ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis С ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ФИТАЗЫ (ВАРИАНТЫ), КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КОРМЛЕНИЯ ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ КОРМЛЕНИЯ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 A23K1/16 

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям бацилл, для которых характерны быстрое развитие и прорастание спор в солях желчных кислот (имитирующих среду кишечника) и высокий уровень секреции фитазы. Композиция бацилл может использоваться как добавка к корму для животных, поскольку обладает пробиотическим эффектом (способствует росту и здоровому развитию организма) и усиливает расщепление и усвоение питательных веществ из кормов.

Уровень техники изобретения

Пробиотические бактерии, такие как Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, применяются при производстве кормов для обогащения рациона животных. Применение бактерий дает возможность уменьшить количество или полностью заменить антибиотики, используемые в рационе животных как стимуляторы роста.

Компания Christian Hanses A/S (Дания) выпустила на рынок пример такого способствующего росту пробиотического продукта под торговым названием GalliPro^® (зарегистрированный как DSM 17231). GalliPro^® представляет собой композицию спор Bacillus subtilis.

Кроме предполагаемых видов активности (иммуномодулирующей, модифицирующей флору кишечника) пробиотические бациллы могут производить большое количество других полезных компонентов. Например, это ферменты, которые, будучи добавлены в корма для животных, секретируются в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ). Ферменты, такие как фитаза, секретируются и улучшают пищеварение и усвоение кормов для животных (повышение усвояемости). Диета (питание) этих животных в основном растительная и состоит из зерна, кукурузы, соевых бобов, соевого масла и аминокислот. В целом, таким образом можно получать высокоценные продукты для животных.

Фитаза - один из ферментов, широко используемых в производстве кормов для животных. В рацион животных фитаза вводится для улучшения усвоения фосфора. Фитат - преобладающая форма фосфора в семенах злаков, масличных и бобовых культурах. Однако моногастричные животные, такие как свиньи, птица и рыба, мало используют этот источник фосфата, потому что в их желудочно-кишечном тракте не содержится ферментов, необходимых для выделения фосфата из органического комплекса фитата. Следовательно, большое количество потребляемого с пищей фитата проходит через ЖКТ и выделяется с навозом. В воде и почве происходит каталитическое выделение фосфата, и фитат в навозе ведет к серьезному загрязнению фосфором, приводящее к эвтрофикации грунтовых вод. Кроме того, в соответствии с требованиями рациона животных производители вынуждены вводить в него дополнительный дорогостоящий фосфор. Далее, фитат обладает также непищевыми свойствами, ведущими к образованию комплексов с белками и дивалентными катионами, снижающими их биодоступность.

Было достоверно описано, что введение фитазы улучшает усвоение фосфата моногастричными животными и улучшает также биодоступность минералов.

Споры бацилл устойчивы к кислой среде желудка и способны прорастать и развиваться в ЖКТ животных. Это дает большие преимущества, поскольку, будучи проглоченными, они экскретируют несколько видов полезных компонентов, например бактериоцин, и полезных ферментов, таких как фитаза. Более того, споры бацилл термоустойчивы в процессе грануляции кормов и потому являются прекрасной транспортной системой для доставки бактериоцинов и ферментов в ЖКТ.

Желчь играет важную роль в процессах жизнедеятельности и развития бацилл в ЖКТ. Желчь производится печенью и хранится в желчном пузыре. Желчь содержит воду, лецитин, билирубин и биливердин и соли желчных кислот.

Из литературы известно, что желчь оказывает негативное влияние на жизнедеятельность, прорастание и развитие споровых клеток бацилл в вегетативные клетки в ЖКТ животных. Проводятся дальнейшие исследования для обнаружения пробиотических штаммов бацилл, устойчивых к желчи.

В работе (Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 авг; 90(2): 139-46. Опубликовано в интернете: 2006 июль 4) описано выделение образцов клеток бацилл непосредственно из кишечника цыплят. В выделенных клетках бацилл была определена пробиотическая активность. Шесть образцов бацилл с наивысшей пробиотической активностью были исследованы на устойчивость к солям желчных кислот, и было обнаружено, что бациллы, обладающие высокоспецифической пробиотической активностью, также имеют относительно высокий уровень устойчивости к солям желчных кислот.

В упомянутой работе при тестировании устойчивости к желчи не делается специального акцента на какие-либо временные отрезки. В экспериментальной части работы споры бацилл просто тестируются на устойчивость через 5 дней после добавления солей желчных кислот (см. раздел «Simulated small intestinal fluid tolerance test», стр 141).

В патенте США US2003/0124104A описано, что стандартные пробиотические эндоспоры бацилл чувствительны к низким концентрациям солей желчных кислот, т.е. прорастание и/или регидратация спор замедляется в присутствии даже низких концентраций солей желчных кислот. Это противоречит данным о других бактериях, таких как кишечные патогены E.coli и S.aureus (см. раздел [0015]-[0015]). В виду сказанного предложено скриннировать/выбирать споры бацилл, устойчивые к ингибирующей активности солей желчных кислот и в итоге способные прорастать в вегетативные клетки, которые затем колонизируют кишечник (см. [0019]).

Рабочие примеры присутствуют, но в описании не содержится действительных экспериментальных данных о реально изученных специфических клетках бацилл.

Далее, условия исследования солей желчных кислот описаны достаточно общо. В частности, не содержится указаний на временные рамки исследования устойчивости к желчи. Другими словами, основываясь исключительно на широком/общем изучении этих документов, могут быть выбраны клетки бацилл, которые способны активироваться (прорастать) медленно, т.е. способны к прорастанию из спор в вегетативные клетки после, например, 20 часов в присутствии соответствующего количества соли желчных кислот.

В этом документе не содержится описания или предложения выбрать клетки бацилл, которые способны быстро активироваться (прорастать), то есть способных к развитию и прорастанию из спор в вегетативные клетки с достижением определенной точки роста за определенный интервал времени в присутствии соответствующих количеств соли желчных кислот.

В общем, в предыдущем уровне техники изобретения, относящемуся к выбору/изучению клеток бацилл, устойчивых к солям желчных кислот, не делается упора на скорое прорастание/рост клеток спор в вегетативные клетки бацилл.

В результате предыдущий уровень техники изобретения описывает несколько тестовых/скриннинговых систем для выбора штаммов бацилл, продуцирующих фермент фитазу.

Обнаружен пример в патенте США US6255098, в котором идентифицируются штаммы бацилл, продуцирующие фермент фитазу. В нем не содержится упоминаний об устойчивости к желчи идентифицированных штаммов бацилл.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предоставляет композицию бацилл, которая экскретирует большие количества фитазы в ЖКТ животных.

Решение основано на новом методе селекции, созданном для идентификации новых улучшенных композиций бацилл, разработанном изобретателями ранее. В настоящем документе новым важным шагом в методике отбора является специфический скрининг/селекция спор бацилл с улучшенными показателями/высокой скоростью развития и прорастания спор в вегетативные клетки в присутствии солей желчных кислот.

Как описано выше, предыдущий уровень техники изобретения описывает методы селекции клеток бацилл, способных к росту в присутствии солей желчных кислот, но предыдущий уровень техники изобретения скрининга/селекции не делает акцента на скорости развития и прорастания спор в присутствии солей желчных кислот. Соответственно, в предыдущем уровне техники изобретения отобранные клетки бацилл, устойчивые к желчи, неспособны активироваться и прорастать достаточно быстро, чтобы соответствовать критерию скорости развития и прорастания, описанным в настоящем документе. Например, не были отобраны (при нормальном давлении) клетки бацилл, выделенные непосредственно из кишечника цыплят (как, например, описано в обсуждаемой выше работе Antonie Van Leeuwenhoek), поскольку они недостаточно быстро активировались и прорастали в кишечном тракте.

Как показано в рабочих примерах настоящего документа, это верно и для коммерчески доступной композиции бацилл GalliPro^®, которая в присутствии физиологических количеств солей желчных кислот активируется и прорастает слишком медленно и не достигает определенной точки роста в течение первых 20 часов, т.е. не удовлетворяет критериям скорости развития и прорастания, описанным в настоящем документе. GalliPro^® - это коммерчески успешная композиция Bacillus subtilis.

В настоящем документе описан новый штамм DSM 19467, который был получен с использованием GalliPro^® как исходного штамма методом селективного отбора с последующим выделением спор для быстрого развития и прорастания в вегетативные клетки в присутствии солей желчных кислот, как описано в настоящем документе.

Более детальную информацию можно получить, например, из Таблицы 1 (GalliPro^® может в настоящем документе также называться DSM 17231).

Это схематично проиллюстрировано на Фиг.1 в настоящем документе.

Резюмируя, полагают, что не существует более ранних уровней техники изобретения, описывающих выделенную композицию бацилл, которая включает 10⁵-10¹² КОЕ/г клеток бацилл, в которой клетки композиции бацилл удовлетворяют обоим критериям: быстрому развитию и быстрому прорастанию в присутствии солей желчных кислот, как описано в настоящем документе.

Без теоретических ограничений, изобретатели в настоящей работе выявили, что скорое развитие и прорастание спор являются очень важным аспектом изобретения, поскольку споры бацилл, которые устойчивы к желчи, неспособны активироваться и прорастать достаточно быстро. Такие споры будут экскретированы до того, как вегетативные клетки бацилл смогут оказать какое-либо положительное влияние (например, продукцию фитазы) в достаточной степени.

Споры бацилл, прорастающие слишком медленно, просто пройдут через ЖКТ до того, как бактерии смогут произвести, например, какое-либо значительное количество фитазы.

После ряда детальных тестов и анализов изобретатели решили работать с временными отрезками до 20 часов и выбрать споры, активирующиеся и прорастающие быстрее всего в течение данного временного отрезка в присутствии высоких физиологических концентраций солей желчных кислот. Без теоретических ограничений и основываясь на приведенных в настоящем документе экспериментальных данных, изобретатели в настоящей работе установили, что важно, чтобы развитие и прорастание спор были быстрыми в течение первых 18 и 19 часов в присутствии 4 и 6 мМ соли желчных кислот соответственно.

Изобретателями в настоящей работе было установлено, что клетки бацилл, отобранные по высокой скорости развития и прорастания в среде соли желчных кислот, оказываются очень полезными как исходные клетки для мутагенеза при получении новых клеток с улучшенной продукцией фитазы.

Как показано на Фиг.1 и в Таблице 2, для классической мутации как исходный штамм был использован быстро прорастающий устойчивый к желчи штамм DSM 19467 и в результате был выбран штамм DSM 19489 с высокой продукцией фитазы. Похожим образом был получен Генно-Модифицированный Организм (ГМО), штамм DSM 19466, с использованием штамма DSM 19467 в качестве исходного. Как представлено в Таблице 2 и в соответствующем описании в примере 4, DSM 19489 и DSM 19466 продуцируют значительно большие количества фитазы, чем DSM 19467 и GalliPro^®. Штаммы DSM 19489 и DSM 19466 с высоким уровнем продукции фитазы были перепроверены на способность быстро активироваться и прорастать, как описано в настоящем документе. Они поддерживали быстрое развитие и прорастание быстрорастущего устойчивого к желчи штамма DSM 19467 (см. пример 5 в настоящем документе).

Это схематично проиллюстрировано на Фиг.1 в настоящем документе.

В настоящем документе описаны новые пробиотические клетки бацилл, которые устойчивы к желчи, быстро активируются и прорастают и экскретируют большие количества фитазы. Полученные штаммы чрезвычайно полезны как пробиотические композиции бацилл для ведения в корм для животных. Это дополняет выгодную особенность композиций бацилл пробиотических бактерий - способность к выживанию и пролиферации в кишечнике животных (где присутствуют высокие уровни соли желчных кислот), способность ингибировать патогенные бактерии (продукция бактериокинов) и дополнительно экскретировать высокие уровни фитазы, благотворно сказывающиеся на расщеплении и усвоении доступного фосфора из фитата.

Соответственно, первый аспект изобретения относится к композиции бацилл, которая включает 10⁵-10⁷ КОЕ/г спор бацилл, споры бацилл быстро активируются и прорастают в вегетативные клетки в среде в присутствии 4 и 6 мМ солей желчных кислот, что определяется достижением точки роста вегетативной клетки OD₆₃₀ 0,4 в течение менее чем 18 и 19 часов соответственно, причем точка роста вегетативной клетки - это точка на кривой роста, где оптическая плотность начинает непрерывно расти (в соответствии с увеличением количества вегетативных клеток) и достигает значения OD₆₃₀ 0,4.

(I): в котором среда соли желчных кислот является стандартной известной неселективной средой инфузионного телячьего бульона (Veal Infusion Broth, VIB) из примера 1 в настоящем документе, дополненной смесью солей желчных кислот, в которую входят конъюгированные соли желчных кислот тауродеоксихолат, гликодеоксихолат и деконъюгированные соли желчных кислот деоксихолат в пропорции 60% тауродеоксихолат, 30% гликодеоксихолат и 10% деоксихолат; и

в котором анализ по оптической плотности осуществлялся в следующей последовательности:

(а) наполнение лунки титрационного микропланшета 0,150 мл среды с солью желчных кислот, содержащей 10⁸ спор бацилл на мл среды (это точка отсчета); и

(b) инкубация планшета при 37°С при атмосферных условиях и измерение значений оптической плотности OD₆₃₀ c использованием спектрофотометра и с встряхиванием перед каждым считыванием результатов для получения репрезентативной кривой роста во времени;

и

(ii) вегетативные клетки бацилл продуцируют фитазу в количестве, по меньшей мере, в 1,25 раз больше, чем контрольные клетки бацилл штамма DSM 19467, в котором количество продуцированной фитазы измеряется стандартным методом в примере 2 в данной работе после 4 часов роста при 37°С в стандартной известной неселективной среде - инфузионного сердечного бульона (Heart Infusion Broth, HIB) в примере 2 в настоящем документе; и

в котором анализ стандартным методом проводится в следующей последовательности:

(а) получение ночной культуры вегетативных клеток бацилл в обогащенной среде для выращивания культур и

(b) перенесение 1% инокулята из ночной культуры в среду HIB (точка отсчета) и инкубация при 37°С до измерения фитазной активности.

Как обсуждалось выше, контрольные клетки бацилл DSM 19467 были выбраны по способности к быстрому развитию и прорастанию в присутствии соли желчных кислот с использованием GalliPro^® в качестве исходного штамма. При выборе DSM 19467 не принималась во внимание улучшенная продукция фитазы. Без теоретических ограничений, считается, что в настоящем документе данные о продукции фитазы для DSM 19467 соответствуют таковым для GalliPro^®.

В связи с пунктом (I) точка роста вегетативных клеток для штамма GalliPro^® лежит по крайней мере после 20 часов инкубации в 4 и 6 мМ соли желчных кислот и для нового DSM 19480 штамма, как описано в настоящем документе, она находится после 14 и 15 часов инкубации с 4 и 6 мМ солью желчных кислот соответственно (см. Фиг.2 и рабочий пример 3 в настоящем документе).

Здесь уместно подчеркнуть, что изобретателями в настоящей работе для определения точки роста вегетативных клеток в условиях по пункту (i) первого аспекта изобретения также был протестирован коммерчески доступный продукт CALSPORIN^® (Calpis Co, Ltd., Japan). Как и GalliPro^®, коммерческий продукт CALSPORIN^® является композицией Bacillus Subtilis, используемой как пробиотическая добавка к пище. Точка роста вегетативных клеток в условиях по пункту (i) первого аспекта изобретения для CALSPORIN^® была более чем 20 часов в 4 и 6 мМ соли желчных кислот. Это значительно большее время, чем 18 и 19 часов, необходимые в пункте (i), и это иллюстрирует, что коммерчески доступные продукты прежде не были выбраны по условиям быстрого развития и прорастания. Как обсуждалось выше, «природные» клетки бацилл не подвержены селективному давлению для отбора по высокой скорости развития и прорастания. Без теоретических ограничений, считается, что эти «природные» клетки бацилл не подчиняются условиям, указанным в пункте (i) первого аспекта.

Оба типа анализа - устойчивости к желчи (по пункту (i)) и фитазный (по пункту (ii)) основаны на известных, коммерчески доступных стандартных компонентах (например, стандартные среда, соли желчных кислот, стандартизированные измерения оптической плотности и стандартные тесты).

Контрольные клетки бацилл зарегистрированы как DSM 19467 и ввиду этого общедоступны. Клетки Bacillus Subtilis зарегистрированы как DSM 17231 (названные GalliPro^®) и ввиду этого общедоступны.

Соответственно, основываясь на детальном описании анализа в настоящем документе (см., например, описание анализа устойчивости к желчи в примере 1 в настоящем документе и описание фитазного анализа в примере 2), квалифицированный человек сможет по стандартной методике повторить эти анализы, чтобы объективно определить, устойчивы ли целевые клетки бацилл к желчи (по пункту (i)) и фитазе (по пункту (ii)) на уровне, указанном в первом аспекте изобретения.

Новая композиция бацилл, как описано в настоящем документе, может быть использована как пробиотическая добавка к кормам для животных. Расчет дозировки и введение препарата могут быть выполнены в соответствии с уровнем техники изобретения как, например, было сделано для предыдущего уровня техники изобретения - композиции бацилл GalliPro^®.

Соответственно, второй аспект изобретения относится к методике кормления животного, включающей введение композиции бацилл по первому аспекту. В настоящем документе описаны связанные примеры осуществления изобретения применительно к животным в сочетании с другими ингредиентами кормов для животных.

Третий аспект изобретения относится к методике скрининга и выделения новых клеток бацилл, включающей следующие стадии:

(а) выбор и выделение из пула индивидуальных спор бацилл новой споры, которая способна к настолько быстрым развитию и прорастанию, что достигает точки роста вегетативной клетки менее чем за 18 и 19 часов в условиях по пункту (i) первого аспекта изобретения;

(b) получение вегетативной клетки бацилл из выделенной по пункту (а) споры и мутация новой выбранной и выделенной клетки для получения пула новых индивидуальных вегетативных клеток бацилл;

(с) выбор и выделение из пула новых индивидуальных вегетативных клеток бацилл (b) новой вегетативной клетки бацилл, которая способна продуцировать фитазу в количестве, по крайней мере, в 1,25 раз больше, чем контрольные клетки бацилл, зарегистрированные как DSM регистрационный номер 19467 в условиях по пункту (ii) первого аспекта изобретения; и

(d) анализ высокопроизводительных вегетативных клеток бацилл по пункту (с) для того, чтобы подтвердить, что они способны к быстрым развитию и прорастанию в пункте (а), и выделение выбранной клетки бацилл.

Квалифицированному человеку очевидно, что, поскольку в настоящем документе изобретатели раскрывают релевантные тестовые анализы (в частности, анализ для тестирования быстрого развития и прорастания в примере 1) и контрольный штамм DSM 19467, для квалифицированного человека будет стандартной работой выбрать другие новые клетки бацилл, удовлетворяющие критериям по первому аспекту изобретения.

Как обсуждается в настоящем документе, используя метод скрининга/селекции, описанный в настоящем документе, изобретатели выбрали и выделили несколько новых улучшенных клеток бацилл, которые были зарегистрированы.

Соответственно, четвертый аспект изобретения относится к клеткам бацилл, выбранных их группы, включающей:

(а) клетки Bacillus Subtilis, регистрационный номер DSM 19467,

(b) клетки Bacillus Subtilis, регистрационный номер DSM 19489, и

(c) клетки Bacillus Subtilis, регистрационный номер DSM 19466,

или соответствующего мутантного штамма, в котором мутантный штамм получен с использованием зарегистрированных штаммов в качестве исходного материала и в котором мутантный штамм сохраняет все основные свойства зарегистрированного штамма. Возможные осуществления настоящего изобретения описаны ниже исключительно на примерах.

Определения

Все определения данных в настоящем документе релевантных терминов находятся в соответствии с тем, что будет понято опытным человеком в связи с данным в настоящем документе релевантным техническим контекстом.

Термин «клетка бацилл» относится здесь как к споре, так и к вегетативной клетке бацилл.

Термин «спора бациллы» в отношении споры клетки бацилл относится в настоящем документе к споре, которая в соответствии с уровнем изобретения может быть охарактеризована как находящаяся в состоянии покоя, твердая нерепродуктивная структура, производимая бациллами. Первоочередная функция спор, в общем, - обеспечить выживание бактерий в периоды, когда внешние условия становятся неблагоприятными. Они также устойчивы к ультрафиолетовому излучению и гамма-излучению, дессикации, лизозиму, температуре, голоду и химическим способам воздействия. Споры обычно содержатся в почве и воде, где они могут сохраняться длительное время. Оболочка спор непроницаема для многих токсичных молекул, может также содержать ферменты, участвующие в росте спор. Ядро споры содержит обычные клеточные структуры, такие как ДНК и рибосомы, но оно метаболически неактивно. Когда окружающая среда становится для бактерии неблагоприятной, она может начать процесс споруляции, который занимает около 8 часов.

Термин «вегетативная клетка бацилл» относится к функциональным вегетативным клеткам бацилл, которые могут делиться и производить больше вегетативных клеток.

Термин «развитие и прорастание» относится к развитию и прорастанию спор бацилл в вегетативные клетки. Как известно опытному человеку, реактивация спор происходит при наступлении благоприятных условий и включает развитие и прорастание. Развитие включает начало метаболитической активности в спящей споре, что прерывает гибернацию. Обычно это характеризуется разрывом или абсорбцией оболочки споры, набуханием споры, увеличением метаболитической активности и потерей устойчивости к воздействию окружающей среды. Прорастание, которое следует за развитием, включает производство оболочкой споры новых химических компонентов и выход из старой оболочки споры для развития в функциональную вегетативную бактериальную клетку, которая может делиться и производить другие клетки.

Кривые роста (OD во времени) клеток бацилл имеют определенные фазы роста. Когда споры попадают в среду, богатую нутриентами, начало роста дает временное увеличение OD (фаза 1), которое ведет к высвобождению дипиколиновой кислоты и следующей за ним гидратации ядра споры. Во второй фазе (фаза II=фаза прорастания) наступает период с относительно небольшими изменениями OD до тех пор, пока споры развиваются в функциональные вегетативные клетки, которые могут делиться и производить другие клетки и таким образом давать последовательное увеличение OD. Точка, когда начинается постоянный рост значений OD с достижением значения 0,4, в настоящем документе называется «точка роста вегетативной клетки».

Термин «оптическая плотность» здесь определяется как оптическое поглощение, измеренное с использованием спектрофотометра. Оптическая плотность OD является поглощением оптического элемента при заданной длине волны λ на единицу длины. Если OD измеряется при длине волны 630 нм, она может быть названа OD₆₃₀.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: На этом рисунке представлены этапы получения новых улучшенных штаммов в настоящем документе. Рабочие примеры в настоящем документе начинались с DSM 17321 (GalliPro^®), который был подвергнут классическому мутагенезу, после чего скринирован/отобран по быстрым развитию и прорастанию в присутствии соли желчных кислот с получением нового отобранного штамма DSM 19467. DSM 19467 был использован как исходный штамм для классического мутагенеза и в результате был отобран штамм DSM 19489 с высоким уровнем продукции фитазы. Похожим образом на основании штамма DSM 19467 был получен Генно-Модифицированный Организм (ГМО) штамм DSM 19466.

Фиг.2а и 2b: На этих рисунках ясно показано, как ускорились развитие и прорастание спор бацилл штамма DSM 19489 в настоящем изобретении по сравнению с DSM 17231 в присутствии 4 и 6 мМ соли желчных кислот, как описано в настоящем документе.

Подробное описание изобретения

Композиция бацилл

Термин «композиция бацилл» должен пониматься в соответствии с уровнем техники изобретения. В настоящем документе под ним понимается композиция бацилл, содержащая некоторое количество спор бацилл с необходимыми свойствами.

Композиция бацилл может содержать клетки бацилл различных типов (например, Bacillus Subtilis и Bacillus licheniformis). В сущности, композиция должна только содержать данное в первом аспекте настоящего документа количество спор бацилл, которые отвечают критериям, установленным в первом аспекте.

Опытному человеку известно, что коммерчески доступные в настоящем документе композиции спор бацилл в основном получают ферментацией. Полученные споры обычно концентрируются, высушиваются, смешиваются с носителем и упаковываются в подходящий контейнер.

Соответственно, в коммерчески доступной форме для опытного человека могут присутствовать, например, 10⁵-10⁷ КОЕ/г бацилл.

Соответственно, в возможном способе осуществления изобретения в композиции присутствуют 10⁵-10⁷ КОЕ/г спор бацилл в высушенном (высушенным распылением) или замороженном состоянии.

В предпочтительном способе осуществления изобретения композиция бацилл содержит 10⁶-10¹² КОЕ/г спор бацилл, более предпочтительно, если она содержит 10⁷-10¹² КОЕ/г спор бацилл.

Термин «КОЕ/г» отнесен к грамму веса композиции как таковой, включающей подходящие соответствующие добавки, присутствующие в составе композиции. Он не включает вес подходящего контейнера, используемого для упаковки композиции бацилл.

Вариант осуществления изобретения связан с упаковкой композиции в подходящий контейнер.

Как известно опытному человеку, в общем, бактериальная композиция, имеющая коммерческое значение, включает другие подходящие добавки, такие как, например один носитель/ингредиент из группы, относящейся к сывороткам, проницаемый для сыворотки. Карбонат кальция/лиместон и антислеживающий агент, такой как силикат алюминия или кизельгур (инфузорная земля).

Кроме того, в настоящем документе соответствующая композиция клеток бацилл может также включать другие соответствующие целевые микроорганизмы, такие как целевые молочнокислые бактерии.

Клетки бацилл

Клетка бацилл может быть любой подходящей целевой клеткой бациллы.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки бацилл, по крайней мере, одна клетка бацилл из серии клеток из группы, состоящей из:

Bacillus subtilis и Bacillus uniflagellatus, Bacillus lateropsorus, BOD, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus и Bacillus Sterothermophilus, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus mycoides, Bacillus cereus, Bacillus cirucans.

В наиболее предпочтительном способе осуществления изобретения клетки бацилл это B. Subtilis, Bacillus licheniformis.

Наиболее предпочтительно, если клетки бацилл - это клетки B. Subtilis.

Анализ по скорости развития и прорастания в присутствии соли желчных кислот.

Как обсуждалось выше, анализ устойчивости к желчи по пункту (i) первого аспекта основывается на известных коммерчески доступных стандартных элементах (таких, как стандартная среда, соли желчных кислот, стандартные измерения OD).

Соответственно, основываясь на детальном описании анализа в настоящем документе (см., например, пример 1 в настоящем документе), опытный человек способен стандартным образом повторить этот анализ, чтобы объективно определить, удовлетворяет ли определенная целевая спора бацилл критериям скорого развития и прорастания из споры в вегетативную клетку, как описано в пункте (i).

В пункте (i) объясняется, что точка роста вегетативной клетки - это точка на кривой роста, начинающейся с 10⁸ спор/мл, соответствующая OD от 0,2-0,3 до увеличения OD (благодаря росту вегетативных клеток) постоянным образом до значения OD 0,4. Этот параметр опытный человек может трактовать как точку роста вегетативных клеток, и, основываясь на кривой роста, опытный человек может опередить ее путем стандартных операций с точностью ±30 минут, как описано в настоящем документе.

Рабочие примеры 1 в настоящем документе представляют детальное описание анализа устойчивости к солям желчных кислот, подходящего для отбора по быстрым развитию и прорастанию в присутствии соли желчных кислот. Детальные условия примера 1 в настоящем документе являются предпочтительными условиями анализа для того, чтобы установить, удовлетворяет ли спора бацилл критерию по пункту (i) первого аспекта.

Термин «соль желчных кислот» относится к солям желчных кислот. Желчные кислоты - это стероидные кислоты, содержащиеся, в основном, в желчи млекопитающих. Они продуцируются в печени путем окисления холестерина, хранятся в желчном пузыре и секретируются в кишечник в форме солей. Они функционируют как поверхностно-активные вещества, эмульгируя липиды и способствуя их абсорбции и усвоению. Соль желчных кислот, использованная в примере 1, была приготовлена на основе физиологических концентраций и состава свиной соли желчных кислот. Как известно опытному человеку, состав соли желчных кислот свиньи в настоящем документе может считаться относительно «жесткими» условиями по сравнению с составом птичьей соли желчных кислот.

Термин «среда соли желчных кислот» относится к среде, содержащей факторы роста бацилл как подходящие нутриенты и соль желчных кислот.

Точка роста вегетативных клеток - в соли желчных кислот - анализ - пункт (I) первого аспекта.

Как отмечено выше, в отношении пункта (I) первого аспекта, скорость развития и прорастания споры бацилл в вегетативную клетку, как описано в настоящем документе, так высока, что они достигают точки роста вегетативной клетки OD 0,4 за менее чем 18 и 19 часов, в 4 мМ и 6 мМ соли желчных кислот соответственно.

Как сказано выше, новый DSM 19467 штамм достигает точки роста вегетативных клеток через 14 и 15 часов в 4 и 6 мМ соли желчных кислот соответственно.

Таким образом, в предпочтительном способе осуществления изобретения споры бацилл достигают точки роста вегетативной клетки после 17 и 18 часов в 4 мМ и 6 мМ соли желчных кислот в условиях по пункту (I) первого аспекта, более предпочтительно споры бацилл достигают точки роста вегетативной клетки после 15 и 16 часов в 4 мМ и 6 мМ соли желчных кислот в условиях по пункту (I) первого аспекта.

Как объяснялось выше и схематически показано на Фиг.1, новый штамм DSM 19467, описанный в настоящем документе, был выбран с использованием коммерчески доступного GalliPro^® как исходного штамма для мугатенеза и селекции для получения штамма с высокой скоростью прорастания в присутствии соли желчных кислот, как описано в настоящем документе.

Состав GalliPro^® включает Bacillus Subtilis. А Bacillus Subtilis зарегистрированы как DSM 17231. Соответственно, GalliPro^® может здесь рассматриваться как контрольный штамм.

Как указано выше, начальная точка роста вегетативных клеток для GalliPro^® находится через 20 часов инкубации в 4 и 6 мМ соли желчных кислот в условиях по пункту (I) первого аспекта. Соответственно, в возможном способе осуществления изобретения споры бацилл достигают точки роста вегетативной клетки, по меньшей мере, на 3 часа раньше, чем контрольные клетки Bacillus Subtilis, зарегистрированные как DSM 17231 (GalliPro^®). В условиях по пункту (I) первого аспекта более предпочтительно споры бацилл достигают точки роста вегетативной клетки, по меньшей мере, на 4 часов раньше, чем контрольные клетки Bacillus Subtilis, зарегистрированные как DSM 17231 (GalliPro^®). В условиях по пункту (I) первого аспекта наиболее предпочтительно споры бацилл достигают точки роста вегетативной клетки, по меньшей мере, на 5 часов раньше, чем контрольные клетки Bacillus Subtilis, зарегистрированные как DSM 17231 (GalliPro^®).

Фитазный анализ

Как обсуждалось выше, фитазный анализ по пункту (ii) первого аспекта основан на стандартных известных коммерчески доступных компонентах (таких, как, например, стандартная среда, стандартный тест).

Соответственно, основываясь на детальном описании анализа (см., например, пример 2 в настоящем документе) опытный человек способен на основании стандартных процедур повторить этот анализ, чтобы объективно определить, действительно ли конкретные вегетативные целевые клетки бацилл производят такое количество фитазы, как описано в пункте (ii).

Рабочий пример 2 в настоящем документе предоставляет детальное описание фитазного анализа. Детальные условия в примере 2 в настоящем документе соответствуют предпочтительному способу фитазного анализа для определения, действительно ли конкретные вегетативные целевые клетки бацилл отвечают критерию из пункта (ii) первого аспекта изобретения.

Количество продуцируемой фитазы - пункт (ii) первого аспекта

Как говорилось выше, в отношении пункта (ii) первого аспекта вегетативные клетки Bacillus продуцируют фитазу в количествах, по меньшей мере, в 1,25 раз больше, чем контрольные клетки бацилл DSM 19467 в условиях по пункту (ii) первого аспекта.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, вегетативные клетки бацилл производят фитазу в количестве, по крайней мере, в 1,5 раза больше, чем контрольные клетки бацилл DSM 19467 в условиях по пункту (ii) первого аспекта, более предпочтительно вегетативные клетки бацилл производят фитазу в количестве, по крайней мере, в 1,75 раза больше, чем контрольные клетки бацилл DSM 19467 в условиях по пункту (ii) первого аспекта.

Метод скармливания/введения спор бацилл животным.

Как говорилось выше, второй аспект изобретения относится к методу кормления животных, включающем введение композиции бацилл по первому аспекту и в настоящем документе описаны связанные с этим варианты осуществления изобретения по отношению к животным в сочетании с другими ингредиентами животной пищи.

Животное может быть любым целевым животным. Предпочтительно, чтобы животное выбиралось из группы, включающей домашнюю птицу, свиней, жвачных животных, телят, кроликов, лошадей, рыбу и домашних животных.

Введение GalliPro^® в соответствии с уровнем техники изобретения в норме осуществляется в дозировке около 10⁴-10⁸ КОЕ/г пищи, обычно 10⁵-10⁶ КОЕ/г пищи или в дозах, эквивалентных нормальному потреблению пищи на кг веса животного.

Также возможны следующие пути введения спор бацилл в организм животных:

введение с питьевой водой для животных,

распыление на животных,

нанесение в виде пасты, геля или пищевого комка.

Метод скрининга и выделения новых клеток бацилл

Как сказано выше, третий аспект изобретения относится к методу скрининга и выделения новых клеток бацилл.

В методе по третьему аспекту изобретения выбирается клетка бацилл, удовлетворяющая условиям по пунктам (i) и (ii) первого аспекта.

Как понимает опытный человек, конкретные параметры анализа устойчивости к желчи и количества фитазы, детально описанные в настоящем документе (см., например, пример 1 в настоящем документе для анализа устойчивости к желчи и пример 2 для фитазного анализа), могут быть изменены для получения альтернативного метода скрининга, который позволит достичь описанной в настоящем документе цели, то есть получить клетку бацилл, способную к выполнению условий по пунктам (i) и (ii) первого аспекта.

В предпочтительном способе осуществления изобретения анализ устойчивости к желчи в примере 1 использован в шаге (а) метода скрининга третьего аспекта и фитазный анализ примера 2 использован на стадии (с) метода скрининга по третьему аспекту.

На этапе (d) метода скрининга по третьему аспекту изобретения выделяется вегетативная клетка бацилл. Эта вегетативная клетка бациллы может быть использована для получения из нее спор бацилл.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения за методом скрининга по третьему аспекту следует дополнительный этап (e), на котором выделенная вегетативная клетка бацилл, выделенная на этапе (d), подвергается ферментации для получения 10⁵-10¹² вегетативных клеток бацилл, и эти 10⁵-10¹² вегетативных клеток бацилл используются для получения 10⁵-10¹² спор бацилл, которые выделяются для получения композиции бацилл, которая содержит 10⁵-10¹² КОЕ/г спор бацилл.

Конечный результат стадии (e) - это новая композиция бацилл, которая содержит 10⁵-10¹² КОЕ/г спор бацилл и в которой клетки бацилл удовлетворяют условиям по пунктам (i) и (ii) первого аспекта изобретения.

Соответственно, отдельный аспект изобретения касается композиции бацилл, которая содержит 10⁵-10¹² КОЕ/г спор бацилл и в которой клетки бацилл, удовлетворяющие условиям по пунктам (i) и (ii) первого аспекта, получены методом скрининга по третьему аспекту, за которым следует дополнительный этап (f), описанный выше.

На этапе (b) метода скрининга по третьему аспекту сделан мутагенез ранее выбранных клеток бацилл, устойчивых к желчи, с целью отбора клеток с высоким уровнем продукции фитазы на стадии (с). Как понимает опытный человек, это может быть, например, классический мутаганез (например, обработкой химическими реактивами или УФ) или специфический генный обмен, в результате которого получается так называемый Генно-Модифицированный Организм (ГМО).

Например, как описано в настоящем документе, новый ГМО штамм DSM 19466 был получен из GalliPro^® и был первым сделан устойчивым к желчи, как описано в рабочих примерах в настоящем документе с получением штамма DSM 19467. На следующей стадии промотор фитазы из штамма DSM 19467 был заменен на другой промотор бацилл с получением высокопроизводительного по ферменту фитазе штамма, каким оказался DSM 19466.

Похожим образом, новый штамм с высоким уровнем производства фитазы, DSM 19489, был получен классическим мутагенезом из штамма DSM 19467. См., например, Фиг.1.

Зарегистрированные штаммы

Как сказано выше, четвертый аспект изобретения относится к клеткам бацилл, выбранным из группы, включающей:

(а) клетки Bacillus Subtilis, регистрационный номер DSM 19467,

(b) клетки Bacillus Subtilis, регистрационный номер DSM 19489, и

(c) клетки Bacillus Subtilis, регистрационный номер DSM 19466.

или соответствующего мутантного штамма, в котором мутантный штамм получен с использованием одного из зарегистрированных штаммов в качестве исходного материала и в котором мутантный штамм сохраняет основные свойства зарегистрированного штамма.

Четвертый аспект изобретения относится к описанному в настоящем документе новому штамму или «соответствующему мутантному» штамму.

Опытному человеку ясно, что с использованием зарегистрированного штамма в качестве исходного материала опытный читатель сможет путем обыкновенных процедур с помощью методов стандартного мутагенеза или ревыделения получить последующие мутанты или их производные, которые сохраняли бы описанные в настоящем документе целевые признаки и преимущества. Соответственно, термин «соответствующий мутант» по первому аспекту изобретения относится к мутантным штаммам, полученным с использованием зарегистрированных штаммов в качестве исходного материала.

Это может быть сформулировано иначе как метод получения штамма, включающий использование одного из описанных в настоящем документе зарегистрированных штаммов в качестве исходного штамма, с получением мутантов зарегистрированного штамма и выделением нового штамма, в котором мутант сохраняет основные свойства зарегистрированного штамма.

Пример нового штамма Bacillus Subtilis был зарегистрирован как DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) под инвентарным номером DSM 19467, дата регистрации 27 июня 2007. Регистрация была проведена по условиям Будапештского Договора о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Целей Патентной Процедуры.

Пример нового штамма Bacillus Subtilis был зарегистрирован как DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Maschroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig) под инвентарным номером DSM 19489, дата регистрации 27 июня 2007. Регистрация была проведена по условиям Будапештского Договора о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Целей Патентной Процедуры.

Пример нового штамма Bacillus Subtilis был зарегистрирован как DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) под инвентарным номером DSM 19466, дата регистрации 27 июня 2007. Регистрация была проведена по условиям Будапештского Договора о Международном Признании Депонирования Микроорганизмов для Целей Патентной Процедуры.

Примеры

Пример 1 Анализ устойчивости к желчи

Среда:

Использовалась стандартная коммерчески доступная неселективная среда инфузионный телячий бульон (VIB) (Difco, 234420).

На дату регистрации заявки настоящего изобретения в каталог продукции («Difco^TM/BBL^TM Manual) от поставщика BD Diagnostic Systems (www.bd.com) прочитано о среде VIB:

«Инфузия из постной телятины и пептона обеспечивает азот, витамины, углерод и аминокислоты в инфузионном телячьем бульоне. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс состава», и

среда была приготовлена в соответствии с инструкциями производителя путем суспендирования 25 г VIB порошка в 1 л очищенной воды (получен 2,5% раствор) и нагревания с частым встряхиванием и кипячения в течение 1 минуты до полного растворения порошка. 2,5% VIB раствор имел состав (на литр):

Постная телятина, инфузия 10 г

Протеоза пептон 10 г

Хлорид натрия 5 г

Среда была перелита в стерильные бутыли и проавтоклавирована в течение 15 минут при 121°C.

Раствор соли желчных кислот/в среде:

Смеси солей желчных кислот были приготовлены по аналогии с физиологическим составом и концентрацией солей желчных кислот в свиной желчи, соли желчных кислот были растворены в бульоне VIB, приготовленном выше, до итоговой концентрации солей желчных кислот в растворе 8 мМ.

Конъюгированные соли желчных кислот представляли собой смесь:

Тауродеоксихолат (Sighma T-0875, США), гликодеоксихолат (Sighma T-99910, США) и деконъюгированные деоксихолат соли желчных кислот (Sighma T-5670, США) и конечный 8 мМ раствор смеси солей желчных кислот содержал 60% тауродеоксихолата, 30% гликодеоксихолата и 10% деоксихолата. Перед автоклавированием в течение 15 минут при 121°C рН растворов был доведен до 7,4 хлоридом натрия. Приготовленная среда с 8 мМ солью желчных кислот была разбавлена до получения концентрации соли 0, 1, 2, 4, 6 и 8 мМ.

Смеси желчных кислот были добавлены в среду VIB в концентрированном виде. Соответственно, конечные количества инфузии постной телятины, протеозы пептона и хлорида натрия соответствовали 2,5% раствору среды VIB перед тем, как были добавлены соли желчных кислот.

Суспензия спор

Для того чтобы отличать вегетативные клетки от спор и убедиться в чистоте продукции спор для инокуляции, количество спор в продукте бацилл было определено с использованием тепловой обработки при 80°С 10 мин. После тепловой обработки и последующего охлаждения до комнатной температуры была проведена серия 10-кратных разбавлений в водном растворе пептона и хлорида натрия. Пары чашек с Триптозным кровяным агаром (Difco 0232-01) были инокулированы 0,1 мл из соответствующих десятичных разведений. Планшеты инкубировались при 37°C до следующего дня. Основываясь на предварительном определении расчета спор в продукте, была приготовлена суспензия спор в стерильной дистиллированной воде с конечной вычисленной концентрацией спор 10⁸ КОЕ/г. Подсчеты вегетативных клеток и спор в конечной инокуле были проведены с использованием метода, описанного выше. Конечная концентрация спор 10⁸ КОЕ/г соответствовала начальной OD₆₃₀ 0,2-0,3.

Измерения роста: измерения оптической плотности

Был использован Стерильный плоскодонный 96-луночный титрационный микропланшет (Greiner Bio-one Gmbh, Germnany). Каждая лунка была заполнена 0,150 мл VIB, инокулированной спорами (~1×10⁸ спор на мл эквивалентны соответствуют начальному значению OD₆₃₀ ~0,2-0,3), планшеты инкубировались в течение 20 часов при 37°С с 1-минутным циклом перемешивания с интенсивностью 4 (высокой) перед каждым считыванием.

Чтобы предотвратить конденсацию на внутренней поверхности крышки планшета, крышки были промыты разбавленным раствором Triton X100.

Кинетика развития и прорастания штаммов бацилл была измерена с использованием спектрофотометра при длине волны 630 нм (OD₆₃₀) (Bio-tek Instruments, Inc. VE).

Считывания результатов проводились с 10-минутными интервалами и анализировались с использованием программы KC4^TM (Bio-tek Instruments, Inc. VE). Через 20 часов (регистрации результатов) данные были экспортированы в Excel^® для дальнейшей обработки, импортированы в SAS версия 9.0 и статистически обработаны.

Пример 2 Анализ фитазной активности

Использованный в этом исследовании метод измерения и количественной оценки единиц фермента фитазы, произведенных клетками бацилл, был адаптирован из Walsh et al. 2004 Biochemistry&Molecular Cell Biology Education, vol.32, № 5 (336-340). По существу, единственное значительное упрощение было сделано с целью стандартизации метода для целей кинетики роста - измерение фитазной активности относительно числа живых клеток бацилл проводилось с использованием спектрофотометра путем измерения оптической плотности (OD) при длине волны 600 с разведением при необходимости клеток водой 1:4. Использование этого метода дает ограниченные стандартные отклонения.

Рост клеток бацилл

Клетки бацилл инокулировались и выращивались в богатой среде для роста бацилл при 37°С, и рост штаммов бацилл и фитазная активность измерялись через временные отрезки до 24 часов.

Споры бацилл выращиваются в среде, основанной на инфузонном сердечном бульоне (HIB) со следующим составом:

HIB (Bacto 238400) 25 г/л 0,5% Bacto дрожжевой экстракт (Difco 212750) 5 г/л 2 мМ CaCl₂ (Merck 1.02382) 0,294 г/л

Состав был проавтоклавирован в течение 15 мин при 121°С, и к нему были добавлены отфильтрованные стерильные 1% манноза и 1% глюкоза.

HIB - это хорошо известная коммерчески доступная неселективная среда. На дату регистрации заявки настоящего изобретения каталог продукции от поставщика BD Diagnostic Systems (www.bd.com) описывал состав/формулу Bacto^TM Heart Infusion Broth на 1 литр как:

Говяжье сердце, инфузия из 500 г 10,0 г 0 Триптоза 10,0 г Хлорид натрия 5,0 г

Дополненная среда HIB - среда с низким содержанием фосфата, вследствие чего она подходит для фитазного анализа. 1% инокулят ночной культуры используется в свежей среде HIB и инкубируется при 37°С до измерения активности (например, после 4, 6, 8 и 24 часов).

Инкубация в среде была сделана либо в пробирке Nunc с голубой крышкой объемом 50 мл или в меньших количествах (0,150 мл) в 96-луночном ELISA планшете с хорошей аэрацией.

Фитазный анализ

Фитазный анализ проводится на клеточных супернатантах, поскольку фермент выделяется в среду. Титрационный микропланшет центрифугируется на скорости 3600 оборотах в минуту в течение 15 минут. Большие объемы центрифугирются при 2400-3600 оборотов в минуту в течение 15 минут на центрифуге Eppendorf. Перед фитазным анализом клетки осторожно отделялись от супернатанта.

Растворы:

0,1М ТРИС/малат pH 7,0

Раствор А: 0,1М ТРИС/малат pH 7,0

(l-оксиянтарная кислота, Sigma M1000) pH 7,0+0,1 об.% натриевая соль фитиновой кислоты из кукурузы (Sigma P8810)+CaCl₂ (свежеприготовленный перед анализом раствор)=субстрат

Раствор В: 8 г молибдата аммония (Sigma A7302)+50 мл H₂O+27 мл 10М H₂SO₄₊H₂O до 100 мл

Раствор С: 5 г FeSO₄ (Sigma F 7002)+90 мл H₂O (размешивать до полного растворения)+10 мл раствора В (свежеприготовленного)

0,5 С ТХУ (Merck 1.008070.1000) 8 об.%

1 мМ KH₂PO₄

Анализ проводился в 96-луночном титрационном микропланшете, содержавшем 0,020 мл супернатанта бацилл, в который были добавлены 0,080 мл буферного раствора 0,1М Трис/оксиянтарной кислоты, содержавшей 0,1% фитиновой кислоты, и 2мМ CaCl₂ (раствор А). Планшет инкубировался при 50°С в течение 30 мин (планшет был закрыт для предотвращения испарения).

Цветная реакция:

Добавление 0,100 мл 0,5М Трихлороуксусной кислоты ТХУ

Добавление 0,100 мл Fe++ раствора (раствор С)

Оставить на 5 мин при комнатной температуре. Появится синее окрашивание.

Измерить значение поглощения при 600 нм.

В анализе измеряется общий свободный фосфат в супернатанте. С целью определить фоновое количество свободного фосфата фитатный анализ может быть также проведен в отсутствие субстрата фермента фитазы (фитиновой кислоты). Это означает, что раствор А в анализе (см. выше) замещается буфером Трис/малат с рН 7,0.

Расчет фитазной активности

Поглощение, измеренное в анализе, будет соответствовать общему количеству свободного фосфата в среде и фосфату, высвобожденному в результате фитазной активности, и поэтому количество свободного фосфата в среде необходимо вычесть из общего количества. Чтобы сделать это, образец измеряется в буфере с и без фитиновой кислоты, и чтобы получить чистое значение фитазной активности, результаты вычитаются. С поправкой на поглощение самих клеток (OD₆₀₀) фитазная активность культуры бацилл выражается как активность (единицы поглощения), вычисленная следующим образом:

Пример 3 Выбор устойчивого к желчи штамма Bacillus Subtilis DSM 19467

Исходными клетками были клетки Bacillus Subtilis GalliPro^®.

Был осуществлен мутагенез GalliPro^® для получения пула новых индивидуальных клеток бацилл. Были получены споры и отобраны те, которые имели большую скорость развития и прорастания из спор в вегетативные клетки в присутствии среды с солью желчных кислот, содержавшей 4 и 6 мМ соль желчных кислот, как описано в примере 1 выше.

Были выбраны клетки Bacillus Subtilis DSM 19467.

Таблица 1 ниже демонстрирует данные о развитии и прорастании. Время (ч) от 10⁸ КОЕ/г соответствуют OD 0,2-0,3 до достижения OD 0,4 (среднее трех измерений)

Bacillus Subtilis 4 мМ желчь 6 мМ желчь Существующий продукт GalliPro^® (DSM 17321) ›20 ›20 Устойчивый к желчи и суперэкспрессирующий фитазу штамм (DSM 19489) 13 ч 40 мин 15 ч Коммерческий продукт: Calsporin ›20 ›20

Выбор устойчивого к желчи и суперэкспрессирующего фитазу штамма DSM 19489 описан в примере 4 ниже. DSM 19467 имел развитие и прорастание примерно столь же быстрые, как DSM 19468.

Вывод

DSM 19489 и DSM 19467 являются устойчивыми к желчи штаммами со скоростью развития и прорастания, очевидно, большей, чем GalliPro^®.

Пример 4

Выбор бацилл с высоким уровнем продукции фитазы DSM 19489 (классические) и DSM 19466 (ГМО)

Исходным штаммом бацилл был Bacillus Subtilis DSM 19467, выбранный в примере 3.

DSM 19467 был получен классическим мутагенезом с получением пула индивидуальных вегетативных клеток бацилл. Вегетативные клетки были отобраны по критерию высокого уровня продукции фитазы с использованием фитазного анализа, описанного в примере 2 выше.

Были выбраны клетки Bacillus Subtilis DSM 19489 с высоким уровнем фитазы.

Промотор фитазы в штамме DSM 19467 был заменен другим промотором бацилл, который повышал уровень продукции фермента фитазы, так был получен штамм DSM 19466 (ГМО)

Результаты измерения фитазной активности

Штаммы

DSM 19489 Клетки Bacillus Subtilis, устойчивые к желчи и с высоким уровнем продукции фитазы.

DSM 19467 Клетки Bacillus Subtilis, устойчивый к желчи материнский штамм для DSM 19489.

DSM 19466 Клетки Bacillus Subtilis, устойчивые к желчи и с модификациями в гене, кодирующем фитазу (с высоким уровнем продукции фитазы).

Таблица 2
Результаты количества фитазы, производимой выбранными штаммами, были измерены, как описано в примере 2 выше Время (ч) 4 6 8 24 DSM 19489 2,68 0,83 1,06 0,44 DSM 19467 1,10 0,57 0,68 0,59 DSM 19466 2,30 1,07 1,37 0,44

Штамм DSM 19489 производил 2,68 единиц фитазы по сравнению с 1,10 единиц для штамма DSM 19467 (который является контрольным устойчивым к желчи материнским штаммом). Близкого к DSM 19489 уровня продукции фитазы достиг и генетически модифицированный штамм DSM 19466, устойчивый к желчи (2,30), и таким образом он тоже является штаммом с высокой продукцией фитазы.

Вывод

Штамм DSM 19489 - устойчивый к желчи и с высоким уровнем продукции фитазы, штамм бацилл в этом примере производит в два раза больше фитазы по сравнению с DSM 19467 после 4 часов выращивания в питательной среде.

Устойчивый к желчи штамм DSM 19466 (ГМО), в котором ген фитазы генетически модифицирован для получения штамма с высоким уровнем продукции фитазы, подобно DSM 19489, по измерениям через 4 часа выращивания в питательной среде, он производит в два раза больше фитазы, чем материнский штамм (DSM 19467).

DSM 19467 происходит от штамма GalliPro^®, и при его выборе не учитывался уровень продукции фитазы. Соответственно, считается, что уровень продукции фитазы GalliPro^® примерно аналогичен уровню продукции фитазы DSM 19467.

Пример 5. Проверка устойчивости к желчи штамма бацилл с высоким уровнем продукции фитазы DSM 19489 (классические) и DSM 19466 (ГМО)

Штаммы бацилл с высоким уровнем продукции фитазы DSM 19489 (классический) и DSM 19466 (ГМО), выбранные в примере 4, были перепроверены по их способности к быстрым развитию и прорастанию из спор в вегетативные клетки, как описано в примере 1.

Результаты показали, что оба штамма 19489 и DSM 19466, как и исходные клетки DSM 19467, использованные для их получения, сохраняли примерно одинаково хорошие быстрые развитие и прорастание.

Список литературы

1. Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 Jul 4.

2. US2003/0124104A.

3. US6255098.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены штамм Bacillus subtilis DSM 19467, штамм Bacillus subtilis DSM 19489, штамм Bacillus subtilis DSM 19466, продуцирующие высокие уровни фитазы. На основе любого из указанных штаммов в сочетании с другими подходящими добавками получают композицию для кормления животных. Предложен также способ кормления животных, включающий введение композиции животным в сочетании с другими кормовыми ингредиентами. Изобретение обеспечивает пробиотический эффект и увеличивает усвоение и пользу нутриентов в кормах для животных. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Штамм Bacillus subtilis с высоким уровнем продуцирования фитазы, зарегистрированный в DSMZ (Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) под инвентарным номером DSM 19467.

2. Штамм Bacillus subtilis с высоким уровнем продуцирования фитазы, зарегистрированный в DSMZ (Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) под инвентарным номером DSM 19489.

3. Штамм Bacillus subtilis с высоким уровнем продуцирования фитазы, зарегистрированный в DSMZ (Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) под инвентарным номером DSM 19466.

4. Композиция для кормления животных, содержащая штамм по любому из пп.1-3 в сочетании с другими подходящими добавками.

5. Композиция по п.4, включающая другие соответствующие целевые микроорганизмы.

6. Композиция по п.5, где указанные другие соответствующие целевые микроорганизмы представляют собой целевые молочнокислые бактерии.

7. Способ кормления животных, включающий введение композиции по любому из пп.4-6 животным в сочетании с другими кормовыми ингредиентами.

8. Способ кормления животных по п.7, в котором животное выбрано из группы, включающей домашнюю птицу, свиней, жвачных животных, телят, кроликов, лошадей, рыбу и домашних животных.