 9

Оценка эффективности композиции в отношении риновируса и респираторно-синцитиального вируса

Изучение терапевтической эффективности композиции из ПРИМЕРА 3 было проведено у 51 пациента с диагнозом ОРВИ. Основную группу составили 26 человек в возрасте от 16 до 64 лет, 14 мужчин и 12 женщин, получавших композиции из ПРИМЕРА 3. На основании данных ПЦР-диагностики у 10 человек основной группы был диагностирован респираторно-синцитиальный вирус, у 16 человек - риновирус. На фоне базисной симптоматической терапии композиции из ПРИМЕРА 3 назначали ректально по 1 суппозиторию 3 раза в день в первые 2 дня лечения, затем по 1 суппозиторию 3 раза в день в течение следующих 2 дней; контрольную группу составили 25 больных ОРВИ в возрасте от 15 до 62 лет, 11 мужчин и 14 женщин, которые на фоне базисной терапии получали плацебо в той же дозе.

Лабораторные исследования предусматривали клинический анализ крови, биохимическое исследование крови на мочевину, креатинин, АлАТ, билирубин, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, ЭКГ. Исследования проводились до и сразу после лечения. Подтверждение диагноза ОРВИ проводили методом иммунофлуоресцентной экспресс - диагностики и постановкой РСК и РТГА в динамике. Диагноз ОРВИ был подтвержден лабораторными методами в 88,2% случаев. Клиническое обследование больных включало в себя ежедневный осмотр, двукратную термометрию, контроль АД.

Оценка терапевтической эффективности проводилась по следующим параметрам:

1. Сроки нормализации температуры.

2. Длительность синдрома интоксикации.

3. Длительность катарального синдрома.

4. Возникновение осложнений в процессе лечения.

В результате проведенных исследований было показано:

1. Достоверное сокращение катарального синдрома до (4,16±0,33 дней) у больных, получавших композицию из ПРИМЕРА 3 с 1-3-го дня болезни, в отличие от группы больных, получавших плацебо в аналогичные сроки заболевания (6,1±0,36 дней).

2. Отсутствие токсичности применяемой композиции из ПРИМЕРА 3 по результатам лабораторно-клинического изучения. Отмечена хорошая переносимость препарата, побочных явлений на фоне его назначения не отмечалось.

Полученные данные свидетельствуют о терапевтической эффективности композиции из ПРИМЕРА 3 в отношении риновируса и респираторно-синцитиального вируса.

Аналогичные данные получены при исследовании композиций из ПРИМЕРОВ 1, 2, 4.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, такими как вирус гриппа, парагриппа, паротита, кори, респираторно-синцитиальный вирус, вирус краснухи, риновирус, содержащую в качестве активного ингредиента 0,001-0.5 мас.% рибонуклеазы (РНК-азы) и 0.001-0,5 мас.% глицирризиновую кислоту или ее соли: глицирризинат аммония или дикалия или тринатрия, в качестве носителей: 0,05-1,0 мас.% полимерный носитель, 0,001-5,0 мас.% β-циклодекстрины или гидрогенизированный лецитин и приемлемые эксципиенты. Изобретение обеспечивает сохранение активности фермента рибонуклеазы в течение длительного времени, повышенную стабильность, потенцированное комплексное противовирусное действие. 1 з.п. ф-лы, 9 пр., 3 табл.

1. Композиция для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, такими как вирус гриппа, парагриппа, паротита, кори, респираторно-синцитиальный вирус, вирус краснухи, риновирус, содержащая в качестве активного ингредиента 0,001-0,5 мас.% рибонуклеазы (РНК-азы) и 0,001-0,5 мас.% глицирризиновую кислоту или ее соли: глицирризинат аммония, или дикалия, или тринатрия, в качестве носителей: 0,05-1,0 мас.% полимерный носитель, 0,001-5,0 мас.% β-циклодекстрины или гидрогенизированный лецитин и приемлемые эксципиенты.

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая 0,001-5,0 мас.% сангвиритрин, или интерферон, или лизоцим и приемлемые эксципиенты при следующем соотношении компонентов, мас.%:
РНК-аза 0,001-0,5 глицирризиновая кислота   или ее соли: глицирризинат аммония,   или дикалия, или тринатрия 0,001-0,5 сангвиритрин, или интерферон, или лизоцим 0,001-5,0 β-циклодекстрин или гидрогенизированный лецитин 0,001-5,0 консервант 0,5-1,0 полимерный носитель 0,05-1,0 регулятор pH 0,05-1,0 вода деминерализованная 1,00-5,00 гидрофильная основа 86,00-98,397