СКОНСТРУИРОВАННЫЕ УСТОЙЧИВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ИЗ КЛАДЫ ФИТАЗ С ВЫСОКОЙ Tm И ИХ ФРАГМЕНТЫ Российский патент 2025 года по МПК A23K20/189 C12N9/16 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/769713, поданной 20 ноября 2018 года, предварительной заявке на патент США № 62/851122, поданной 22 мая 2019 года, и предварительной заявке на патент США № 62/887714, поданной 16 августа 2019 года, раскрытия каждой из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Перечень последовательностей, представленный в файле под названием "20191115_NB41175-WO-PCT_Sequence Listing_ST25" размером 324 Кб, созданном 15 ноября 2019 года, и подаваемый вместе с данным документом, включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данная область относится к сконструированным устойчивым полипептидам из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментам, способам получения таких сконструированных устойчивых полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов и их применению для улучшения продуктивности животных.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фитаза представляет собой наиболее часто применяемый экзогенный фермент в кормах для моногастричных животных. Фитаза может снижать антипитательный эффект фитата и улучшать усвояемость фосфора, кальция, аминокислот и энергии, а также уменьшать отрицательное влияние выведения неорганического фосфора в окружающую среду.

Фитат представляет собой основную запасную форму фосфора у злаковых и бобовых растений. Однако моногастричные животные, такие как свинья, птица и рыба, не могут эффективно метаболизировать или всасывать фитат (или фитиновую кислоту) в своем рационе, и поэтому он выводится из организма, что приводит к загрязнению фосфором в районах интенсивного животноводства. Более того, фитиновая кислота также действует как антипитательное средство у моногастричных животных, хелатируя металлические агенты, такие как кальций, медь и цинк, и образуя нерастворимые комплексы с белками и аминокислотами в различных сегментах пищеварительного тракта.

Долгое время считалось, что нежвачные животные не имеют эндогенной фитазы и, таким образом, неспособны утилизировать фитат. Однако было описано, что эндогенные фосфатазы слизистых оболочек и бактериальные фитазы обладают активностью в тонкой кишке и слепой кишке домашней птицы. Maenz, D. D.; Classen, H. L., Phytase activity in the small intestinal brush border membrane of the chicken. Poult Sci 1998, 77, 557-63. Abudabos, A. M., Phytate phosphorus utilization and intestinal phytase activity in laying hens. Italian Journal of Animal Science 2012, 11, e8. Zeller, E.; Schollenberger, M.; Kuhn, I.; Rodehutscord, M. Для обеспечения достаточного количества фосфатов для роста и здоровья этих животных в их рацион добавляют неорганический фосфат. Такое добавление может быть дорогостоящим и еще больше усугубляет проблемы загрязнения.

Под действием фитазы фитат обычно гидролизуется с образованием низших инозитолфосфатов и неорганического фосфата. Фитазы применимы в качестве добавок к кормам для животных, где они улучшают доступность органического фосфора для животных и уменьшают загрязнение окружающей среды фосфатами (Wodzinski RJ, Ullah A.H. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).

Ряд фитаз грибного (Wyss M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R. M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)) и бактериального (Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H. W. et al., Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S. J. et al., Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N. V. et al., FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004)) происхождения был описан в литературе.

Патент США № 8053221, выданный Miasnikov и соавт. 8 ноября 2011 года, относится к фитазам, полученным из бактерии Buttiauxella sp., и их вариантным/модифицированным формам, выбранным и/или сконструированным с улучшенными характеристиками по сравнению с ферментом дикого типа (исходным).

Патенты США №№ 6110719, выданный Short 29 августа 2000 года, и 6183740, выданный Short и соавт. 6 февраля 2001 года, относятся к ферментам фитазам, полученным из Escherichia coli B.

Патент США № 9365840, выданный Sjoeholm и соавт. 4 июня 2016 года, относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью.

Патенты США №№ 8206962, выданный Lassen и соавт. 26 июня 2011 года, и 8507240, выданный Lassen и соавт. 13 августа 2013 года, относятся к вариантам фитазы Hafnia.

Патент США № 8557552, выданный Haefner и соавт. 15 октября 2013 года, относится к синтетическим вариантам фитазы.

WO2015/012890, имеющая дату международной публикации 29 января 2015 года, относится к полипептидам, обладающим фитазной активностью.

За последнее десятилетие были разработаны новые поколения фитаз. Однако ни одна из этих фитаз не обладает подходящей устойчивостью при внесении в корм в жидкой форме перед кондиционированием и брикетированием, чтобы выдерживать высокие уровни стресса в коммерчески значимых условиях брикетирования кормов. Таким образом, представленные на рынке термостабильные фитазные продукты, подходящие для коммерческого брикетирования, представляют собой сухие продукты, и многие из них имеют защитные покрытия для сохранения активности. Однако желательно внесение в корм фитаз в жидкой форме, поскольку, например, фитаза, добавляемая в жидкой форме, будет равномерно распределяться и немедленно высвобождаться в организме животного при доставке с кормом. Сохраняется потребность в таких фитазах и их фрагментах, которые являются устойчивыми при внесении в жидкой форме перед кондиционированием и брикетированием в коммерчески значимых условиях и сохраняют способность улучшать продуктивность животных.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза (такой как биосинтетическая бактериальная 6-фитаза) или его фрагмент, обладающий фитазной активностью, характеризующийся по меньшей мере 82% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1.

Во втором варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно варианту осуществления 1, где аминокислотная последовательность сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента имеет балл согласно скрытой марковской модели (HMM), составляющий по меньшей мере 1200, как представлено в таблице 11 для полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов.

В третьем варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, характеризующийся по меньшей мере 78% идентичностью последовательности с аминокислотами в положениях 14-325, соответствующих аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1.

В четвертом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент (как, например, согласно вариантам осуществления 1, 2 или 3), характеризующийся выходом в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере приблизительно 50% при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста выхода в корме при брикетировании, описанного в примере 5.

В пятом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент (как, например, согласно вариантам осуществления 1, 2, 3 или 4), характеризующийся соотношением показателей выхода в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере приблизительно 0,7 при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста в корме при брикетировании, описанного в примере 5.

В шестом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4 или 5, где указанный полипептид или его фрагмент характеризуется температурой Tm, составляющей по меньшей мере приблизительно 92,5°C, при использовании условий анализа методом дифференциальной сканирующей калориметрии, описанных в примере 3.

В седьмом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно варианту осуществления 6, где указанный полипептид или его фрагмент обладает удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 100 ед/мг при pH 3,5, в условиях анализа, описанных в примере 3.

В восьмом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, где а) указанный полипептид фитаза содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID:NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, и SEQ ID NO:64; или b) указанный полипептид фитаза содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, и SEQ ID NO:87.

В девятом варианте осуществления раскрыты корм для животных, кормовой продукт, композиция на основе кормовых добавок или премикс, содержащие сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, где сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент можно применять (i) в отдельности, или (ii) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, или (iii) с по меньшей мере одним другим ферментом, или (iv) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, и по меньшей мере одним другим ферментом, или (v) согласно любому из (i), (ii), (iii) или (iv) с дополнительным включением по меньшей мере одного другого компонента, представляющего собой кормовую добавку, и при этом сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент необязательно присутствует в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 0,1 г/тонна корма.

В десятом варианте осуществления раскрыта рекомбинантная конструкция, содержащая регуляторную последовательность, функциональную в организме хозяина-продуцента, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.

В одиннадцатом варианте осуществления хозяин-продуцент выбран из группы, состоящей из бактерий, грибов, дрожжей, растений и водорослей.

В двенадцатом варианте осуществления раскрыт способ получения сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента, включающий:

(a) трансформацию хозяина-продуцента рекомбинантной конструкцией согласно варианту осуществления 9 и

(b) культивирование хозяина-продуцента из стадии (а) в условиях, при которых продуцируется сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент.

В тринадцатом варианте осуществления сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент, полученный с помощью способа согласно десятому варианту осуществления, необязательно извлекают из хозяина-продуцента.

В четырнадцатом варианте осуществления раскрыта надосадочная жидкость культуры, содержащая фитазу, полученная с помощью способов согласно десятому или одиннадцатому вариантам осуществления.

В пятнадцатом варианте осуществления раскрыта полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.

В шестнадцатом варианте осуществления описана высушенная ферментная композиция для применения в корме для животных, содержащая сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.

В семнадцатом варианте осуществления раскрыта высушенная ферментная композиция согласно варианту осуществления 15, где высушенная ферментная композиция представляет собой гранулированную композицию на основе кормовых добавок.

В восемнадцатом варианте осуществления раскрыта жидкая ферментная композиция для применения в корме для животных, содержащая сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.

В девятнадцатом варианте осуществления раскрыт способ улучшения питательной ценности корма для животных, где сконструированную фитазу или ее фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 добавляют в корм для животных.

В двадцатом варианте осуществления раскрыт способ улучшения продуктивности животного по одному или более показателям, включающий введение животному эффективного количества сконструированного полипептида фитазы согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или корма для животных, кормового продукта, композиции на основе кормовых добавок или премикса согласно вариантам осуществления 9 или 10.

В двадцать первом варианте осуществления раскрыт способ согласно варианту осуществления 20, где один или более показателей выбраны из группы, состоящей из увеличенной эффективности использования корма, увеличенного прироста веса, сниженного коэффициента конверсии корма, улучшенной усвояемости питательных веществ или энергии в корме, улучшенного удержания азота, улучшенной способности избегать отрицательных эффектов некротического энтерита и улучшенного иммунного ответа.

В двадцать втором варианте осуществления раскрыт способ согласно вариантам осуществления 20 или 21, где животное представляет собой моногастричное животное, выбранное из группы, состоящей из домашней свиньи и домашней птицы.

В двадцать третьем варианте осуществления раскрыт способ согласно варианту осуществления 22, где домашняя свинья выбрана из группы, состоящей из поросят, растущих свиней и свиноматок.

В двадцать четвертом варианте осуществления раскрыт способ согласно варианту осуществления 22, где домашняя птица выбрана из группы, состоящей из индеек, уток, кур, цыплят-бройлеров, несушек, гусей, фазанов, перепелов и эму.

В двадцать пятом варианте осуществления раскрыт способ согласно вариантам осуществления 20 или 21, где животное представляет собой жвачное животное, выбранное из группы, состоящей из крупного рогатого скота, молодых телят, коз, овец, жирафов, бизона, лося, вапити, яков, индийского буйвола, оленя, северного оленя, карибу, верблюдов, альпак, лам, антилопы, вилорога и нильгау.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

На фигурах 1A-1BB (панели от A до 1BB) показаны баллы вероятности согласно HMM для каждого положения вдоль полипептидной последовательности в кладе фитаз с высокой Tm. Совокупные баллы (COMP) для HMM показаны жирным шрифтом на верхних 3 панелях фигуры 1A. Положение (P) и консенсусный остаток (C) для каждой аминокислоты показаны в столбце 1 под P/C.

На фигуре 2 изображено филогенетическое дерево, показывающее родство между различными фитазами, включая сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты, описанные в данном документе, на основании сходств и различий в аминокислотной последовательности.

На фигуре 3 изображена трехмерная структура иллюстративной фитазы из клады фитаз с высокой Tm, смоделированная с использованием кристаллической структуры, опубликованной для близкородственной 6-фитазы Hafnia alvei, и показанная в виде ленточной диаграммы.

Следующие последовательности соответствуют §§ 1.821-1.825 раздела 37 CFR ("Требования для патентных заявок, содержащих раскрытия нуклеотидных последовательностей и/или аминокислотных последовательностей - Правила для последовательностей") и согласуются со Стандартом ST.25 (2009) Всемирной организации интеллектуальной собственности (WIPO) и требованиями для перечня последовательностей Европейской патентной конвенции (EPC), а также Правилами 5.2 и 49.5 (a-bis) Договора о патентной кооперации (РСТ) и разделом 208 и приложением С Административной инструкции. Символы и формат, используемые для данных о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, соответствуют правилам, изложенным в § 1.822 раздела 37 CFR.

SEQ ID NO: 1 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13594.

SEQ ID NO: 2 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-10931.

SEQ ID NO: 3 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-10957.

SEQ ID NO: 4 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-11569.

SEQ ID NO: 5 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-11658.

SEQ ID NO: 6 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-11673.

SEQ ID NO: 7 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-11680.

SEQ ID NO: 8 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-11895.

SEQ ID NO: 9 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-11932.

SEQ ID NO: 10 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-12058.

SEQ ID NO: 11 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-12663.

SEQ ID NO: 12 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-12784.

SEQ ID NO: 13 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13177.

SEQ ID NO: 14 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13371.

SEQ ID NO: 15 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13460.

SEQ ID NO: 16 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13513.

SEQ ID NO: 17 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13637.

SEQ ID NO: 18 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13705.

SEQ ID NO: 19 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13713.

SEQ ID NO: 20 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13747.

SEQ ID NO: 21 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13779.

SEQ ID NO: 22 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13789.

SEQ ID NO: 23 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13798.

SEQ ID NO: 24 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13868.

SEQ ID NO: 25 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13883.

SEQ ID NO: 26 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13885.

SEQ ID NO: 27 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-13936.

SEQ ID NO: 28 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14004.

SEQ ID NO: 29 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14215.

SEQ ID NO: 30 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14256.

SEQ ID NO: 31 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14277.

SEQ ID NO: 32 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14473.

SEQ ID NO: 33 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14614.

SEQ ID NO: 34 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14804.

SEQ ID NO: 35 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-14945.

SEQ ID NO: 36 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-15459.

SEQ ID NO: 37 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-16513.

SEQ ID NO: 38 соответствует WP 064555343.1 Buttiauxella noackiae.

SEQ ID NO: 39 соответствует AAS45884.1 Citrobacter braakii.

SEQ ID NO: 40 соответствует RDH40465.1 бактерий из семейства Coxiellaceae.

SEQ ID NO: 41 соответствует WP 094337278.1 Enterobacteriaceae.

SEQ ID NO: 42 соответствует WP 001297112 Escherichia coli.

SEQ ID NO: 43 соответствует WP 072307456.1 Hafnia alvei.

SEQ ID NO: 44 соответствует WP 084912871.1 Rouxiella badensis.

SEQ ID NO: 45 соответствует WP 009636981.1 Serratia sp.

SEQ ID NO: 46 соответствует WP 004701026.1 Yersinia aldovae.

SEQ ID NO: 47 соответствует WP 050140790.1 Yersinia frederiksenii.

SEQ ID NO: 48 соответствует WP 004392102.1 Yersinia kristensenii.

SEQ ID NO: 49 соответствует WP 049646723.1 Yersinia mollaretii.

SEQ ID NO: 50 соответствует WP 050539947.1 Yersinia rohdei.

SEQ ID NO: 51 соответствует SEQ ID NO: 3 в EP322271.

SEQ ID NO: 52 соответствует SEQ ID NO: 2 в US8101391.

SEQ ID NO: 53 соответствует SEQ ID NO: 4 в US8101391.

SEQ ID NO: 54 соответствует SEQ ID NO: 35 в US8101391.

SEQ ID NO: 55 соответствует SEQ ID NO: 49 в US8101391.

SEQ ID NO: 56 соответствует SEQ ID NO: 1 в US8143046.

SEQ ID NO: 57 соответствует SEQ ID NO: 3 в US8143046.

SEQ ID NO: 58 соответствует SEQ ID NO: 2 в US8460656.

SEQ ID NO: 59 соответствует SEQ ID NO: 13 в US8557555.

SEQ ID NO: 60 соответствует SEQ ID NO: 24 в US8557555.

SEQ ID NO: 61 соответствует SEQ ID NO: 3 в US20160083700.

SEQ ID NO: 62 соответствует SEQ ID NO: 1 в WO2010034835-0002.

SEQ ID NO: 63 соответствует сигнальной последовательности аспартатпротеазы T. reesei.

SEQ ID NO: 64 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-16812.

SEQ ID NO: 65 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17403.

SEQ ID NO: 66 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17336.

SEQ ID NO: 67 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17225.

SEQ ID NO: 68 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17186.

SEQ ID NO: 69 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17195.

SEQ ID NO: 70 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17124.

SEQ ID NO: 71 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17189.

SEQ ID NO: 72 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17218.

SEQ ID NO: 73 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17219.

SEQ ID NO: 74 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17204.

SEQ ID NO: 75 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17215.

SEQ ID NO: 76 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17201.

SEQ ID NO: 77 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17205.

SEQ ID NO: 78 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17224.

SEQ ID NO: 79 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17200.

SEQ ID NO: 80 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17198.

SEQ ID NO: 81 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17199.

SEQ ID NO: 82 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17214.

SEQ ID NO: 83 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17197.

SEQ ID NO: 84 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17228.

SEQ ID NO: 85 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17229.

SEQ ID NO: 86 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17152.

SEQ ID NO: 87 соответствует предсказанной зрелой последовательности сконструированной фитазы PHY-17206.

SEQ ID NO: 88 соответствует N-концу NCIMB 41248 Buttiauxella.

SEQ ID NO: 89 соответствует N-концу AAS45884 C. braakii.

SEQ ID NO: 90 соответствует N-концу YP007628727 E. tarda.

SEQ ID NO: 91 соответствует N-концу PHY-13594.

SEQ ID NO: 92 соответствует N-концу PHY-13789.

SEQ ID NO: 93 соответствует N-концу PHY-13885.

SEQ ID NO: 94 соответствует С-концу SEQ ID NO: 1 в WO2010034835-0002.

SEQ ID NO: 95 соответствует С-концу WP032813045 Y. mollaretii.

SEQ ID NO: 96 соответствует С-концу NCIMB 41248 Buttiauxella.

SEQ ID NO: 97 соответствует С-концу PHY-13594.

SEQ ID NO: 98 соответствует С-концу PHY-13789.

SEQ ID NO: 99 соответствует С-концу PHY-13885.

SEQ ID NO: 100 соответствует сердцевинной области PHY-13594.

SEQ ID NO: 101 соответствует сердцевинной области PHY-13789.

SEQ ID NO: 102 соответствует сердцевинной области PHY-13885.

SEQ ID NO: 103 соответствует сердцевинной области PHY-16812.

SEQ ID NO: 104 соответствует SEQ ID NO: 4 в US7081563.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все цитируемые патенты, заявки на патенты и публикации включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В данном раскрытии используется ряд терминов и сокращений. Если специально не указано иное, то применяются следующие определения.

Используемые в данном документе формы единственного числа включают ссылку на формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное. Например, термин "соединение" или "по меньшей мере одно соединение" может включать множество соединений, в том числе их смеси. Формы единственного числа, термины "один или более" и "по меньшей мере один", например, можно использовать в данном документе взаимозаменяемо.

Термины "и/или" и "или" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к конкретному раскрытию каждого из двух определенных признаков или компонентов с другим или без другого. Таким образом, термин "и/или", используемый в такой фразе, как "A и/или B", в данном документе, предполагает включение в себя "A и B"; "A или B"; "A" (в отдельности) и "B" в отдельности. Аналогичным образом, термин "и/или", используемый в такой фразе, как "A, B и/или C", предполагает охват каждого из следующих аспектов: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (в отдельности); В (в отдельности) и С (в отдельности).

Слова, используемые в единственном числе, включают множественное число, и наоборот.

Термины "содержит", "содержащий", "включает", "включающий", "имеющий" и близкие к ним по значению используются взаимозаменяемо и означают "включающий без ограничения". Следует понимать, что, какие бы аспекты ни описывались в данном документе формулировкой "содержащий", также предусмотрены в остальном аналогичные аспекты, описываемые терминами "состоящий из" и/или "состоящий по сути из".

Термин "состоящий из" означает "включающий следующее и ограничивающийся им".

Термин "состоящий по сути из" означает указанный материал в композиции или определенные стадии способов, а также те дополнительные материалы или стадии, которые существенно не влияют на основные характеристики материала или способа.

Во всей настоящей заявке различные варианты осуществления могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона дается лишь для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема вариантов осуществления, описанных в данном документе. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, должно рассматриваться как конкретно раскрываемые поддиапазоны, такие как от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4 и от 1 до 5, от 2 до 3, от 2 до 4, от 2 до 5, от 2 до 6, от 3 до 4, от 3 до 5, от 3 до 6 и т. д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Термин "приблизительно", используемый в данном документе, может допускать степень изменчивости значения или диапазона, например, в пределах 10%, в пределах 5% или в пределах 1% от установленного значения или установленного предела диапазона.

Термин "фитаза" (мио-инозитолгексакисфосфатфосфогидролаза) относится к классу ферментов фосфатаз, которые катализируют гидролиз фитиновой кислоты (мио-инозитолгексакисфосфата или IP6) - неусваиваемой органической формы фосфора, которая обнаруживается в зернах и семенах масличных культур - и приводит к высвобождению пригодной для использования формы неорганического фосфора.

Термины "животное" и "субъект" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к любому организму, принадлежащему к царству Животные, который включает без ограничения млекопитающих (за исключением людей), животных, отличных от человека, домашних животных, домашний скот, сельскохозяйственных животных, животных зоопарка, племенной скот и т. п. Например, могут быть упомянуты все нежвачные и жвачные животные. В одном варианте осуществления животное представляет собой нежвачное животное, т. е. моногастричное животное. Примеры моногастричных животных включают без ограничения свиней и домашних свиней, таких как поросята, растущие свиньи, свиноматки; домашнюю птицу, такую как индейки, утки, куры, цыплята-бройлеры, несушки; рыбу, такую как лосось, форель, тиляпия, сомы и карпы; и ракообразных, таких как мелкие креветки и крупные креветки. В еще одном варианте осуществления животное представляет собой жвачное животное, в том числе без ограничения крупный рогатый скот, молодых телят, коз, овец, жирафов, бизона, лося, вапити, яков, индийского буйвола, оленя, верблюдов, альпак, лам, антилопу, вилорога и нильгау.

Термин "клада", также известный как монофилетическая группа, относится к группе организмов или родственных последовательностей, содержащей общего предка и всех его прямых потомков.

Термин "T_m" означает температуру, при которой белок денатурирует или свободная энергия развернутого и свернутого состояний равна, и половина популяции находится в развернутом состоянии, а другая половина находится в свернутом состоянии. Поведение ферментов при тепловом развертывании обычно изучается с помощью калориметрии или оптических методик, таких как круговой дихроизм, флуоресценция или светорассеяние.

Термин "клада фитаз с высокой Tm" относится к кладе полипептидов фитаз или их фрагментов, характеризующихся Tm, составляющей по меньшей мере 92,5° при использовании дифференциальной сканирующей калориметрии, как описано ниже в примере 3. Термины "полипептиды из клады фитаз с высокой Tm" и "сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты" используются в данном документе взаимозаменяемо.

Термины "внесение жидкой формы в смеситель" и "MLA" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к получению кормов для животных, где термочувствительные соединения, в частности ферменты, могут быть внесены в жидкой форме в корм для животных перед кондиционированием и брикетированием и остаются функциональными в корме после кондиционирования и брикетирования.

"Корм" означает любой натуральный или искусственный рацион, еду или им подобное или компоненты такой еды, предназначенные или подходящие соответственно для употребления в пищу, поглощения, переваривания животным, отличным от человека. Термин "корм" предпочтительно используется в отношении продуктов, которыми кормят животных при выращивании сельскохозяйственных животных. Термины "корм" и "корм для животных" используются в данном документе взаимозаменяемо.

"Кормовая добавка", как используется в данном документе, относится к одному или более ингредиентам, продуктам из веществ (например, клеток), применяемым по отдельности или вместе в питании (например, для улучшения качества пищи (например, корма для животных), для улучшения продуктивности и/или состояния здоровья животного и/или для повышения усвояемости пищи или материалов в пище.

Используемый в данном документе термин "пища" используется в широком смысле и охватывает пищевые продукты и продукты питания в любой форме для людей, а также пищу для животных (т. е. корм).

Пища или корм могут быть представлены в форме раствора или в виде твердого вещества в зависимости от применения, и/или способа внесения, и/или способа введения. В некоторых вариантах осуществления упомянутые в данном документе ферменты можно применять в качестве пищевого или кормового вещества или при их приготовлении или получении.

Используемый в данном документе термин "пищевой или кормовой ингредиент" включает состав, который добавляется или может быть добавлен в продукты питания или пищевые продукты, и включает составы, которые можно применять на низких уровнях в широком разнообразии продуктов. Пищевой ингредиент может быть представлен в форме раствора или в виде твердого вещества в зависимости от применения, и/или способа внесения, и/или способа введения. Ферменты, описанные в данном документе, можно применять в качестве пищевого или кормового ингредиента или при их приготовлении или получении. Ферменты могут быть добавлены или могут быть не добавлены в биологически активные добавки. Кормовые композиции для моногастричных животных обычно включают композиции, содержащие растительные продукты, которые содержат фитат. Такие композиции включают без ограничения корма на основе кукурузной муки, соевой муки, рапсовой муки, хлопковой муки, маиса, пшеницы, ячменя и сорго.

Используемый в данном документе термин "брикетирование" относится к получению брикетов, которые могут представлять собой твердые, округлые, сферические и цилиндрические таблетки, в частности кормовых брикетов и твердых экструдированных кормов для животных. Один пример известного производственного процесса брикетирования кормов обычно включает смешивание пищевых или кормовых ингредиентов друг с другом в течение по меньшей мере 1 минуты при комнатной температуре, перенос смеси в уравнительный бункер, конвейерную транспортировку смеси в паровой кондиционер (т. е. кондиционирование), необязательно перенос смеси, кондиционированной паром, в экспандер, перенос смеси в брикетировочную машину или экструдер и, наконец, перенос брикетов в охладитель брикетов. (Fairfield, D. 1994. Chapter 10, Pelleting Cost Center. В Feed Manufacturing Technology IV. (McEllhiney, editor), American Feed Industry Association, Arlington, Va., pp. 110-139).

Термин "брикет" относится к композиции корма для животных (обычно полученного из зерна), который был подвергнут термической обработке, такой как обработка паром (т. е. кондиционирование), и спрессован или экструдирован с помощью машины. Брикет может содержать фермент в форме жидкого препарата или сухого препарата. Сухой препарат может иметь покрытие или не иметь покрытия и может быть представлен в форме гранулы. Термин "гранула" используется для частиц, которые состоят из ферментов (таких как фитаза, например, любой из сконструированных полипептидов фитаз, раскрытых в данном документе) и других химических веществ, таких как соли и сахара, и могут быть образованы с помощью любой из множества методик, включая подходы к грануляции в псевдоожиженном слое для образования многослойных гранул.

Термины "выход в корме при брикетировании", "показатель выхода активности" или "выход активности" относятся к соотношению (i) активности кормового фермента после обработки, предусматривающей один или более из следующих факторов стресса: нагревание, повышенное давление, повышенный pH, пониженный pH, хранение, сушку, воздействие поверхностно-активного(поверхностно-активных) вещества(веществ), воздействие растворителя(растворителей) и механический стресс, и (ii) активности фермента до обработки. Выход активности может быть выражен в процентах. Процент выхода активности рассчитывается следующим образом:

Фитаза может проявлять стабильность, демонстрируя любое из улучшенных "выхода в корме при брикетировании", "выхода активности", "термостабильности" или "обратимости инактивации".

Применительно к экспериментам по брикетированию "активность до обработки" может быть примерно определена путем измерения активности фитазы, присутствующей в мешанке, которая не подвергается обработке, способом, который в остальном подходит для фитазы, которая подвергается обработке. Например, фитаза в необработанной мешанке подвергается обращению и хранится в течение аналогичного времени и в аналогичных условиях по сравнению с фитазой в обработанной мешанке для контроля возможных взаимодействий или других эффектов за рамками указанной обработки как таковой.

Термины "тест выхода в корме при брикетировании" и "стандартный тест в корме при брикетировании" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к тесту для измерения или оценки стабильности кормового фермента, выдерживающего термическую обработку в виде кондиционирования и брикетирование.

Например, такой тест выхода в корме при брикетировании изложен в примере 5 ниже.

Термин "фитазная активность" в отношении определения в твердых или жидких препаратах означает 1 FTU (фитазную единицу), которая определяется как количество фермента, необходимое для высвобождения 1 микромоля неорганического ортофосфата из 5,0 мМ субстрата, представляющего собой фитат натрия (из риса), за одну минуту в условиях реакции при pH 5,5 и 37°C, которые также определены в анализе фитазы согласно ISO 2009 - Стандартном анализе для определения фитазной активности, который можно найти в International Standard ISO/DIS 30024: 1-17, 2009.

В качестве альтернативы, как используется в данном документе, одна фитазная единица (Ед) может быть определена как количество фермента, которое приводит к высвобождению 1 микромоля неорганического ортофосфата из 0,2 мМ субстрата, представляющего собой фитат натрия (из риса), за одну минуту в условиях реакции при 25°C и pH 5,5 или 3,5 соответственно в анализе с малахитовым зеленым, как проиллюстрировано в примере 3.

Термин "удельная активность", используемый в данном документе, означает количество единиц фермента на мл, деленное на концентрацию (общего) белка в мг/мл. Поэтому значения удельной активности обычно выражаются в единицах/мг. В качестве альтернативы удельная активность представляет собой количество единиц фермента на мл, деленное на концентрацию фитазы в мг/мл.

Термин "дифференциальная сканирующая калориметрия" или "DSC", используемый в данном документе, означает термоаналитическую методику, в которой разница в количестве тепла, необходимого для повышения температуры образца и эталона, измеряется в зависимости от температуры. В течение всего эксперимента образец и эталон поддерживают при примерно одинаковой температуре. Как правило, температурная программа для анализа методом DSC разработана таким образом, что температура держателя образца повышается линейно в зависимости от времени. Эталонный образец должен иметь четко определенную теплоемкость в диапазоне температур, подлежащем сканированию.

Термин "пребиотик" обозначает неусваиваемый пищевой ингредиент, который благоприятно воздействует на хозяина путем избирательного стимулирования роста и/или активности одной или ограниченного числа полезных бактерий.

Термин "пробиотик" ("DFM"), используемый в данном документе, означает источник живых (жизнеспособных) микроорганизмов, которые при применении в достаточном количестве могут принести пользу получающему их организму, т. е. пробиотическое средство. DFM может содержать один или более таких микроорганизмов, таких как бактериальные штаммы. Категории DFM включают бациллы, молочнокислые бактерии и дрожжи. Таким образом, термин "DFM" охватывает одно или более из следующих: бактерии-пробиотики, дрожжи-пробиотики, дрожжи-пробиотики и их комбинации.

Бациллы представляют собой уникальные грамположительные палочковидные бактерии, которые образуют споры. Эти споры являются очень стабильными и могут выдерживать такие условия окружающей среды, как тепло, влага и определенный диапазон рН. Эти споры прорастают в активные вегетативные клетки при проглатывании животным и могут применяться в молотых и брикетированных рационах. Молочнокислые бактерии представляют собой грамположительные кокки, продуцирующие молочную кислоту, которые являются антагонистами патогенов. Поскольку молочнокислые бактерии, по-видимому, до некоторой степени являются термочувствительными, их не применяют в брикетированных рационах. Типы молочнокислых бактерий включают Bifidobacterium, Lactobacillus и Streptococcus.

Термины "пробиотическое средство", "пробиотическая культура" и "DFM" используются в данном документе взаимозаменяемо и определяют живые микроорганизмы (в том числе, например, бактерии или дрожжи), которые, например, при проглатывании или местном нанесении в достаточных количествах благоприятно воздействуют на организм-хозяина, т. е. обеспечивают один или более очевидных благоприятных эффектов для здоровья организма-хозяина, такие как польза для здоровья, пищеварения и/или продуктивности. Пробиотические средства могут улучшать баланс микробиоты на поверхностях одной или более слизистых оболочек. Например, поверхность слизистой оболочки может находиться в кишечнике, мочевыводящих путях, дыхательных путях или на коже. Используемый в данном документе термин "пробиотическое средство" также охватывает живые микроорганизмы, которые могут стимулировать значимые ветви иммунной системы и в то же время уменьшать воспалительные реакции на поверхности слизистой оболочки, например, пищеварительного канала. Хотя не существует верхних или нижних пределов для потребления пробиотических средств, было высказано предположение, что по меньшей мере 10⁶-10¹², предпочтительно по меньшей мере 10⁶-10¹⁰, предпочтительно 10⁸-10⁹ КОЕ в качестве суточной дозы будет эффективно для достижения благоприятных эффектов для здоровья субъекта.

Используемый в данном документе термин "КОЕ" обозначает "колониеобразующие единицы" и является мерой количества жизнеспособных клеток, где колония представляет совокупность клеток, полученных из одной клетки-предшественника.

Термин "выделенный" означает вещество в форме или среде, которая не встречается в природе, и не отражает степень, в которой изолят был очищен, но указывает на выделение или отделение от нативной формы или нативной среды. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают: (1) любое не встречающееся в природе вещество, (2) любое вещество, в том числе без ограничения любые клетку-хозяина, фермент, сконструированный фермент, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которое по меньшей мере частично удалено от одной или более или всех встречающихся в природе составляющих, с которыми оно связано в природе; (3) любое вещество, модифицированное человеком, по сравнению с этим веществом, обнаруживаемым в природе; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в природе. Термины "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", "выделенный полинуклеотид" и "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" будут использоваться взаимозаменяемо и относятся к полимеру РНК или ДНК, который является одно- или двухнитевым, необязательно содержащим синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты в форме полимера ДНК может состоять из одного или более сегментов кДНК, геномной ДНК или синтетической ДНК.

Термины "очищать", "очищенный" и "очистка" означают сделать практически чистым или очищенным от нежелательных компонентов, загрязнения материала, примеси или дефекта. Например, применительно к нуклеиновым кислотам или полипептидам очистка, как правило, обозначает нуклеиновую кислоту или полипептид, которые по сути не содержат других компонентов, что определено с помощью аналитических методик, хорошо известных в данной области техники (например, очищенный полипептид или полинуклеотид образует отдельную полосу в электрофоретическом геле, хроматографическом элюате и/или средах, подвергнутых центрифугированию в градиенте плотности). Например, нуклеиновая кислота или полипептид, которые дают по сути одну полосу в электрофоретическом геле, являются "очищенными". Чистота очищенных нуклеиновой кислоты или полипептида составляет по меньшей мере приблизительно 50%, обычно по меньшей мере приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5%, приблизительно 99,6%, приблизительно 99,7%, приблизительно 99,8% или больше (например, в процентах по весу в молярном исчислении). Иными словами, композиция обогащена молекулой, если имеет место значительное увеличение концентрации молекулы после применения методики очистки или обогащения. Термин "обогащенный" относится к соединению, полипептиду, клетке, нуклеиновой кислоте, аминокислоте или другому определенному материалу или компоненту, которые присутствуют в композиции в относительной или абсолютной концентрации, более высокой, чем в первоначальной композиции.

Термины "пептиды", "белки" и "полипептиды" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимеру из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. "Белок" или "полипептид" содержит полимерную последовательность аминокислотных остатков. Во всем настоящем раскрытии используется одно- и 3-буквенный код для аминокислот, который определен согласно правилам Объединенной комиссии по биохимической номенклатуре (JCBN) IUPAC-IUB. Одна буква X относится к любой из двадцати аминокислот. Также понятно, что полипептид может кодироваться более чем одной нуклеотидной последовательностью вследствие вырожденности генетического кода. Мутации могут быть названы с помощью однобуквенного кода исходной аминокислоты, за которым следует номер положения, а затем однобуквенный код вариантной аминокислоты. Например, мутация по типу замены глицина (G) в положении 87 на серин (S) представлена как "G087S" или "G87S". При описании модификаций положение, за которым следуют аминокислоты, перечисленные в скобках, указывает на перечень замен в этом положении любой из перечисленных аминокислот. Например, 6(L, I) означает, что в положении 6 может быть произведена замена лейцином или изолейцином. Иногда в последовательности используется косая черта (/) для обозначения замен, например, F/V указывает на то, что в положении может находиться фенилаланин или валин.

Термины "сигнальная последовательность" и "сигнальный пептид" относятся к последовательности аминокислотных остатков, которая может участвовать в секреции или управлении транспортом зрелой формы или формы-предшественника белка. Сигнальная последовательность обычно расположена с N-концевой стороны от последовательности белка-предшественника или зрелого белка. Сигнальная последовательность может быть эндогенной или экзогенной. Сигнальная последовательность обычно отсутствует у зрелого белка. Сигнальная последовательность обычно отщепляется от белка сигнальной пептидазой после осуществления транспорта белка.

Термин "зрелая форма" белка, полипептида или пептида относится к функциональной форме белка, полипептида или фермента без сигнальной пептидной последовательности и пропептидной последовательности.

Термин "дикий тип" в отношении аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты указывает на то, что аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты является нативной или встречающейся в природе последовательностью. Используемый в данном документе термин "встречающийся в природе" относится к любым объектам (например, белкам, аминокислотам или последовательностям нуклеиновых кислот), обнаруживаемым в природе. В противоположность этому, термин "не встречающийся в природе" относится к любым объектам, не обнаруживаемым в природе (например, рекомбинантным/сконструированным нуклеиновым кислотам и белковым последовательностям, полученным в лаборатории, или модификациям последовательности дикого типа).

Как используется в данном документе в отношении положений аминокислотных остатков, "соответствующий чему-либо", или "соответствует чему-либо", или "соответствуют чему-либо", или "соответствует" относится к аминокислотному остатку в пронумерованном положении в белке или пептиде или аминокислотному остатку, аналогичному, гомологичному или эквивалентному пронумерованному остатку в белке или пептиде. Как используется в данном документе, "соответствующая область", как правило, относится к аналогичному положению в родственном белке или эталонном белке.

Термины "происходящий из" и "полученный из" относятся не только к белку, продуцированному или продуцируемому штаммом рассматриваемого организма, но также к белку, кодируемому последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма, и продуцируемому в организме-хозяине, содержащем такую последовательность ДНК. Кроме того, данный термин относится к белку, кодируемому последовательностью ДНК, имеющей синтетическое происхождение и/или происходящей из кДНК, который имеет отличительные характеристики рассматриваемого белка.

Термин "аминокислота" относится к основной химической структурной единице белка или полипептида. Следующие сокращения, используемые в данном документе для обозначения конкретных аминокислот, можно найти в таблице 1.

Таблица 1. Одно- и трехбуквенные сокращения аминокислот

Аминокислота Трехбуквенное
сокращение Однобуквенное
сокращение Аланин Ala A Аргинин Arg R Аспарагин Asn N Термостабильная сериновая кислота Asp D Цистеин Cys C Глутамин Gln Q Глутаминовая кислота Glu E Глицин Gly G Гистидин His H Изолейцин Ile I Лейцин Leu L Лизин Lys K Метионин Met M Фенилаланин Phe F Пролин Pro P Серин Ser S Треонин Thr T Триптофан Trp W Тирозин Tyr Y Валин Val V Любая аминокислота или как определено в данном документе Xaa X

Средний специалист в данной области поймет, что могут быть выполнены модификации аминокислотных последовательностей, раскрытых в данном документе, с сохранением при этом функции, ассоциированной с раскрытыми аминокислотными последовательностями. Например, из уровня техники хорошо известно, что изменения в гене, результатом которых является получение химически эквивалентной аминокислоты в данном сайте без влияния на функциональные свойства кодируемого белка, являются широко распространенными.

Термин "кодон-оптимизированный", относящийся к генам или кодирующим областям молекул нуклеиновой кислоты для трансформации различных хозяев, относится к изменению кодонов в гене или кодирующих областях молекул нуклеиновой кислоты, отражающему обычную частоту использования кодонов у организма-хозяина, без изменения полипептида, кодируемого ДНК.

Термин "ген" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует конкретный белок, включая регуляторные последовательности, предшествующие кодирующей последовательности (5'-некодирующие последовательности) и следующие за ней (3'-некодирующие последовательности). "Нативный ген" относится к гену, обнаруживаемому в природе, со своими собственными регуляторными последовательностями. "Химерный ген" относится к любому гену, который не является нативным геном, содержащему регуляторные и кодирующие последовательности, которые не обнаруживаются вместе в природе. Соответственно, химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые получены из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые получены из одного и того же источника, но расположены в порядке, отличающемся от обнаруживаемого в природе. "Эндогенный ген" относится к нативному гену в его естественном местоположении в геноме организма. "Чужеродный" ген относится к гену, обычно не обнаруживаемому в организме-хозяине, который введен в организм-хозяина путем переноса генов. Чужеродные гены могут включать нативные гены, встроенные в организм, не являющийся нативным, или химерные гены. "Трансген" представляет собой ген, который был введен в геном с помощью процедуры трансформации.

Термин "интрон" означает любую нуклеотидную последовательность в гене, которая удаляется с помощью сплайсинга РНК в ходе созревания конечного продукта РНК. Термин "интрон" относится как к последовательности ДНК в гене, так и к соответствующей последовательности в РНК-транскриптах.

Термин "кодирующая последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует конкретную аминокислотную последовательность. "Подходящие регуляторные последовательности" относятся к нуклеотидным последовательностям, которые расположены выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности и которые влияют на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, сайт процессинга РНК, сайты связывания эффекторов и структуры "стебель-петля".

Термин "функционально связанный" относится к ассоциации последовательностей нуклеиновой кислоты в одной молекуле нуклеиновой кислоты таким образом, что на функцию одной влияет другая. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен влиять на экспрессию такой кодирующей последовательности, т. е. кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора. Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.

Термины "регуляторная последовательность" или "контролирующая последовательность" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к сегменту нуклеотидной последовательности, который способен повышать или понижать экспрессию конкретных генов в организме. Примеры регуляторных последовательностей включают без ограничения промоторы, сигнальную последовательность, операторы и т. п. Как отмечено выше, регуляторные последовательности могут быть функционально связаны в смысловой или антисмысловой ориентации с кодирующей последовательностью/геном, представляющими интерес.

"Промотор" или "промоторные последовательности" относятся к регуляторной последовательности, которая участвует в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции гена. Промотор может быть индуцируемым промотором или конститутивным промотором. Предпочтительным промотором, применяемым в настоящем изобретении, является промотор cbh1 Trichoderma reesei, который представляет собой индуцируемый промотор.

"3'-некодирующие последовательности" относятся к последовательностям ДНК, расположенным ниже кодирующей последовательности, и включают последовательности, кодирующие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов, такие как сигнал терминации транскрипции.

Используемый в данном документе термин "трансформация" относится к переносу или введению молекулы нуклеиновой кислоты в организм-хозяина. Молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в виде линейной или кольцевой формы ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой плазмиду, которая реплицируется автономно, или она может интегрироваться в геном хозяина-продуцента. Хозяева-продуценты, содержащие трансформированную нуклеиновую кислоту, называются "трансформированными", или "рекомбинантными", или "трансгенными" организмами или "трансформантами".

Термины "рекомбинантный" и "сконструированный" относятся к искусственной комбинации двух в иных случаях разделенных сегментов последовательностей нуклеиновой кислоты, например, с помощью химического синтеза или с помощью манипуляции с выделенными сегментами нуклеиновых кислот посредством методик генной инженерии. Например, это относится к ДНК, в которую были вставлены один или более сегментов или генов естественным образом либо с помощью лабораторной манипуляции из другой молекулы, из другой части той же молекулы или из искусственной последовательности, что привело к введению новой последовательности в ген и, соответственно, в организм. Термины "рекомбинантный", "трансгенный", "трансформированный", "сконструированный", "генно-инженерный" и "модифицированный для экспрессии экзогенного гена" используются в данном документе взаимозаменяемо.

Термины "рекомбинантная конструкция", "экспрессионная конструкция", "рекомбинантная экспрессионная конструкция" и "кассета экспрессии" используются в данном документе взаимозаменяемо. Рекомбинантная конструкция содержит искусственную комбинацию фрагментов нуклеиновых кислот, например, регуляторных и кодирующих последовательностей, не все из которых обнаруживаются вместе в природе. Например, конструкция может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые получены из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые получены из одного и того же источника, но расположены в порядке, отличающемся от обнаруживаемого в природе. Такую конструкцию можно применять саму по себе или можно применять в сочетании с вектором. Если применяют вектор, тогда выбор вектора зависит от способа, который будут применять для трансформации клеток-хозяев, что хорошо известно специалистам в данной области. Например, можно применять плазмидный вектор. Специалисту в данной области хорошо известны генетические элементы, которые должны присутствовать в векторе для успешной трансформации, отбора и размножения клеток-хозяев. Специалисту в данной области также будет понятно, что разные независимые события трансформации могут приводить к разным уровням и профилям экспрессии (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78-86), и, таким образом, для того, чтобы получить линии, демонстрирующие требуемый уровень и профиль экспрессии, обычно проводят скрининг нескольких объектов. Такой скрининг можно осуществлять с применением стандартных молекулярно-биологических, биохимических и других анализов, в том числе Саузерн-блот-анализа ДНК, нозерн-блот-анализа экспрессии мРНК, ПЦР, количественной ПЦР в реальном времени (qPCR), ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR), анализа экспрессии белков методом иммуноблоттинга, ферментативных анализов или анализов активности и/или фенотипического анализа.

Термины "хозяин-продуцент", "хозяин" и "клетка-хозяин" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к любому растению, организму или клетке любого растения или организма, независимо от того, является ли он человеком или отличным от человека, в который может быть стабильно или транзиентно введена рекомбинантная конструкция для экспрессии гена. Этот термин охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке вследствие мутаций, возникших в ходе размножения.

Термин "процент идентичности" означает взаимоотношение между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определенное путем сравнения последовательностей. В данной области техники "идентичность" также означает степень родства последовательностей между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями, в зависимости от конкретного случая, определенную по количеству совпадающих нуклеотидов или аминокислот между нитями таких последовательностей. "Идентичность" и "сходство" могут быть легко вычислены с помощью известных способов, в том числе без ограничения тех, которые описаны в Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987) и Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Способы определения идентичности и сходства прописаны в коде общедоступных компьютерных программ.

Используемый в данном документе термин "% идентичности", или "процент идентичности", или "PID" относится к идентичности белковой последовательности. Процент идентичности может быть определен с применением стандартных методик, известных из уровня техники. Применимые алгоритмы включают алгоритмы BLAST (см. Altschul et al., J Mol Biol, 215:403-410, 1990; и Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993). В программе BLAST используются несколько параметров поиска, для большинства из которых установлены значения по умолчанию. Алгоритм BLAST NCBI находит наиболее релевантные последовательности с точки зрения биологического сходства, но не рекомендуется для запрашиваемых последовательностей длиной менее 20 остатков (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997; и Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2994-3005, 2001). Иллюстративные параметры BLAST по умолчанию для поиска последовательностей нуклеиновых кислот включают следующие: пороговая длина соседнего слова=11; значение отсечения для E-значения=10; матрица замен=NUC.3.1 (соответствие=1, несоответствие = -3); штраф за открытие гэпа=5 и штраф за удлинение гэпа=2. Иллюстративные параметры BLAST по умолчанию для поиска аминокислотных последовательностей включают следующие: размер слова=3; значение отсечения для E-значения=10; матрица замен=BLOSUM62; штраф за открытие гэпа=11 и штраф за удлинение гэпа=1. Значение процента (%) идентичности аминокислотной последовательности определяют путем деления количества совпадающих идентичных остатков на общее количество остатков в "эталонной" последовательности. Алгоритмы BLAST обращаются к "эталонной" последовательности как к "запрашиваемой" последовательности.

Как используется в данном документе, "гомологичные белки" или "гомологичные фитазы" относятся к белкам, которые имеют выраженное сходство в первичной, вторичной и/или третичной структуре. Гомология белков может относиться к сходству в линейной аминокислотной последовательности при выравнивании белков. Поиск гомологии для белковых последовательностей может быть выполнен с применением BLASTP и PSI-BLAST из BLAST NCBI с пороговым значением (значением отсечения для E-значения), установленным на 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997 Set 1;25(17):3389-402). Используя эту информацию, можно сгруппировать белковые последовательности.

Выравнивания последовательностей и расчеты процента идентичности можно выполнять с помощью программы Megalign из пакета биоинформатических вычислительных программ LASERGENE (DNASTAR Inc., Мэдисон, Висконсин), программы AlignX из Vector NTI версии 7.0 (Informax, Inc., Бетесда, Мэриленд), или пакета открытого программного обеспечения EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)). Множественное выравнивание последовательностей можно выполнять с помощью способа выравнивания Clustal (такого как CLUSTALW; например версии 1.83) (Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994); и Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500 (2003)), доступного от Европейской молекулярно-биологической лаборатории через Европейский институт биоинформатики) с параметрами по умолчанию. Подходящие параметры для выравниваний белков в CLUSTALW включают следующие: штраф за наличие гэпа=15, штраф за удлинение гэпа=0,2, матрица=Gonnet (например, Gonnet250), учет концевых гэпов в белке = -1, расстояние разделения гэпов в белке=4 и размер k-кортежа=1. В одном варианте осуществления быстрое или медленное выравнивание применяют с настройками по умолчанию для медленного выравнивания. В качестве альтернативы параметры, используемые в способе CLUSTALW (например, версии 1.83), можно модифицировать с использованием также следующих параметров: размер участка максимального совпадения=1, штраф за введение гэпа=10, штраф за удлинение гэпа=1, матрица=BLOSUM (например, BLOSUM64), размер окна=5 и число лучших сохраненных диагоналей=5. В качестве альтернативы множественное выравнивание последовательностей может быть получено с помощью выравнивания MAFFT из Geneious® версии 10.2.4 с настройками по умолчанию, матрицей замен BLOSUM62, штрафом за открытие гэпа 1,53 и значением смещения 0,123.

Программа MUSCLE (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1792-1797) представляет собой еще один пример алгоритма множественного выравнивания последовательностей.

Филогенетическое или эволюционное дерево изображено на фигуре 2 и показывает родство между различными фитазами, включая сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты, на основании сходств и различий в аминокислотной последовательности.

Другой способ определения сходства последовательностей заключается в создании скрытой марковской модели (HMM). HMM представляют собой вероятностные структуры, в которых наблюдаемые данные (такие как ДНК или аминокислотная последовательность) моделируются на основе серии выходных (или выпущенных) данных, генерируемых одним из нескольких (скрытых) внутренних состояний. HMM часто используются для статистического анализа множественных выравниваний последовательностей ДНК. Их можно использовать для идентификации геномных признаков, таких как ORF, вставки, делеции, замены и белковые домены, среди многих других. HMM также можно использовать для идентификации гомологий; например, широко используемая база данных Pfam (Punta et al., 2012) представляет собой базу данных семейств белков, идентифицированных с помощью HMM. HMM могут быть значительно более точными, чем наиболее интенсивно используемый инструмент сравнения последовательностей - BLAST (средство поиска основного локального выравнивания), впервые полученный в 1990 г. (Altschul et al., 1990, 1997). Соответственно, полипептидные последовательности полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов, показанных в примере 4, использовали для создания скрытой марковской модели (HMM) для определения сходства последовательностей.

Термин "сконструированный полипептид фитаза" означает, что полипептид не встречается в природе и обладает фитазной активностью.

Следует отметить, что фрагмент сконструированного полипептида фитазы представляет собой часть или подпоследовательность сконструированного полипептида фитазы, которая способна функционировать подобно сконструированному полипептиду фитазе, т. е. он сохраняет фитазную активность.

Термин "вектор" относится к полинуклеотидной последовательности, предназначенной для введения нуклеиновых кислот в один или более типов клеток. Векторы включают без ограничения клонирующие векторы, векторы экспрессии, челночные векторы, плазмиды, фаговые частицы, кассеты и т. п.

"Вектор экспрессии", как используется в данном документе, означает ДНК-конструкцию, содержащую последовательность ДНК, которая функционально связана с подходящей контролирующей последовательностью, способной осуществлять экспрессию ДНК в подходящем хозяине. Такие контролирующие последовательности могут включать промотор для осуществления транскрипции, необязательную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосом в мРНК, энхансеры и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции.

Используемый в данном документе термин "экспрессия" относится к получению функционального конечного продукта (например, мРНК или белка) в форме предшественника либо в зрелой форме. Экспрессия также может относиться к трансляции мРНК в полипептид.

Экспрессия гена предусматривает транскрипцию гена и трансляцию мРНК в белок-предшественник или зрелый белок. "Зрелый" белок относится к полипептиду, подвергнутому посттрансляционному процессингу; т. е. полипептиду, из которого были удалены какие-либо сигнальные последовательности, пре- или пропептиды, присутствовавшие в первичном продукте трансляции. "Белок-предшественник" относится к первичному продукту трансляции мРНК; т. е. с еще присутствующими пре- и пропептидами. Пре- и пропептиды могут представлять собой без ограничения сигналы внутриклеточной локализации. "Стабильная трансформация" относится к переносу фрагмента нуклеиновой кислоты в геном организма-хозяина, в том числе как в ядерный геном, так и в геном органелл, что приводит к генетически стабильному наследованию. В отличие от этого, "транзиентная трансформация" относится к переносу фрагмента нуклеиновой кислоты в ядро или органеллу, содержащую ДНК, организма-хозяина, что приводит к экспрессии гена без интеграции или стабильного наследования.

Таким образом, в одном варианте осуществления описана рекомбинантная конструкция, содержащая регуляторную последовательность, функциональную в организме хозяина-продуцента, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный полипептид фитазу и его фрагменты, описанные в данном документе.

Эта рекомбинантная конструкция может содержать регуляторную последовательность, функциональную в организме хозяина-продуцента, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей любой из сконструированного полипептида фитазы и его фрагментов, описанных в данном документе. Кроме того, хозяин-продуцент выбран из группы, состоящей из бактерий, грибов, дрожжей, растений или водорослей. Предпочтительным хозяином-продуцентом является нитчатый гриб Trichoderma reesei.

В качестве альтернативы можно использовать бесклеточный синтез белка, описанный в Chong, Curr Protoc Mol Biol. 2014; 108: 16.30.1-16.30.11.

Также в данном документе описан способ получения сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента, включающий:

(a) трансформацию хозяина-продуцента рекомбинантной конструкцией, описанной в данном документе; и

(b) культивирование хозяина-продуцента из стадии (а) в условиях, при которых продуцируется сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент.

Сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент необязательно можно извлекать из хозяина-продуцента.

В другом аспекте надосадочную жидкость культуры, содержащую фитазу, можно получить с помощью любого из способов, раскрытых в данном документе.

В другом варианте осуществления описана полинуклеотидная последовательность, кодирующая любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, описанных в данном документе.

Возможные области контроля инициации или промоторы, которые могут быть включены в вектор экспрессии, являются многочисленными и знакомыми специалистам в данной области. "Конститутивный промотор" представляет собой промотор, который является активным в большинстве условий окружающей среды и условий развития. "Индуцируемый" или "репрессируемый" промотор представляет собой промотор, который является активным в условиях регуляции факторами окружающей среды или в ходе развития. В некоторых вариантах осуществления промоторы являются индуцируемыми или репрессируемыми вследствие изменений факторов окружающей среды, в том числе без ограничения доступности углерода, азота или других питательных веществ, температуры, pH, осмолярности, присутствия тяжелого(тяжелых) металла(металлов), концентрации ингибитора(ингибиторов), стресса или комбинации вышеуказанного, что известно из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления индуцируемые или репрессируемые промоторы индуцируются или репрессируются метаболическими факторами, такими как уровень определенных источников углерода, уровень определенных источников энергии, уровень определенных катаболитов или комбинация вышеуказанного, что известно из уровня техники.

В одном варианте осуществления промотор представляет собой такой промотор, который является нативным в отношении клетки-хозяина. Например, в некоторых случаях, если Trichoderma reesei является хозяином, промотор может представлять собой нативный промотор T. reesei, такой как промотор cbh1, который депонирован в GenBank под номером доступа D86235. Другие подходящие неограничивающие примеры промоторов, пригодные для экспрессии в грибах, включают промоторы cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, xyn1 и xyn2, репрессируемый промотор гена кислой фосфатазы (phoA) P. chrysogenum (см., например, Graessle et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63: 753-756), репрессируемый глюкозой промотор PCK1 (см., например, Leuker et al., (1997), Gene, 192:235-240), индуцируемый мальтозой и репрессируемый глюкозой промотор MET3 (см. Liu et al., (2006), Eukary. Cell, 5:638-649), промотор pKi и промотор cpc1. Другие примеры применимых промоторов включают промоторы генов глюкоамилазы A. awamori и A. niger (см., например, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 15 4:2306-2315 и Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1581-1585). Кроме того, могут быть применимы промоторы гена xln1 T. reesei (см., например, EPA 137280A1).

Фрагменты ДНК, которые контролируют терминацию транскрипции, также можно получить из разных генов, нативных для предпочтительной клетки-хозяина, являющейся продуцентом. В определенных вариантах осуществления включение области контроля терминации является необязательным. В определенных вариантах осуществления вектор экспрессии содержит область контроля терминации, полученную из предпочтительной клетки-хозяина.

Термины "хозяин-продуцент", "клетка-хозяин, являющаяся продуцентом", "клетка-хозяин" и "штаммы-хозяева" используются в данном документе взаимозаменяемо и означают подходящего хозяина для вектора экспрессии или ДНК-конструкции, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид фитазу или его фрагмент. Выбор хозяина-продуцента может осуществляться из группы, состоящей из бактерий, грибов, дрожжей, растений и водорослей. Обычно выбор будет зависеть от гена, кодирующего сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент, и его источника.

В частности, штаммы-хозяева предпочтительно представляют собой клетки нитчатых грибов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения "клетка-хозяин" означает как клетки, так и протопласты, полученные из клеток штамма нитчатого гриба и, в частности, Trichoderma sp. или Aspergillus sp.

Термин "нитчатые грибы" относится ко всем нитчатым формам подотдела Eumycotina (см. Alexopoulos, C.J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York). Эти грибы характеризуются наличием вегетативного мицелия с клеточной стенкой, состоящей из хитина, целлюлозы и других сложных полисахаридов. Нитчатые грибы по настоящему изобретению морфологически, физиологически и генетически отличаются от дрожжей. Вегетативный рост нитчатых грибов происходит путем удлинения гиф, и катаболизм углерода является облигатно-аэробным. В настоящем изобретении родительская клетка нитчатого гриба может представлять собой клетку, относящуюся без ограничения к виду Trichoderma (например, Trichoderma reesei (ранее классифицированному как T. longibrachiatum и в настоящее время также известному как Hypocrea jecorina), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum); Penicillium sp., Humicola sp. (например, Humicola insolens и Humicola grisea); Chrysosporium sp. (например, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (например, A. oryzae, A. niger и A. awamori), Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp. и Emericella sp. (см. также Innis et al., (1985) Sci. 228:21-26).

Используемый в данном документе термин "Trichoderma" или "Trichoderma sp." относится к любому роду грибов, ранее или в настоящее время классифицируемому как Trichoderma.

Кассета экспрессии может быть включена в организм хозяина-продуцента, в частности, в клетки микробных хозяев-продуцентов. Клетки-хозяева, являющиеся продуцентами, могут быть микробными хозяевами, которые обнаруживаются среди семейств грибов и которые растут в широком диапазоне значений температуры, рН и выносливости к растворителям. Например, предполагается, что любые из бактерий, дрожжей, растений, водорослей или грибов, таких как нитчатые грибы, могут соответствующим образом содержать вектор экспрессии.

Включение кассеты экспрессии в клетку-хозяина, являющуюся продуцентом, можно применять для экспрессии белка, представляющего интерес, таким образом, что он может находиться внутриклеточно, внеклеточно или в комбинации местоположений как внутри, так и снаружи клетки. Внеклеточная экспрессия делает более легким извлечение требуемого белка из продукта ферментации, чем в способах извлечения белка, получаемого путем внутриклеточной экспрессии.

Способы введения нуклеиновых кислот путем трансформации в нитчатые грибы, такие как Aspergillus spp., например, A. oryzae или A. niger, H. grisea, H. insolens и T. reesei., хорошо известны из уровня техники. Подходящая процедура трансформации клеток-хозяев, являющихся клетками Aspergillus, описана, например, в EP238023.

Подходящая процедура трансформации клеток-хозяев, являющихся клетками Trichoderma, описана, например, в Steiger et al 2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:114-121. Поглощение ДНК штаммом-хозяином, относящимся к Trichoderma sp., зависит от концентрации ионов кальция. Как правило, в растворе для поглощения используется от приблизительно 10 мM CaCl₂ до 50 мM CaCl₂. Помимо потребности в ионах кальция в растворе для поглощения, другими соединениями, обычно включенными, являются буферная система, такая как буфер TE (10 мМ Tris, pH 7,4; 1 мМ EDTA) или 10 мМ буфер MOPS, pH 6,0 (морфолинпропансульфоновая кислота), и полиэтиленгликоль (PEG). Полагают, что действие полиэтиленгликоля заключается в слиянии клеточных мембран, что таким образом позволяет доставлять содержимое среды в цитоплазму штамма Trichoderma sp. и обеспечивать перенос плазмидной ДНК в ядро. Это слияние зачастую обеспечивает интеграцию нескольких копий плазмидной ДНК в хромосому хозяина.

Обычно при трансформации используют суспензию, содержащую протопласты или клетки Trichoderma sp., которые были подвергнуты обработке для повышения проницаемости, при плотности от 10⁵ до 10⁷/мл, предпочтительно 2×10⁶/мл. Объем 100 мкл этих протопластов или клеток в соответствующем растворе (например, 1,2 М сорбита; 50 мМ CaCl₂) смешивают с необходимой ДНК. Как правило, в раствор для поглощения добавляют PEG в высокой концентрации. К суспензии протопластов можно добавлять от 0,1 до 1 объема 25% PEG 4000. Однако предпочтительно добавлять к суспензии протопластов приблизительно 0,25 объема. Добавки, такие как диметилсульфоксид, гепарин, спермидин, хлорид калия и т. п., также можно добавлять в раствор для поглощения для содействия трансформации. Аналогичные методики доступны для других грибных клеток-хозяев (см., например, патенты США №№ 6022725 и 6268328, оба из которых включены посредством ссылки).

Генетически стабильные трансформанты предпочтительно конструируют с использованием векторных систем, посредством которых нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид фитазу или его фрагмент, стабильно интегрируется в хромосому штамма-хозяина. Затем трансформанты очищают с помощью известных методик.

После введения вектора экспрессии в клетки трансфицированные или трансформированные клетки культивируют в условиях, способствующих экспрессии генов под контролем промоторных последовательностей.

Обычно клетки культивируют в стандартной среде, содержащей физиологические соли и питательные вещества (см., например, Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988, и Ilmen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306). Широко используемые коммерчески производимые среды (например, бульон с солодовым экстрактом для дрожжей (YM), бульон Лурия-Бертани (LB) и декстрозный бульон Сабуро (SD)) также находят применение в настоящем изобретении.

Условия культивирования также являются стандартными (например, культуры инкубируют при примерно 28°C в соответствующей среде во встряхиваемых культурах или ферментерах до достижения требуемых уровней экспрессии фитазы). Предпочтительные условия культивирования для конкретного нитчатого гриба известны из уровня техники, и их можно найти в научной литературе и/или в источнике образцов грибов, как, например, в Американской коллекции типовых культур и Центре хранения образцов для исследований в области генетики грибов.

После того, как рост грибов установился, клетки подвергаются воздействию условий, эффективных для того, чтобы вызвать экспрессию или предоставить возможность экспрессии фитазы и, в частности, фитазы, определенной в данном документе. В случаях, в которых последовательность, кодирующая фитазу, находится под контролем индуцируемого промотора, индуцирующее средство (например, сахар, соль металла или противомикробное средство) добавляют в среду в концентрации, эффективной для индуцирования экспрессии фитазы. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, секретируемый из клеток-хозяев, может применяться при минимальном процессинге после продуцирования в качестве препарата цельного бульона.

Получение отработанного цельного ферментационного бульона с рекомбинантным микроорганизмом можно осуществлять с применением любого способа культивирования, известного из уровня техники, приводящего к экспрессии сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента.

Термин "отработанный цельный ферментационный бульон" определен в данном документе как нефракционированное содержимое ферментационного материала, которое включает культуральную среду, внеклеточные белки (например, ферменты) и клеточную биомассу. Следует понимать, что термин "отработанный цельный ферментационный бульон" также охватывает клеточную биомассу, которая была подвергнута лизису или пермеабилизации с применением способов, хорошо известных из уровня техники.

После ферментации получают ферментационный бульон, удаляют микробные клетки и различные суспендированные твердые вещества, в том числе остаточные сырьевые ферментационные материалы, посредством традиционных методик разделения с целью получения раствора фитазы. Как правило, используют фильтрацию, центрифугирование, микрофильтрацию, вакуум-фильтрацию во вращающемся барабане, ультрафильтрацию, центрифугирование с последующей ультрафильтрацией, экстракцией или хроматографией или им подобные.

Возможно необязательное извлечение требуемого белка из хозяина-продуцента. В другом аспекте надосадочную жидкость культуры, содержащую сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент, получают с применением любого из способов, известных специалистам в данной области.

Примеры этих методик включают без ограничения аффинную хроматографию (Tilbeurgh et al., (1984) FEBS Lett. 16:215), способы ионообменной хроматографии (Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36:37; Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai et al, (1984) J. Appl. Biochem. 6:336; и Ellouz et al., (1987) Chromatography 396:307), включая ионный обмен с использованием материалов с высокой разделяющей способностью (Medve et al., (1998) J. Chromatography A 808:153), хроматографию гидрофобных взаимодействий (см. Tomaz and Queiroz, (1999) J. Chromatography A 865:123); двухфазное разделение (см., Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7:287); осаждение этанолом; обращенно-фазовую HPLC, хроматографию на диоксиде кремния или на катионообменной смоле, такой как DEAE, хроматофокусирование, SDS-PAGE, осаждение сульфатом аммония и гель-фильтрацию (например, с использованием Sephadex G-75). Требуемая степень очистки будет варьироваться в зависимости от применения сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления очистка не является необходимой.

С другой стороны, может быть желательным сконцентрировать раствор, содержащий сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент, для оптимизации извлечения. Применение неконцентрированных растворов требует увеличенного времени инкубирования для сбора осадка, содержащего обогащенный или очищенный фермент. Раствор, содержащий фермент, концентрируют с применением традиционных методик концентрирования до достижения требуемого уровня фермента. Концентрирование раствора, содержащего фермент, может быть достигнуто с помощью любой из методик, обсуждаемых в данном документе. Иллюстративные способы обогащения и очистки включают без ограничения вакуум-фильтрацию во вращающемся барабане и/или ультрафильтрацию.

Кроме того, концентрирование требуемого белкового продукта можно выполнять, например, с помощью осаждающего средства, такого как осаждающее средство на основе галогенида металла. Осаждающее средство на основе галогенида металла - хлорид натрия - также можно применять в качестве консерванта. Осаждающее средство на основе галогенида металла применяют в количестве, эффективном для осаждения сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента. Выбор по меньшей мере эффективного количества и оптимального количества галогенида металла, эффективного для того, чтобы вызвать осаждение фермента, а также условий осаждения для максимального извлечения, включая время инкубирования, pH, температуру и концентрацию фермента, будет очевидным для среднего специалиста в данной области после стандартного тестирования. Как правило, к концентрированному раствору фермента добавляют от по меньшей мере приблизительно 5% вес/об. (вес/объем) до приблизительно 25% вес/об. галогенида металла, и обычно по меньшей мере 8% вес/об.

Другой альтернативный способ осаждения фермента представляет собой применение органических соединений. Примеры осаждающих средств на основе органических соединений включают: 4-гидроксибензойную кислоту, соли щелочных металлов и 4-гидроксибензойной кислоты, алкиловые сложные эфиры 4-гидроксибензойной кислоты и смеси двух или более из этих органических соединений. Добавление осаждающих средств на основе органических соединений может происходить перед добавлением, одновременно с добавлением или после добавления осаждающего средства на основе галогенида металла, причем добавление обоих осаждающих средств - органического соединения и галогенида металла - можно проводить последовательно или одновременно. Как правило, органические осаждающие средства выбраны из группы, состоящей из солей щелочных металлов и 4-гидроксибензойной кислоты, таких как соли натрия или калия, и линейных или разветвленных алкиловых сложных эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, где алкильная группа содержит от 1 до 12 атомов углерода, и смесей двух или более из этих органических соединений. Дополнительные органические соединения также включают без ограничения метиловый сложный эфир 4-гидроксибензойной кислоты (называемый метилпарабеном), пропиловый сложный эфир 4-гидроксибензойной кислоты (называемый пропилпарабеном). Дополнительные описания см., например, в патенте США № 5281526. Добавление осаждающего средства на основе органического соединения обеспечивает преимущество высокой гибкости условий осаждения в отношении pH, температуры, концентрации, осаждающего средства, концентрации белка и времени инкубирования. Как правило, к концентрированному раствору фермента добавляют по меньшей мере приблизительно 0,01% вес/об. и не более чем приблизительно 0,3% вес/об. осаждающего средства на основе органического соединения.

После периода инкубирования обогащенный или очищенный фермент затем отделяют от диссоциированного пигмента и других примесей и собирают посредством традиционных методик разделения, таких как фильтрация, центрифугирование, микрофильтрация, ротационная вакуумная фильтрация, ультрафильтрация, пресс-фильтрация, поперечная мембранная микрофильтрация, мембранная микрофильтрация в поперечном потоке и т. п. Дополнительного обогащения или очистки осадка, содержащего фермент, можно достичь путем промывания осадка водой. Например, обогащенный или очищенный осадок, содержащий фермент, промывают водой, содержащей осаждающее средство на основе галогенида металла, или водой, содержащей осаждающие средства на основе галогенида металла и органического соединения.

Иногда преимущественной является делеция генов у хозяев для экспрессии, при этом дефицит генов можно устранить посредством вектора экспрессии. В тех случаях, когда необходимо получить грибную клетку-хозяина с одним или более инактивированными генами, можно применять известные способы (например, способы, раскрытые в патенте США № 5246853, патенте США № 5475101 и WO92/06209). Инактивацию генов можно осуществлять путем полной или частичной делеции, путем инсерционной инактивации или с помощью любых других способов, в результате которых ген становится нефункциональным по своему предусмотренному назначению (так что предотвращается экспрессия геном функционального белка).

Делеции может быть подвергнут любой ген из Trichoderma sp. или другого нитчатого гриба-хозяина, который был клонирован, например, гены cbh1, cbh2, egl1 и egl2. В некоторых вариантах осуществления делецию гена можно осуществлять путем вставки формы требуемого гена, подлежащего инактивации, в плазмиду способами, известными из уровня техники. Затем делеционную плазмиду разрезают по соответствующему(соответствующим) сайту(сайтам) для рестрикционного фермента, внутреннему(внутренним) по отношению к требуемой кодирующей области гена, и кодирующую последовательность гена или ее часть заменяют селектируемым маркером. Фланкирующие последовательности ДНК из локуса гена, подлежащего делеции (предпочтительно размером от приблизительно 0,5 до 2,0 т. о.), остаются по обе стороны от маркерного гена. Подходящая делеционная плазмида обычно будет иметь уникальные сайты для рестрикционных ферментов, присутствующие в ней, для обеспечения возможности удаления фрагмента, содержащего ген, подвергнутый делеции, в том числе фланкирующих последовательностей ДНК и гена селектируемого маркера, в виде единого линейного куска.

В зависимости от используемой клетки-хозяина могут быть выполнены посттранскрипционные и/или посттрансляционные модификации. Одним из неограничивающих примеров посттранскрипционной и/или посттрансляционной модификации является "обрезание" или "усечение" полипептида. В другом случае результатом данного обрезания может быть получение зрелого полипептида фитазы и дополнительное удаление N- или С-концевых аминокислот с образованием усеченных форм фитазы, которые сохраняют ферментативную активность.

Другие примеры посттранскрипционных или посттрансляционных модификаций включают без ограничения миристоилирование, гликозилирование, усечение, липидизацию и фосфорилирование тирозина, серина или треонина. Специалисту в данной области будет понятно, что тип посттранскрипционных или посттрансляционных модификаций, которым может подвергаться белок, может зависеть от организма-хозяина, в котором экспрессируется белок.

После экспрессии могут происходить дополнительные модификации последовательностей полипептидов. Они включают без ограничения окисление, дегликозилирование, гликирование и т. д. Известно, что гликирование может влиять на активность фитазы, если она подвергается инкубированию с глюкозой или другими восстанавливающими сахарами, особенно при температурах выше 30ºC и нейтральном или щелочном pH. Для предотвращения такой модификации можно применять белковую инженерию для удаления остатков лизина. Пример ее можно найти в US 8507240. Например, экспрессия дрожжей может приводить к образованию высокогликозилированных полипептидов, что приводит к очевидному увеличению молекулярной массы. Кроме того, WO2013/119470 (включенная в данный документ посредством ссылки), имеющая дату международной публикации 15 августа 2013 года, относится к фитазам, обладающим повышенной стабильностью, которая, как полагают, является следствием повышенного гликозилирования.

Термин "гликозилирование", используемый в данном документе, относится к присоединению гликанов к молекулам, например, к белкам. Гликозилирование может представлять собой ферментативную реакцию. Образование прикрепления может происходить посредством ковалентных связей. Фраза "высокогликозилированный" относится к молекуле, такой как фермент, которая является гликозилированной по многим сайтам и по всем или почти всем доступным сайтам гликозилирования, например, сайтам N-связанного гликозилирования. В качестве альтернативы или в дополнение, фраза "высокогликозилированный" может относиться к обширному гликолитическому ветвлению (как, например, к размеру и количеству гликолитических фрагментов, ассоциированных с конкретным сайтом N-связанного гликозилирования) во всех или практически всех сайтах N-связанного гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид фитаза является гликозилированным по всем или практически всем консенсусным сайтам N-связанного гликозилирования (т. е. консенсусному сайту N-связанного гликозилирования NXS/T).

Термин "гликан", используемый в данном документе, относится к полисахариду или олигосахариду или углеводной части гликоконъюгата, такого как гликопротеин. Гликаны могут представлять собой гомо- или гетерополимеры из моносахаридных остатков. Они могут быть линейными или разветвленными молекулами.

Фитаза может характеризоваться разными степенями гликозилирования. Известно, что такое гликозилирование может улучшать стабильность при хранении и в путях применения. Обширный

Активность любого из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, может быть определена, как обсуждается выше.

Специалистам в данной области будет понятно, что ферменты представляют собой легкоразрушающиеся белки, которые всегда находятся под угрозой в жестких условиях кормозавода. Экстремальные значения температуры, давления, трения, pH и микробной активности могут приводить к разложению или разрушению ферментов, добавляемых в корм. Стресс в отношении ферментативной активности проявляется главным образом в ходе фаз обработки, представляющих собой кондиционирование и брикетирование. Например, корм поглощает большую часть своей тепловой энергии в ходе кондиционирования перед брикетированием. Однако при прохождении из кондиционера через брикетировочную пресс-форму корм также нагревается. Повышению температуры при прохождении через брикетировочную пресс-форму могут способствовать многие факторы, такие как состав корма, толщина пресс-формы, скорость движения пресс-формы, технические характеристики пресс-формы (размер и форма отверстий), начальная температура обработки, производительность брикетирования и т. д.

Таким образом, условия в ходе брикетирования кормов в промышленных масштабах могут варьироваться. Очень важна способность или устойчивость фермента выдерживать эти изменения в условиях брикетирования. Среднему специалисту в данной области будет понятно, что температуры кондиционирования могут варьироваться между разными кормозаводами. Кроме того, при определении условий, в которых проводится процесс брикетирования, необходимо учитывать местное законодательство. Например, законодательство Дании требует брикетирования кормов для домашней птицы при 81°C (Министерство продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства Дании, Датская ветеринарная и продовольственная администрация, номер журнала 2017-32-31-00378).

Кроме того, условия брикетирования при более высоких температурах могут использоваться в промышленности для повышения качества брикетов, как, например, для улучшения долговечности и уменьшения количества тонкодисперсных частиц, а также для увеличения производительности брикетировочного пресса. Следовательно, существует потребность в устойчивой фитазе, которая при включении в состав корма перед кондиционированием и брикетированием может обеспечивать получение брикетов с постоянной активностью в широком диапазоне температур выше 80°C. Это важно как для фитаз, вносимых в жидкой форме, так и для фитаз, вносимых в твердой форме, как описано в данном документе.

Факторы помимо температуры кондиционирования, которые могут влиять на фактический стресс, которому может подвергаться кормовой фермент, включают без ограничения сырьевые материалы для кормов, географическое местоположение кормозавода, используемое оборудование, размер пресс-формы, использование вспомогательных средств для брикетирования, контроль пара, контроль температуры и любые другие коммерчески значимые условия брикетирования, такие как присутствие любых других экзогенных ферментов, которые модифицируют корм таким образом, чтобы уменьшить стресс при брикетировании.

Эти факторы стресса дополнительно усугубляются тенденцией к использованию высокой температуры или суперкондиционирования, что приводит к внесению ферментов в жидкой форме, вносимой после брикетирования. Что, если бы можно было разработать устойчивый фермент, который можно было бы вносить в виде жидкости перед кондиционированием и брикетированием?

Термины "устойчивый" и "устойчивость" используются в данном документе взаимозаменяемо и означают способность сконструированной фитазы или ее фрагмента, раскрытого в данном документе, выдерживать изменения в процессах кондиционирования и брикетирования при промышленном производстве кормов. Сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты, раскрытые в данном документе как часть клады полипептидов фитаз с высокой Tm и их фрагментов, являются примерами таких устойчивых ферментов, которые можно вносить в корм в жидкой форме перед кондиционированием и брикетированием.

Другими словами, новые сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты способны выдерживать такие изменения в промышленных процессах брикетирования кормов в несоставленной, не имеющей покрытия, незащищенной форме при внесении в жидкой форме или в несоставленной, не имеющей покрытия, незащищенной твердой форме для внесения в корм перед кондиционированием и брикетированием.

Термины "жидкость", "жидкая форма" и "жидкий препарат" используются взаимозаменяемо и означают, что фермент можно вносить в жидкой форме в корм любым способом перед кондиционированием и брикетированием.

Полагают, что внесение устойчивого сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента в корм в жидкой форме является благоприятным по сравнению с внесением такой фитазы в виде гранул с покрытием. Эти гранулы с покрытием представляют собой существующий коммерческий подход к производству фитазных продуктов, подходящих для высокотемпературного кондиционирования и брикетирования. Преимущества внесения устойчивого фермента в жидкой форме включают следующие: 1) фермент начинает работать сразу после проглатывания животным, поскольку он не должен высвобождаться из гранул с покрытием, прежде чем он сможет взаимодействовать с кормом, 2) улучшается распределение фермента по всему корму, за счет чего обеспечивается более единообразная доставка фермента животному, что особенно важно для молодых животных, которые съедают небольшое количество корма, 3) равномерное распределение в корме облегчает измерение фермента в корме и 4) в случае с устойчивой фитазой, такой как сконструированный полипептид фитаза и его фрагмент, раскрытые в данном документе, она может начать разлагать фитат, уже присутствующий в корме.

Другими словами, новые сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты настолько устойчивы, что, как полагают, не требуется специального покрытия или состава для внесения их в корм перед кондиционированием и брикетированием, поскольку они были сконструированы так, чтобы выдерживать стресс при кондиционировании и брикетировании, используемых в промышленном производстве кормов. Соответственно, устойчивость новых сконструированных полипептидов фитаз и их фрагментов, описанных в данном документе, такова, что их можно вносить в виде гранул или частиц, не имеющих покрытия, или не имеющими покрытия и незащищенными при помещении в жидкость.

Следует отметить, что сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты могут быть составлены недорогостоящим образом на твердом носителе без особой потребности в защитных покрытиях и при этом поддерживать активность на протяжении всего процесса кондиционирования и брикетирования. Защитное покрытие, обеспечивающее дополнительную термостабильность при внесении в твердой форме, может быть полезным для достижения стабильности при брикетировании, если это необходимо в определенных регионах, где используются более жесткие условия, или если условия того требуют, например, как в случае с суперкондиционированием корма при температуре выше 90°C.

Раскрытые сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты были получены с применением комбинации способов и методик, известных в области белковой инженерии, которые включают филогенетический анализ, создание библиотек оценки сайтов, создание комбинаторных библиотек, высокопроизводительный скрининг и статистический анализ.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к сконструированному полипептиду фитазе или также к его фрагменту, который характеризуется по меньшей мере 82% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.

Специалистам в данной области будет понятно, что такая по меньшей мере 82% идентичность последовательностей также включает 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Специалистам в данной области будет понятно, что по меньшей мере 79% идентичность последовательностей также включает 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Также можно упомянуть следующее, заключающееся в том, что в некоторых вариантах осуществления предусмотрены:

а) сконструированный полипептид фитаза или также его фрагмент, который характеризуется по меньшей мере 81% (такой как 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2, 3, 8, 10, 12, 18, 19, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, и/или 36;

b) сконструированный полипептид фитаза или также его фрагмент, который характеризуется по меньшей мере 82% (такой как 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 15, 17, 21, 25, 34, и/или 35;

с) сконструированный полипептид фитаза или также его фрагмент, который характеризуется по меньшей мере 83% (такой как 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 13;

d) сконструированный полипептид фитаза или также его фрагмент, который характеризуется по меньшей мере 79% (такой как 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6, 22 и/или 64; и/или

e) сконструированный полипептид фитаза или также его фрагмент, который характеризуется по меньшей мере 80% (такой как 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 16, 20, 23, 29 и/или 37.

В дополнительных аспектах полипептид содержит сердцевинный домен сконструированного полипептида фитазы или представляет собой фрагмент, являющийся сердцевинным доменом сконструированного полипептида фитазы. "Фрагмент, являющийся сердцевинным доменом" в данном документе определяется как полипептид, в котором одна или более аминокислот удалены с амино- и/или карбоксильного конца полипептида. Используемая в данном документе фраза "сердцевинный домен" относится к области полипептида, охватывающей аминокислоты, необходимые для поддержания структуры и функции (как, например, гидролиза фитиновой кислоты) полипептида. Аминокислоты в сердцевинном домене можно дополнительно модифицировать для улучшения термостабильности или каталитической активности в различных условиях, таких как без ограничения pH. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления сердцевинный домен сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, соответствует положениям аминокислот 14-325 в SEQ ID NO: 1. В других неограничивающих вариантах осуществления сердцевинный домен соответствует положениям аминокислот 13-326, 12-327, 11-328, 10-329, 9-330, 8-331, 7-332, 6-333, 5-334, 4-335, 3-336, 2-337, или 1-338 в SEQ ID NO: 1. В других вариантах осуществления N-конец сердцевинного домена соответствует положению аминокислоты 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или 25 в SEQ ID NO: 1, а С-конец сердцевинного домена соответствует положению аминокислоты 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, или 413 в SEQ ID NO: 1.

Соответственно, в данном документе также предусмотрены:

f) сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, который характеризуется по меньшей мере 78% (такой как 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотами 14-325 из SEQ ID NO: 6 и/или 64, где указанные положения аминокислот соответствуют положениям аминокислот в SEQ ID NO: 1;

g) сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, который характеризуется по меньшей мере 79% (такой как 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотами 14-325 из SEQ ID NO: 2, 8, 27 и/или 37, где указанные положения аминокислот соответствуют положениям аминокислот в SEQ ID NO: 1;

h) сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, который характеризуется по меньшей мере 81% (такой как 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотами 14-325 из SEQ ID NO: 3, 10, 12, 18, 25, 26, 28, 30, 32, 35, 65, 70 и/или 86, где указанные положения аминокислот соответствуют положениям аминокислот в SEQ ID NO: 1;

i) сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, который характеризуется по меньшей мере 82% (такой как 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотами 14-325 из SEQ ID NO:1, 4, 5, 7, 9, 11, 13-17, 21, 22, 31, 33, 34, 36, 64, 66-69, и/или 71-84, где указанные положения аминокислот соответствуют положениям аминокислот в SEQ ID NO: 1;

j) сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, который характеризуется по меньшей мере 83% (такой как 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотами 14-325 из SEQ ID NO: 19, 20, 23 и/или 24, где указанные положения аминокислот соответствуют положениям аминокислот в SEQ ID NO: 1; и/или

k) сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, который характеризуется по меньшей мере 84% (такой как 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичностью последовательности с аминокислотами 14-325 из SEQ ID NO: 29, где указанные положения аминокислот соответствуют положениям аминокислот в SEQ ID NO: 1.

В еще одном аспекте сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты, характеризующиеся по меньшей мере 82% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1, также могут иметь аминокислотную последовательность, которая имеет балл согласно скрытой марковской модели (HMM), составляющий по меньшей мере приблизительно 1200 (как, например, по меньшей мере приблизительно 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750 или 1800), как представлено в таблице 11 для полипептидов из клады фитаз с высокой Tm.

В еще нескольких других аспектах любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, может содержать одну или более конкретных аминокислотных замен в одном или более положениях в его полипептидной последовательности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты, содержащие одну или более (как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из 30(L, I), 37Y, 45P, 89T, 182R, 194M, 195F, 202S, 228Y, 256H, 261H и 298V, где положения соответствуют нумерации в SEQ ID NO: 1 или 57.

Кроме того или в дополнение, любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов может содержать одну или более (как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11) аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из 3T, 6S, 9Q, 73I, 76K, 78S, 118Q, 123A, 130V, 163P, 186D, 187K, 209A, 284S, 288A, 289R, 337V, 345A и 347K, где положения соответствуют нумерации в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид фитаза выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, и SEQ ID NO:87.

Сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты, содержащие одну или более аминокислотных замен, могут проявлять одно или более улучшенных или усиленных свойств, таких как, без ограничения, улучшенная термостабильность (как, например, любое из приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% или большего (включая все процентные значения, находящиеся между этими значений) улучшения термостабильности) или улучшенная активность (например, улучшенная удельная активность и/или активность при pH 3,5 по сравнению с активностью при pH 5,5) (как, например, любое из приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% или большего (включая все процентные значения, находящиеся между этими значениями) улучшения активности) по сравнению с полипептидами фитазами или их фрагментами, которые не содержат указанные одну или более аминокислотных замен.

В еще некоторых других аспектах любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, может иметь одну или более замен (таких как одна или более замен, раскрытых выше), которые увеличивают соотношение между активностью (например, удельной активностью) фитазы при pH 3,5 по сравнению с pH 5,5. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, характеризуется соотношением активности (например, удельной активности) при pH 3,5 по сравнению с активностью (например, удельной активностью) при pH 5,5, которое больше или равняется приблизительно 1,2 (как, например, любым из приблизительно 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0 или выше).

Также описан сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, характеризующийся выходом в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере 50% при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста выхода в корме при брикетировании. Кроме того, сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, характеризующийся выходом в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере 50%, как описано в данном документе, также может характеризоваться по меньшей мере 82% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1.

Выход в корме при брикетировании может иметь любое значение в диапазоне от приблизительно 50% до приблизительно 100%, в частности, составлять приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%..

В некоторых вариантах осуществления сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент характеризуется выходом в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 70%, 85%, 90%, 95% или 99% при внесении в виде твердого вещества при 95°C.

Специалистам в данной области будет понятно, что показатели выхода в корме при брикетировании могут варьироваться в зависимости от типа используемого корма, используемых условий кондиционирования и брикетирования, например, температуры и содержания влаги, анализа, используемого для определения активности, и т. д.

Любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, характеризуется соотношением показателей выхода в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере 0,7 при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста в корме при брикетировании. Это соотношение включает приблизительно 0,7, 0,8, 0,9, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 и 0,99.

В другом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, характеризующийся соотношением показателей выхода в корме при брикетировании при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд, составляющим по меньшей мере приблизительно 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0,4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0 по сравнению с а) SEQ ID NO: 60; b) SEQ ID NO: 60 с заменами A25F и G157R; в) SEQ ID NO: 104 и/или d) аминокислотами 22-431 из SEQ ID NO: 104.

В другом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, характеризующийся коэффициентом соотношения показателей выхода в корме при брикетировании при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд, составляющим по меньшей мере приблизительно 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0,4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0 по сравнению с а) SEQ ID NO: 60; b) SEQ ID NO: 60 с заменами A25F и G157R; в) SEQ ID NO: 104 и/или d) аминокислотами 22-431 из SEQ ID NO: 104.

Любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, может дополнительно характеризоваться температурой T_m, составляющей по меньшей мере приблизительно 92,5°C, приблизительно 93°C, приблизительно 94°C, приблизительно 95°C, приблизительно 96°C, приблизительно 97°C, приблизительно 98°C, приблизительно 99°C, приблизительно 100°C или приблизительно 101°C, при использовании условий анализа методом дифференциальной сканирующей калориметрии, описанных в примере 3, и результаты представлены в примере 4.

В другом варианте осуществления раскрыт сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, характеризующийся соотношением температур Tm, составляющим по меньшей мере приблизительно 1,08, 1,10, 1,12, 1,14, 1,16, 1,18 или 1,20, 2,1, 2,4, 2,7, 3,0 или 3,3, измеренным с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, по сравнению с а) SEQ ID NO: 60; b) SEQ ID NO: 60 с заменами A25F и G157R; в) SEQ ID NO: 104 и/или d) аминокислотами 22-431 из SEQ ID NO: 104.

В другом аспекте любой из сконструированных полипептидов или их фрагментов, раскрытых в данном документе, обладает удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 100 ед/мг при pH 3,5, в условиях анализа, таких как описанные в примере 4. Диапазон удельной активности (ед/мг при pH 3,5) включает без ограничения приблизительно 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 2000 и т. д.

В другом аспекте некоторые из сконструированных полипептидов или их фрагментов, раскрытых в данном документе, обладают удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 100 ед/мг при pH 5,5, в условиях анализа, таких как описанные в примере 4. Диапазон удельной активности (ед/мг при pH 5,5) включает без ограничения приблизительно 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 2000 и т. д.

В еще одном аспекте любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, может быть стабильным в жидкой форме при pH, составляющем приблизительно 3,0 или меньше. Это имеет большое значение, когда сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты, описанные в данном документе, проходят через пищеварительный тракт животного, как обсуждается ниже.

В другом варианте осуществления описан корм для животных, кормовой продукт, композиция на основе кормовых добавок или премикс, содержащие любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, описанных в данном документе.

Важно отметить, что ферменты кормовых добавок, например фитаза, подвергаются очень жестким условиям при прохождении через пищеварительный тракт животного, т. е. находятся в условиях низкого pH и присутствия пищеварительных ферментов. Пепсин представляет собой один из важнейших протеолитических пищеварительных ферментов, присутствующих в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных. Пепсин характеризуется низкой специфичностью и высокой выносливостью к pH в кислой области (pH 1,5-6,0, стабильный до pH 8,0 включительно). Сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты, описанные в данном документе, в значительной степени устойчивы к пепсину, что необходимо для хорошего функционирования in vivo.

Корм для животных, кормовой продукт, композицию на основе кормовых добавок или премикс, содержащие любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, описанных в данном документе, можно применять (i) в отдельности, или (ii) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, или (iii) с по меньшей мере одним другим ферментом, или (iv) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, и по меньшей мере одним другим ферментом, или (v) согласно любому из (i), (ii), (iii) или (iv) с дополнительным включением по меньшей мере одного другого компонента, представляющего собой кормовую добавку, и при этом сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент необязательно присутствует в количестве, составляющем по меньшей мере 0,1 г/тонна корма.

Термины "кормовая добавка", "компоненты, представляющие собой кормовые добавки" и/или "ингредиенты, представляющие собой кормовые добавки" используются в данном документе взаимозаменяемо.

Кормовые добавки можно описать как продукты, применяемые в питании животных с целью улучшения качества кормов и качества пищи животного происхождения или для улучшения продуктивности и здоровья животных, например, обеспечения повышенной усвояемости кормовых материалов.

Кормовые добавки делятся на ряд категорий, таких как сенсорные добавки, которые стимулируют аппетит животных, так что они естественным образом хотят есть больше. Пищевые добавки предоставляют определенные питательные вещества, которых может не хватать в рационе животного. Зоотехнические добавки улучшают общую питательную ценность рациона животного благодаря добавкам в корме.

Примеры таких кормовых добавок включают без ограничения пребиотики, эфирные масла (такие как, без ограничения, тимол и/или коричный альдегид), жирные кислоты, короткоцепочечные жирные кислоты, такие как пропионовая кислота и масляная кислота и т. д., витамины, минеральные вещества, аминокислоты и т. д.

Композиции или составы на основе кормовых добавок могут также содержать по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из белка, пептида, сахарозы, лактозы, сорбита, глицерина, пропиленгликоля, хлорида натрия, сульфата натрия, ацетата натрия, цитрата натрия, формиата натрия, сорбата натрия, хлорида калия, сульфата калия, ацетата калия, цитрата калия, формиата калия, ацетата калия, сорбата калия, хлорида магния, сульфата магния, ацетата магния, цитрата магния, формиата магния, сорбата магния, метабисульфита натрия, метилпарабена и пропилпарабена.

В композиции или составы на основе кормовых добавок, раскрытые в данном документе, может быть включен по меньшей мере один другой фермент (т. е. в дополнение к любому из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе), который может включать в себя без ограничения ксиланазу, амилазу, другую фитазу, бета-глюканазу и/или протеазу.

"Кcиланаза" является названием, данным классу ферментов, которые разлагают линейный полисахарид β-1,4-ксилан до ксилозы, разрушая за счет этого гемицеллюлозу, являющуюся одним из основных компонентов клеточных стенок растений. Ксиланазы, например, эндо-β-ксиланазы (EC 3.2.1.8), гидролизуют основную цепь ксилана.

В одном варианте осуществления ксиланаза может представлять собой любую коммерчески доступную ксиланазу. В подходящем случае ксиланаза может представлять собой эндо-1,4-P-d-ксиланазу (классифицированную как E.G. 3.2.1.8) или 1,4-β-ксилозидазу (классифицированную как E.G. 3.2.1.37). В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, в комбинации с эндоксиланазой, например, эндо-1,4-P-d-ксиланазой, и другим ферментом. Все классификации ферментов согласно E.C., упомянутые в данном документе, относятся к классификациям, приведенным в Номенклатуре ферментов - Рекомендациях (1992) комиссии по номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии - ISBN 0-12-226164-3, которая включена в данный документ.

В другом варианте осуществления ксиланаза может представлять собой ксиланазу из Bacillus, Trichoderma, Thermomyces, Aspergillus, Humicola и Penicillium. В еще одном варианте осуществления ксиланаза может представлять собой ксиланазу из Axtra XAP® или Avizyme 1502® - продуктов, оба из которых являются коммерчески доступными от Danisco A/S. В одном варианте осуществления ксиланаза может представлять собой смесь двух или более ксиланаз. В еще одном варианте осуществления ксиланаза представляет собой эндо-1,4-β-ксиланазу или 1,4-β-ксилозидазу.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, и ксиланазу. В одном варианте осуществления композиция содержит 10-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750 и более 750 ксиланазных единиц/г композиции.

В одном варианте осуществления композиция содержит 500-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 6000-6500, 6500-7000, 7000-7500, 7500-8000 и более 8000 ксиланазных единиц/г композиции.

Следует понимать, что одна ксиланазная единица (XU) представляет собой количество фермента, которое приводит к высвобождению 0,5 мкмоль эквивалентов восстанавливающих сахаров (в виде ксилозы по методу анализа с использованием динитросалициловой кислоты (DNS) для восстанавливающих сахаров) из субстрата, представляющего собой ксилан овса и спельты, в минуту при pH 5,3 и 50°C (Bailey, et al., Journal of Biotechnology, Volume 23, (3), May 1992, 257-270).

Амилаза представляет собой класс ферментов, способных гидролизовать крахмал до олигосахаридов с более короткой цепью, таких как мальтоза. Глюкозный фрагмент в этом случае можно легче перенести от мальтозы к моноглицериду или гликозилмоноглицериду, чем от исходной молекулы крахмала. Термин "амилаза" включает α-амилазы (E.G. 3.2.1.1), G4-образующие амилазы (E.G. 3.2.1.60), β-амилазы (E.G. 3.2.1.2) и γ-амилазы (E.C. 3.2.1.3). Амилазы могут иметь бактериальное или грибное происхождение или представлять собой химически модифицированные или полученные методами белковой инженерии мутантные формы.

В одном варианте осуществления амилаза может представлять собой смесь двух или более амилаз. В другом варианте осуществления амилаза может представлять собой амилазу, например, α-амилазу, из Bacillus licheniformis и амилазу, например, α-амилазу, из Bacillus amyloliquefaciens. В одном варианте осуществления α-амилаза может представлять собой α-амилазу из Axtra XAP® или Avizyme 1502® - продуктов, оба из которых являются коммерчески доступными от Danisco A/S. В еще одном варианте осуществления амилаза может представлять собой устойчивую к пепсину α-амилазу, такую как устойчивая к пепсину альфа-амилаза Trichoderma (такой как Trichoderma reesei). Подходящая устойчивая к пепсину α-амилаза изложена в заявке на патент Великобритании № 1011513.7 (которая включена в данный документ посредством ссылки) и PCT/IB2011/053018 (которая включена в данный документ посредством ссылки).

Следует понимать, что одна амилазная единица (AU) представляет собой количество фермента, которое приводит к высвобождению 1 ммоль глюкозидных связей из субстрата, представляющего собой нерастворимый в воде сшитый полимерный крахмал, в минуту при pH 6,5 и 37°C (это может называться в данном документе анализом для определения 1 AU).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, и амилазу. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, ксиланазу и амилазу. В одном варианте осуществления композиция содержит 10-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750 и более 750 амилазных единиц/г композиции.

В одном варианте осуществления композиция содержит 500-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 6000-6500, 6500-7000, 7000-7500, 7500-8000, 8000-8500, 8500-9000, 9000-9500, 9500-10000, 10000-11000, 11000-12000, 12000-13000, 13000-14000, 14000-15000 и более 15000 амилазных единиц/г композиции.

Термин "протеаза", используемый в данном документе, является синонимом пептидазы или протеиназы. Протеаза может представлять собой субтилизин (E.G. 3.4.21.62), или бациллолизин (E.G. 3.4.24.28), или щелочную сериновую протеазу (E.G. 3.4.21.x), или кератиназу (E.G. 3.4.X.X). В одном варианте осуществления протеаза представляет собой субтилизин. Подходящие протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения.

Также подходящими являются химически модифицированные или полученные методами белковой инженерии мутантные формы. Протеаза может представлять собой сериновую протеазу или металлопротеазу, например, щелочную микробную протеазу или трипсиноподобную протеазу. В одном варианте осуществления в данном документе предусмотрены композиции, содержащие любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, и одну или более протеаз.

Примерами щелочных протеаз являются субтилизины, особенно полученные из Bacillus sp., например, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309 (см., например, патент США № № 6287841), субтилизин 147 и субтилизин 168 (см., например, WO 89/06279). Примерами трипсиноподобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеазы Fusarium (см., например, WO 89/06270 и WO 94/25583). Примеры применимых протеаз также включают без ограничения варианты, описанные в WO 92/19729 и WO 98/20115.

В одном варианте осуществления протеаза выбрана из группы, состоящей из субтилизина, бациллолизина, щелочной сериновой протеазы, кератиназы и протеазы Nocardiopsis.

Следует понимать, что одна протеазная единица (PU) представляет собой количество фермента, которое приводит к высвобождению из субстрата (0,6% раствора казеина) одного микрограмма фенольного соединения (выраженного в тирозиновых эквивалентах) за одну минуту при pH 7,5 (40 мМ буфера на основе Na₂PO₄/молочной кислоты) и 40°C. Это может называться анализом для определения 1 PU.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, и протеазу. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, а также ксиланазу и протеазу. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, а также амилазу и протеазу. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, раскрытых в данном документе, а также ксиланазу, амилазу и протеазу.

В одном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 10-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750 и более 750 протеазных единиц/г композиции.

В одном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 500-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5000-5500, 5500-6000, 6000-6500, 6500-7000, 7000-7500, 7500-8000, 8000-8500, 8500-9000, 9000-9500, 9500-10000, 10000-11000, 11000-12000, 12000-13000, 13000-14000, 14000-15000 и более 15000 протеазных единиц/г композиции.

По меньшей мере один пробиотик (DFM) может содержать по меньшей мере один жизнеспособный микроорганизм, такой как жизнеспособный бактериальный штамм, или жизнеспособные дрожжи, или жизнеспособные грибы. DFM предпочтительно содержит по меньшей мере одну жизнеспособную бактерию.

Возможно, что DFM может представлять собой спорообразующий бактериальный штамм, и, таким образом, термин "DFM" может включать или предусматривать споры, например, споры бактерий. Таким образом, используемый в данном документе термин "жизнеспособный микроорганизм" может включать споры микроорганизмов, такие как эндоспоры или конидии. В качестве альтернативы DFM в композиции на основе кормовых добавок, описанной в данном документе, может не состоять из спор микроорганизмов, например, эндоспор или конидий, или может не содержать их.

Микроорганизм может представлять собой встречающийся в природе микроорганизм, или он может представлять собой трансформированный микроорганизм.

Описанный в данном документе DFM может содержать микроорганизмы из одного или более следующих родов: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium и Megasphaera и их комбинаций.

DFM предпочтительно содержит один или более бактериальных штаммов, выбранных из следующих Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Род "Bacillus", как используется в данном документе, включает все виды в роде "Bacillus", известные специалистам в данной области, в том числе без ограничения B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis и B. thuringiensis Следует понимать, что род Bacillus продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что этот род включает виды, которые были переклассифицированы, в том числе без ограничения такие организмы, как Bacillus stearothermophilus, который в настоящее время называется "Geobacillus stearothermophilus", или Bacillus polymyxa, который в настоящее время называется "Paenibacillus polymyxa". Образование устойчивых эндоспор в стрессовых условиях окружающей среды считается определяющим признаком рода Bacillus, хотя эта характеристика также присуща недавно получившим название Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, и Virgibacillus.

В другом аспекте DFM можно дополнительно объединить со следующими Lactococcus spp: Lactococcus cremoris и Lactococcus lactis и их комбинациями.

DFM можно дополнительно объединить со следующими Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus jensenii, а также комбинациями любых из них.

В еще одном аспекте DFM можно дополнительно объединить со следующими Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, и Bifidobacterium angulatum, а также комбинациями любых из них.

Можно упомянуть бактерии из следующих видов: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, Enterococcus , Enterococcus spp, и Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp и их комбинации.

Пробиотик, описанный в данном документе, содержащий один или более бактериальных штаммов, может относиться к одному и тому же типу (роду, виду и штамму) или может содержать смесь родов, видов и/или штаммов.

В альтернативном случае DFM можно объединить с одним или более продуктами или микроорганизмами, содержащимися в данных продуктах, раскрытыми в WO2012110778 и обобщенно представленными следующим образом: Bacillus subtilis, штамм 2084, № доступа в NRRL B-50013; Bacillus subtilis, штамм LSSAO1, № доступа в NRRL B-50104, и Bacillus subtilis, штамм 15A-P4, № доступа в ATCC PTA-6507 (из Enviva Pro® (ранее известного как Avicorr®); Bacillus subtilis, штамм C3102 (из Calsporin®); Bacillus subtilis, штамм PB6 (из Clostat®); Bacillus pumilis (8G-134); Enterococcus NCIMB 10415 (SF68) (из Cylactin®); Bacillus subtilis, штамм C3102 (из GalliPro® и GalliProMax®); Bacillus licheniformis (из GalliPro®Tect®); Enterococcus и Pediococcus (из PoultryStar®); Lactobacillus, Bifidobacterium и/или Enterococcus (из Protexin®); Bacillus subtilis, штамм QST 713 (из Proflora®); Bacillus amyloliquefaciens CECT-5940 (из Ecobiol® и Ecobiol® Plus); Enterococcus faecium SF68 (из FortiFlora®); Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (из BioPlus2B®); молочнокислые бактерии 7 Enterococcus faecium (из Lactiferm®); штамм Bacillus (из CSI®); Saccharomyces cerevisiae (из Yea-Sacc®); Enterococcus (из Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius (из Biomin C5®); Lactobacillus farciminis (из Biacton®); Enterococcus (из Oralin E1707®); Enterococcus (2 штамма), Lactococcus lactis DSM 1103 (из пробиотического средства Pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus farciminis (из Sorbiflore®); Bacillus subtilis (из Animavit®); Enterococcus (из Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (из Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (из Levucell SC 0 и SC10® ME); Pediococcus acidilactici (из Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (из ActiSaf® (ранее BioSaf®)); Saccharomyces cerevisiae NCYC Sc47 (из ActiSaf® SC47); Clostridium butyricum (из Miya-Gold®); Enterococcus (из Fecinor и Fecinor Plus®); Saccharomyces cerevisiae NCYC R-625 (из InteSwine®); Saccharomyces cerevisiae (из BioSprint®); Enterococcus и Lactobacillus rhamnosus (из Provita®); Bacillus subtilis и Aspergillus oryzae (из PepSoyGen-C®); Bacillus cereus (из Toyocerin®); Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012 (из TOYOCERIN®) или другие DFM, такие как Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis (из BioPlus® YC) и Bacillus subtilis (из GalliPro®).

DFM можно объединить с Enviva® PRO, который является коммерчески доступным от Danisco A/S. Enviva Pro® представляет собой комбинацию штамма Bacillus 2084, № доступа в NRRL B-50013, штамма Bacillus LSSAO1, № доступа в NRRL B-50104, и штамма Bacillus 15A-P4, № доступа в ATCC PTA-6507 (как изложено в US 7754469 B, включенном в данный документ посредством ссылки).

Также можно объединить DFM, описанный в данном документе, с дрожжами из рода Saccharomyces spp.

DFM, описанный в данном документе, предпочтительно содержит микроорганизмы, которые в целом признаны безопасными (GRAS) и предпочтительно имеют подтвержденный статус GRAS.

Специалист в данной области без труда ознакомится с конкретными видами и/или штаммами микроорганизмов из родов, описанных в данном документе, которые применяются в пищевой и/или сельскохозяйственной отраслях промышленности и которые в целом считаются подходящими для потребления животными.

В некоторых вариантах осуществления важно, чтобы DFM был выносливым к нагреванию, т. е. являлся термостойким. Особенно это касается случаев, когда корм является брикетированным. Таким образом, в другом варианте осуществления DFM может представлять собой термостойкий микроорганизм, такой как термостойкие бактерии, в том числе, например, Bacillus spp.

В других аспектах может быть желательно, чтобы DFM содержал спорообразующие бактерии, такие как Bacilli, например, Bacillus spp. Бациллы способны образовывать стабильные эндоспоры, когда условия для роста неблагоприятны, и они являются очень устойчивыми к нагреванию, pH, влажности и дезинфицирующим средствам.

DFM, описанный в данном документе, может обеспечивать уменьшение или предупреждение заселения кишечника патогенными микроорганизмами (такими как Clostridium perfringens, и/или E. coli, и/или Salmonella spp, и/или Campylobacter spp.). Другими словами, DFM может являться антипатогенным. Используемый в данном документе термин "антипатогенный" означает, что DFM противодействует эффекту (отрицательному эффекту) патогена.

Как описано выше, DFM может представлять собой любой подходящий DFM. Например, следующий анализ, "анализ DFM", можно применять для определения того, подходит ли микроорганизм для того, чтобы быть DFM. Анализ DFM, применяемый в данном документе, более подробно объясняется в US2009/0280090. Во избежание сомнений, DFM, выбранный в качестве ингибирующего штамма (или антипатогенного DFM) в соответствии с "анализом DFM", изложенным в данном документе, является подходящим DFM для применения в соответствии с настоящим изобретением, т. е. в композиции на основе кормовых добавок в соответствии с настоящим изобретением.

Каждую пробирку засевали иллюстративным патогеном (например, бактериями) из иллюстративного кластера.

Надосадочную жидкость культуры потенциального DFM, выращиваемого в аэробных или анаэробных условиях, добавляют в засеянные пробирки (за исключением контроля, к которому не добавляют надосадочную жидкость) и инкубируют. После инкубирования измеряют оптическую плотность (OD) контрольных и обработанных надосадочной жидкостью пробирок для каждого патогена.

Колонии штаммов (потенциальных DFM), которые давали пониженную OD по сравнению с контролем (который не содержал какой-либо надосадочной жидкости), можно, таким образом, классифицировать как ингибирующий штамм (или антипатогенный DFM). Таким образом, анализ DFM, применяемый в данном документе, более подробно объясняется в US2009/0280090.

Иллюстративный патоген, используемый в данном анализе DFM, предпочтительно может представлять собой один (или более) из следующих: Clostridium, такой как Clostridium perfringens и/или Clostridium difficile, и/или E. coli, и/или Salmonella spp., и/или Campylobacter spp. В одном предпочтительном варианте осуществления анализ проводят с одним или более из Clostridium perfringens, и/или Clostridium difficile, и/или E. coli, предпочтительно Clostridium perfringens и/или Clostridium difficile, более предпочтительно Clostridium perfringens.

Антипатогенные DFM содержат одну или более из следующих бактерий и описаны в WO2013029013:

Bacillus subtilis , штамм 3BP5, № доступа в NRRL B-50510,

Bacillus amyloliquefaciens, штамм 918 из ATCC, № доступа в NRRL B-50508, и

Bacillus amyloliquefaciens, штамм 1013 из ATCC, № доступа в NRRL B-50509.

DFM можно получать в виде культуры(культур) и носителя(носителей) (в случаях, где это применимо) и можно вносить в ленточную или лопастную мешалку и смешивать в течение приблизительно 15 минут, хотя временные рамки можно увеличивать или уменьшать. Компоненты смешивают таким образом, что в результате образуется однородная смесь культур и носителей. Конечный продукт предпочтительно представляет собой сухой сыпучий порошок. DFM, содержащие один или более бактериальных штаммов, можно затем добавлять в корм для животных или кормовой премикс, добавлять в воду для животных или вводить другими способами, известными из уровня техники (предпочтительно одновременно с ферментами, описанными в данном документе).

Включение отдельных штаммов в смесь DFM может осуществляться в долях, варьирующих от 1% до 99% и предпочтительно от 25% до 75%.

Подходящие дозировки DFM в корме для животных могут варьироваться от приблизительно 1×10³ КОЕ/г корма до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г корма, в подходящем случае от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г корма до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г корма, в подходящем случае от приблизительно 7,5×10⁴ КОЕ/г корма до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г корма.

В другом аспекте DFM можно добавлять в кормовой продукт в дозе, составляющей более чем приблизительно 1×10³ КОЕ/г корма, в подходящем случае более чем приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г корма, в подходящем случае более чем приблизительно 5×10⁴ КОЕ/г корма или в подходящем случае более чем приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г корма.

DFM можно добавлять в композицию на основе кормовых добавок в дозе, составляющей от приблизительно 1×10³ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹³ КОЕ/г композиции, предпочтительно от 1×10⁵ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹³ КОЕ/г композиции, более предпочтительно от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г композиции и наиболее предпочтительно от приблизительно 3,75×10⁷ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г композиции. В другом аспекте DFM можно добавлять в композицию на основе кормовых добавок в дозе, составляющей более чем приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г композиции, предпочтительно более чем приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г композиции и наиболее предпочтительно более чем приблизительно 3,75×10⁷ КОЕ/г композиции. В одном варианте осуществления DFM добавляют в композицию на основе кормовых добавок в дозе, составляющей более чем приблизительно 2×10⁵ КОЕ/г композиции, в подходящем случае более чем приблизительно 2×10⁶ КОЕ/г композиции, в подходящем случае более чем приблизительно 3,75×10⁷ КОЕ/г композиции.

В еще одном аспекте раскрыта гранулированная композиция на основе кормовых добавок для применения в кормах для животных, содержащая по меньшей мере один полипептид, обладающий фитазной активностью, как описано в данном документе, применяемый в отдельности, либо в комбинации с по меньшей мере одним пробиотиком, либо в комбинации с по меньшей мере одним другим ферментом, либо в комбинации с по меньшей мере одним пробиотиком и по меньшей мере одним другим ферментом, где композиция на основе кормовых добавок может быть представлена в любой форме, такой как гранулированная частица. Такие гранулированные частницы могут быть получены с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из грануляции с высоким усилием сдвига, грануляции в барабане, экструзии, сферонизации, агломерации в псевдоожиженном слое, нанесения покрытия распылением в псевдоожиженном слое, распылительной сушки, сублимационной сушки, приллирования, охлаждения распылением, пульверизации с помощью вращающегося диска, коацервации, таблетирования или любой комбинации вышеуказанных способов.

Кроме того, частицы гранулированной композиции на основе кормовых добавок могут иметь средний диаметр, составляющий более 50 микронов и менее 2000 микронов.

Специалистам в данной области будет понятно, что корм для животных может включать растительный материал, такой как кукуруза, пшеница, сорго, соя, канола, подсолнечник или смеси любых из этих растительных материалов, или источники растительных белков для домашней птицы, свиней, жвачных животных, аквакультуры и животных-компаньонов. Предполагается, что будут улучшены параметры продуктивности животных, такие как рост, потребление корма и эффективность использования корма, а также улучшена его однородность, снижена концентрация аммиака в помещении для животных и, следовательно, улучшено благополучие и состояние здоровья животных.

Таким образом, раскрыт способ улучшения питательной ценности корма для животных, где любую из сконструированных фитаз или их фрагментов, описанных в данном документе, можно добавлять в корм для животных.

Фраза "эффективное количество", используемая в данном документе, относится к количеству действующего вещества (такого как фитаза, например, любая из сконструированных полипептидов фитаз, раскрытых в данном документе), необходимого для обеспечения улучшения продуктивности животного по одному или более показателям, в отдельности либо в комбинации с одним или более другими действующими веществами (такими как, без ограничения, один или более дополнительных ферментов, один или более DFM, одно или более эфирных масел и т. д.).

Термин "продуктивность животного", используемый в данном документе, может определяться любым показателем, таким как без ограничения эффективность использования корма, и/или прирост веса животного, и/или коэффициент конверсии корма, и/или усвояемость питательных веществ в корме (например, усвояемость аминокислот или усвояемость фосфора), и/или содержание усваиваемой энергии или метаболизируемой энергии в корме, и/или удержание азота, и/или способность животных избегать отрицательных эффектов заболеваний, или иммунный ответ субъекта.

Характеристики продуктивности животных могут включать без ограничения вес тела; прирост веса; массу; процентное содержание жира в организме; высоту; распределение жира в организме; рост; скорость роста; размер яиц; вес яиц; массу яиц; яйценоскость; всасывание минеральных веществ; выведение минеральных веществ, удержание минеральных веществ; плотность костей; прочность костей; коэффициент конверсии корма (FCR); среднесуточное потребление корма (ADFI); среднесуточный прирост (ADG), удержание и/или секрецию любого одного или более из меди, натрия, фосфора, азота и кальция; удержание или всасывание аминокислот; минерализацию, минерализацию костей, выход туши и качество туши.

Под "улучшенной продуктивностью животного по одному или более показателям" подразумевается, что наблюдается увеличенная эффективность использования корма, и/или увеличенный прирост веса, и/или сниженный коэффициент конверсии корма, и/или улучшенная усвояемость питательных веществ или энергии в корме, и/или улучшенное удержание азота, и/или улучшенная способность избегать отрицательных эффектов некротического энтерита, и/или улучшенный иммунный ответ у субъекта в результате применения корма, содержащего композицию на основе кормовых добавок, описанную в данном документе, по сравнению с кормом, который не содержит указанную композицию на основе кормовых добавок.

Под "улучшенной продуктивностью животного" предпочтительно подразумевается, что имеет место увеличенная эффективность использования корма, и/или увеличенный прирост веса, и/или сниженный коэффициент конверсии корма. Используемый в данном документе термин "эффективность использования корма" относится к величине прироста веса у животного, которая имеет место, когда животное кормится неограниченно или поедает определенное количество пищи в течение определенного периода времени. "Улучшение показателя" или "улучшенный показатель", как используется в данном документе, относится к улучшению по меньшей мере одного из параметров, перечисленных под показателями в определении животного.

Под "увеличенной эффективностью использования корма" подразумевается, что применение композиции на основе кормовых добавок согласно настоящему изобретению в корме приводит к увеличению прироста веса на единицу потребляемого корма по сравнению с животным, кормящимся при отсутствии указанной композиции на основе кормовых добавок.

Используемый в данном документе термин "коэффициент конверсии корма" относится к количеству корма, cкармливаемого животному для увеличения веса животного на определенную величину.

Улучшенный коэффициент конверсии корма означает более низкий коэффициент конверсии корма.

Под "более низким коэффициентом конверсии корма" или "улучшенным коэффициентом конверсии корма" подразумевается, что применение композиции на основе кормовых добавок в корме приводит к тому, что для скармливания животному для увеличения веса животного на определенную величину требуется меньшее количество корма по сравнению с количеством корма, которое требуется для увеличения веса животного на ту же величину в случае, если корм не содержит указанной композиции на основе кормовых добавок.

Улучшение параметров продуктивности может наблюдаться по отношению к контролю, в котором применяемый корм не содержит фитазу.

Термин "определение содержания золы в большеберцовой кости" относится к способу количественной оценки минерализации костей. Этот параметр указывает на то, имеет ли место дефицит фосфора (например, его содержание должно быть низким в рационах отрицательного контроля с дефицитом фосфора) или он находится в достаточном количестве (например, содержание в образцах, обработанных фитазой, сопоставимо с рационами положительного контроля, которые удовлетворяют потребности в фосфоре у бройлеров).

Термин "рацион с дефицитом фосфора" относится к рациону, в котором уровень фосфора является недостаточным для удовлетворения пищевых потребностей животного, например, корму, составленному с намного более низкими уровнями фосфора, чем уровни, рекомендованные Национальным научно-исследовательским советом (NRC) или заводчиками бройлеров. Корм для животных содержит минеральные вещества на более низких уровнях, чем требуется для оптимального роста. Если в рационе не хватает фосфора, кальций также не будет усваиваться животным. Избыток Ca может приводить к слабой усвояемости фосфора (P) и способствовать образованию нерастворимых минерально-фитатных комплексов. Дефицит как P, так и Ca может вызывать снижение целостности скелета, субнормальный рост и в конечном счете потерю веса.

Термины "минерализация" или "процесс минерализации" охватывают отложение минеральных веществ или выделение минеральных веществ. Минеральные вещества могут откладываться в организме животного или выделяться из него. Минеральные вещества могут выделяться из корма. Минеральные вещества могут включать любые минеральные вещества, необходимые в рационе животных, и могут включать кальций, медь, натрий, фосфор, железо и азот. В предпочтительном варианте осуществления применение сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов по настоящему изобретению в пище или корме приводит к увеличению отложения кальция в организме животного, особенно в костях.

"Усвояемость питательного вещества", как используется в данном документе, означает долю питательного вещества, которая расходуется в желудочно-кишечном тракте или определенном сегменте желудочно-кишечного тракта, например, тонкой кишке. Усвояемость питательного вещества можно измерить в виде разницы между тем, что вводится субъекту, и тем, что выходит с фекалиями субъекта, или между тем, что вводится субъекту, и тем, что остается в переваренном содержимом определенного сегмента желудочно-кишечного тракта, например, в подвздошной кишке.

Усвояемость питательного вещества, как используется в данном документе, можно измерить по разнице между потреблением питательного вещества и выведением питательного вещества путем полного сбора экскрементов в течение определенного периода времени или с использованием инертного маркера, который не всасывается в организме животного и позволяет исследователю рассчитать количество питательного вещества, которое расходуется во всем желудочно-кишечном тракте или в определенном сегменте желудочно-кишечного тракта. Такой инертный маркер может представлять собой диоксид титана, оксид хрома или нерастворимую в кислоте золу. Усвояемость можно выразить в виде процентного содержания питательного вещества в корме, или в виде единиц массы усваиваемого питательного вещества на единицы массы питательного вещества в корме.

Усвояемость питательных веществ, как используется в данном документе, охватывает усвояемость фосфора, усвояемость крахмала, усвояемость жиров, усвояемость белка и усвояемость аминокислот. Усвояемость фосфора (P) можно определить как усвояемость P в подвздошной кишке, которая представляет собой долю от общего потребляемого P, всасываемую в конце подвздошной кишки в организме животного, или фекальную усвояемость P, которая представляет собой долю от общего потребляемого P, которая не выводится с фекалиями.

Термин "выживаемость", используемый в данном документе, означает количество субъектов, остающихся в живых. Термин "улучшенная выживаемость" является перефразированием термина "сниженная смертность".

Используемый в данном документе термин "выход туши" означает величину туши в виде доли от живого веса тела после коммерческого или экспериментального процесса забоя. Термин "туша" означает тело животного, которое было забито для применения в пищу с удалением головы, внутренностей, части конечностей и перьев или кожи. Используемый в данном документе термин "выход мяса" означает количество годного к употреблению в пищу мяса в виде доли от живого веса тела или количество определенного мясного отруба в виде доли от живого веса тела.

Термины "качество туши" и "качество мяса" используются взаимозаменяемо и относятся к качеству структуры (соотношению постного мяса и жира), а также к факторам вкусовой привлекательности, таким как внешний вид, запах, твердость, сочность, нежность и вкус. Например, подразумевается выращивание домашней птицы, не имеющей "деревянистой грудки". Деревянистая грудка представляет собой проблему качества, обусловленную мышечной аномалией, у небольшого процента куриного мяса в США. Вследствие этого состояния мясо куриной грудки является жестким на ощупь и часто имеет бледный цвет и неудовлетворительное качество текстуры. Деревянистая грудка не вызывает у людей никаких проблем со здоровьем или безопасностью пищевых продуктов, и это не оказывает отрицательного влияния на благополучие самой курицы.

"Увеличенный прирост веса" относится к животному, которое имеет увеличенный вес тела при кормлении кормом, содержащим композицию на основе кормовых добавок, по сравнению с животным, кормящимся кормом, в котором отсутствует указанная композиция на основе кормовых добавок.

В контексте настоящего изобретения подразумевается, что термин "корм для животных-компаньонов" понимается как означающий корм для домашних животных, таких как без ограничения собаки, кошки, песчанки, хомяки, шиншиллы, декоративные крысы, морские свинки; домашние птицы, такие как канарейки, попугайчики и попугаи; домашние рептилии, такие как черепахи, ящерицы и змеи; и водные домашние животные, такие как тропические рыбки и лягушки.

Термины "композиция корма для животных", "корм", "кормовой продукт" и "фураж" используются взаимозаменяемо и могут включать один или более кормовых материалов, выбранных из группы, включающей a) злаковые культуры, такие как мелкозерновые культуры (например, пшеница, ячмень, рожь, разновидности овса и их комбинации) и/или крупнозерновые культуры, такие как маис или сорго; b) побочные продукты переработки злаковых культур, такие как кукурузная глютеновая мука, сушеная барда с растворимыми веществами (DDGS) (в частности, сушеная барда кукурузы с растворимыми веществами (cDDGS), пшеничные отруби, пшеничная крупка, пшеничная сечка, рисовые отруби, рисовая шелуха, овсяная шелуха, ядро кокосового ореха и цитрусовый жом; c) белок, полученный из таких источников, как соя, подсолнечник, арахис, люпин, разновидности гороха, разновидности конского боба, хлопчатник, канола, рыбная мука, белок сухой плазмы крови, мясо-костная мука, картофельный белок, молочная сыворотка, копра, кунжут; d) масла и жиры, полученные из растительных и животных источников, и/или e) минеральные вещества и витамины.

Сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты, описанные в данном документе, или композиция на основе кормовых добавок, содержащая такие сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты, можно применять в качестве корма или при его получении.

Таким образом, описана высушенная ферментная композиция для применения в кормах для животных, содержащая любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, описанных в данном документе.

Также описана жидкая ферментная композиция для применения в кормах для животных, содержащая любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, описанных в данном документе.

Термины "композиция на основе кормовых добавок" и "ферментная композиция" используются в данном документе взаимозаменяемо.

Корм может быть представлен в форме раствора или в виде твердого вещества или полутвердого вещества в зависимости от применения, и/или способа внесения, и/или способа введения.

В предпочтительном варианте осуществления ферментную композицию или композицию на основе кормовых добавок, описанную в данном документе, смешивают с кормовым компонентом с образованием кормового продукта.

Используемый в данном документе термин "кормовой компонент" означает весь корм или его часть. Часть корма может означать одну составляющую кормового продукта или более чем одну составляющую корма, например, 2, или 3, или 4, или больше.

В одном варианте осуществления термин "кормовой компонент" охватывает премикс или составляющие премикса. Корм предпочтительно может представлять собой фураж или премикс для него, комбикорм или премикс для него. Композицию на основе кормовых добавок можно смешивать с комбикормом, компонентом комбикорма или премиксом для комбикорма или фуражом, компонентом фуража или премиксом для фуража.

Фураж охватывает растения, которые были срезаны. Кроме того, фураж включает силос, прессованные и брикетированные корма, масла и смешанные рационы, а также проросшие зерна и бобы.

В подходящем случае премикс, как указано в данном документе, может представлять собой композицию, состоящую из микроингредиентов, таких как витамины, минеральные вещества, химические консерванты, антибиотики, продукты ферментации и другие необходимые ингредиенты. Премиксы обычно представляют собой композиции, подходящие для смешивания с коммерческими рационами.

Используемый в данном документе термин "контактировавший" относится к опосредованному или непосредственному внесению любого из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов (или композиции, содержащей любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов) в продукт (например, корм). Примеры способов внесения, которые можно применять, включают без ограничения обработку продукта в материале, содержащем композицию на основе кормовых добавок, непосредственное внесение путем смешивания композиции на основе кормовых добавок с продуктом, нанесение распылением композиции на основе кормовых добавок на поверхность продукта или погружение продукта в препарат композиции на основе кормовых добавок. В одном варианте осуществления композицию на основе кормовых добавок по настоящему изобретению предпочтительно смешивают с продуктом (например, кормовым продуктом). В качестве альтернативы композицию на основе кормовых добавок можно включать в эмульсию или сырьевые ингредиенты кормового продукта. Для некоторых путей применения важно, чтобы композиция была доступна на поверхности или для поверхности продукта, подлежащего воздействию/обработке. Это позволяет улучшить эффективность композиции.

В некоторых аспектах любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов можно применять для предварительной обработки пищевого продукта или корма. Например, корм, характеризующийся 10-300% влажностью, смешивают и инкубируют со сконструированными полипептидами фитазами или их фрагментами при 5-80ºC, предпочтительно при 25-50ºC, более предпочтительно при 30-45ºC в течение от 1 минуты до 72 часов в аэробных условиях или от 1 дня до 2 месяцев в анаэробных условиях. Предварительно обработанный материал можно скармливать непосредственно животным (так называемое жидкое кормление). Предварительно обработанный материл можно также подвергнуть брикетированию с использованием пара при повышенных температурах, составляющих 60-120ºC. Сконструированными полипептидами фитазами или их фрагментами могут быть пропитаны кормовой или пищевой материал с помощью вакуумной установки для нанесения покрытий.

Любые из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов, описанных в данном документе (или композицию, содержащую такие сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты) можно применять для пересыпания, покрытия и/или пропитывания продукта (например, кормового продукта или сырьевых ингредиентов кормового продукта) контролируемым количеством указанного фермента.

В другом аспекте композицию на основе кормовых добавок можно гомогенизировать с получением порошка. Порошок можно смешивать с другими компонентами, известными из уровня техники. Порошок или смесь, содержащую порошок, можно продавливать через пресс-форму, а полученные нити разрезать на подходящие брикеты различной длины.

Стадия брикетирования необязательно может включать обработку паром или стадию кондиционирования перед формированием брикетов. Смесь, содержащую порошок, можно поместить в кондиционер, например, смеситель со впрыском пара. Смесь нагревают в кондиционере до заданной температуры, как, например, 60-100ºC, при этом типичные температуры будут составлять 70ºC, 80ºC, 85ºC, 90ºC или 95ºC. Время пребывания может варьироваться от нескольких секунд до нескольких минут. Следует понимать, что любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов (или композиция, содержащая любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов), описанных в данном документе, подходит для добавления в любой соответствующий кормовой материал.

В других вариантах осуществления гранулы можно вводить в процесс брикетирования корма, при этом процесс предварительной обработки корма можно проводить при температуре от 70°C до 95°C в течение периода до нескольких минут, как, например, от 85°C до 95°C.

В некоторых вариантах осуществления любой из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов может присутствовать в корме в диапазоне от 1 ppb (частей на миллиард) до 10% (вес/вес) в расчете на чистый белок-фермент. В некоторых вариантах осуществления сконструированные полипептиды фитазы или их фрагменты присутствуют в кормовом продукте в диапазоне 1-100 ppm (частей на миллион). Предпочтительная доза может составлять 1-20 г сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента на тонну кормового продукта или кормовой композиции, или конечная доза может составлять 1-20 ppm сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента в конечном кормовом продукте.

Предпочтительно, чтобы содержание сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента, присутствующего в корме, составляло по меньшей мере приблизительно 50-10000 FTU/кг, что соответствует около 0,1-20 мг белка, представляющего собой сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент/кг.

Диапазоны могут включать без ограничения любую комбинацию нижнего и верхнего пределов диапазонов, обсуждаемых выше.

Составы и/или препараты, содержащие любые из сконструированных полипептидов фитаз или их фрагментов и композиций, описанных в данном документе, можно получить любым подходящим способом, обеспечивающим то, что состав будет содержать активные ферменты фитазы. Такие составы могут быть представлены в виде жидкости, сухого порошка или гранул, которые могут не иметь покрытия/быть незащищенными или могут предусматривать применение термозащитного покрытия в зависимости от условий обработки. Как было отмечено выше, сконструированные полипептиды фитазы и их фрагменты могут быть составлены недорогостоящим образом на твердом носителе без особой потребности в защитных покрытиях и при этом поддерживать активность на протяжении всего процесса кондиционирования и брикетирования. Защитное покрытие, обеспечивающее дополнительную термостабильность при внесении в твердой форме, может быть полезным для достижения стабильности при брикетировании, если это необходимо в определенных регионах, где используются более жесткие условия, или если условия того требуют, например, как в случае с суперкондиционированием корма при температуре выше 90°C.

Композиция на основе кормовых добавок, описанная в данном документе, может быть составлена в виде сухого порошка или гранул, как описано в WO2007/044968 (называемых TPT-гранулами), или WO1997/016076, или WO1992/012645 (каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки).

В одном варианте осуществления композиция на основе кормовых добавок может быть составлена в виде гранулы для кормовых композиций, содержащей: сердцевину; действующее вещество (например, фитазу, такую как любой из сконструированных полипептидов фитаз, раскрытых в данном документе) и по меньшей мере одно покрытие, при этом действующее вещество гранулы сохраняет по меньшей мере 50% активность, по меньшей мере 60% активность, по меньшей мере 70% активность, по меньшей мере 80% активность после воздействия условий, выбранных из одного или более из a) процесса брикетирования корма, b) процесса предварительной обработки корма путем нагревания паром, c) хранения, d) хранения в качестве ингредиента небрикетированной смеси и e) хранения в качестве ингредиента базовой кормовой смеси или кормового премикса, содержащего по меньшей мере одно соединение, выбранное из микроэлементов, органических кислот, восстанавливающих сахаров, витаминов, хлорида холина и соединений, которые приводят к образованию кислой или основной базовой кормовой смеси или кормового премикса.

Что касается гранулы, то по меньшей мере одно покрытие может содержать увлажняющий гидратирующий материал, который составляет по меньшей мере 55% вес/вес гранулы; и/или по меньшей мере одно покрытие может предусматривать два покрытия. Эти два покрытия могут представлять собой увлажняющее гидратирующее покрытие и влагоудерживающее покрытие. В некоторых вариантах осуществления увлажняющее гидратирующее покрытие может составлять от 25% до 60% вес/вес гранулы, а влагоудерживающее покрытие может составлять от 2% до 15% вес/вес гранулы. Увлажняющее гидратирующее покрытие может быть выбрано из неорганических солей, сахарозы, крахмала и мальтодекстрина, а влагоудерживающее покрытие может быть выбрано из полимеров, камедей, молочной сыворотки и крахмала.

В других вариантах осуществления гранулы можно вводить в процесс брикетирования корма, при этом процесс предварительной обработки корма можно проводить при температуре от 70°C до 95°C в течение периода до нескольких минут, как, например, от 85°C до 95°C.

Композиция на основе кормовых добавок может быть составлена в виде гранулы для корма для животных, содержащей: сердцевину; действующее вещество, при этом действующее вещество гранулы сохраняет по меньшей мере 80% активность после хранения и после осуществления процесса брикетирования с нагреванием паром, где гранула представляет собой ингредиент; влагоудерживающее покрытие и увлажняющее гидратирующее покрытие, которое составляет по меньшей мере 25% вес/вес гранулы, при этом гранула характеризуется активностью воды, составляющей менее 0,5 перед процессом брикетирования с нагреванием паром.

Гранула может иметь влагоудерживающее покрытие, выбранное из полимеров и камедей, а увлажняющий гидратирующий материал может представлять собой неорганическую соль. Увлажняющее гидратирующее покрытие может составлять от 25% до 45% вес/вес гранулы, а влагоудерживающее покрытие может составлять от 2% до 10% вес/вес гранулы.

В качестве альтернативы композиция представлена в виде жидкого состава, подходящего для потребления, при этом такая потребляемая жидкость предпочтительно содержит одно или более из следующего: буфера, соли, сорбита и/или глицерина.

Кроме того, композиция на основе кормовых добавок может быть составлена путем нанесения, например, распыления, фермента(ферментов) на подложку-носитель, такую как, например, молотая пшеница.

В одном варианте осуществления композиция на основе кормовых добавок может быть составлена в виде премикса. Только в качестве примера, премикс может содержать один или более кормовых компонентов, как, например, одно или более минеральных веществ и/или один или более витаминов.

В одном варианте осуществления пробиотик ("DFM") и/или сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент составлены с по меньшей мере одним физиологически приемлемым носителем, выбранным из по меньшей мере одного из мальтодекстрина, известняка (карбоната кальция), циклодекстрина, пшеницы или компонента пшеницы, сахарозы, крахмала, Na₂SO₄, талька, PVA, сорбита, бензоата, сорбата, глицерина, сахарозы, пропиленгликоля, 1,3-пропандиола, глюкозы, парабенов, хлорида натрия, цитрата, ацетата, фосфата, кальция, метабисульфита, формиата и их смесей.

Следует отметить, что любой из сконструированных полипептидов фитаз и их фрагментов может быть применимым в путях применения зерна, например, при переработке зерна для непищевого/некормового применения, например, производства этанола.

Неограничивающие примеры композиций и способов, раскрытых в данном документе, включают следующие.

1. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, обладающий фитазной активностью, характеризующийся по меньшей мере 82% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1.

2. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно варианту осуществления 1, где аминокислотная последовательность сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента имеет балл согласно скрытой марковской модели (HMM), составляющий по меньшей мере приблизительно 1200, как представлено в таблице 11 для полипептидов из клады фитаз с высокой Tm или их фрагментов.

3. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент, являющийся сердцевинным доменом, характеризующийся по меньшей мере 78% идентичностью последовательности с аминокислотами в положениях 14-325 аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1.

4. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент (как, например, согласно вариантам осуществления 1, 2 или 3), характеризующийся выходом в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере приблизительно 50% при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста выхода в корме при брикетировании, описанного в примере 5.

5. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1 или 2, где указанный полипептид фитаза или его фрагмент характеризуется выходом в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере приблизительно 50% при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста выхода в корме при брикетировании, описанного в примере 5.

6. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент (как, например, согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4 или 5), характеризующийся соотношением показателей выхода в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере приблизительно 0,7 при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста в корме при брикетировании, описанного в примере 5.

7. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5 или 6, характеризующийся соотношением показателей выхода в корме при брикетировании, составляющим по меньшей мере приблизительно 0,7 при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд, при использовании стандартного теста в корме при брикетировании, описанного в примере 5.

8. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, где указанный полипептид или его фрагмент характеризуется температурой Tm, составляющей по меньшей мере приблизительно 92,5°C, при использовании условий анализа методом дифференциальной сканирующей калориметрии, описанных в примере 3.

9. Сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, где указанный полипептид или его фрагмент обладает удельной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 100 ед/мг при pH 3,5, в условиях анализа, описанных в примере 3.

10. Корм для животных, кормовой продукт, композиция на основе кормовых добавок или премикс, содержащие сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9, где сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент можно применять (i) в отдельности, или (ii) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, или (iii) с по меньшей мере одним другим ферментом, или (iv) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, и по меньшей мере одним другим ферментом, или (v) согласно любому из (i), (ii), (iii) или (iv) с дополнительным включением по меньшей мере одного другого компонента, представляющего собой кормовую добавку, и при этом сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент необязательно присутствует в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 0,1 г/тонна корма.

11. Рекомбинантная конструкция, содержащая регуляторную последовательность, функциональную в организме хозяина-продуцента, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

12. Рекомбинантная конструкция согласно варианту осуществления 11, где хозяин-продуцент выбран из группы, состоящей из бактерий, грибов, дрожжей, растений и водорослей.

13. Способ получения сконструированного полипептида фитазы или его фрагмента, включающий:

(a) трансформацию хозяина-продуцента рекомбинантной конструкцией согласно варианту осуществления 11 и

(b) культивирование хозяина-продуцента из стадии (а) в условиях, при которых продуцируется сконструированный полипептид фитаза или его фрагмент.

14. Способ согласно варианту осуществления 13, где сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент необязательно извлекают из хозяина-продуцента.

15. Надосадочная жидкость культуры, содержащая фитазу, полученная с помощью способа согласно вариантам осуществления 13 или 14.

16. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9.

17. Высушенная ферментная композиция для применения в корме для животных, содержащая сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9.

18. Высушенная ферментная композиция согласно варианту осуществления 17, где высушенная ферментная композиция представляет собой гранулированную композицию на основе кормовых добавок.

19. Жидкая ферментная композиция для применения в корме для животных, содержащая сконструированный полипептид фитазу или его фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9.

20. Способ улучшения питательной ценности корма для животных, где сконструированную фитазу или ее фрагмент согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 добавляют в корм для животных.

21. Способ улучшения продуктивности животного по одному или более показателям, включающий введение животному эффективного количества сконструированного полипептида фитазы согласно вариантам осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 или корма для животных, кормового продукта, композиции на основе кормовых добавок или премикса согласно вариантам осуществления 10 или 11.

ПРИМЕРЫ

Если в данном документе не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) для специалиста предоставлен общий словарь многих терминов, используемых в настоящем раскрытии.

Настоящее изобретение дополнительно определено в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры, хотя и показывают определенные варианты осуществления, приводятся исключительно в целях иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и примеров специалист в данной области сможет установить существенные характеристики настоящего изобретения и без отступления от его сущности и объема сможет осуществить различные изменения и модификации для его адаптации к различным путям применения и условиям.

ПРИМЕР 1

Получение молекул фитазы

Манипуляции с ДНК для получения генов фитазы проводили с помощью методик молекулярной биологии, известных из уровня техники. Полинуклеотидные фрагменты, соответствующие последовательностям, кодирующим различные фитазы, синтезировали с использованием предпочтительных кодонов для экспрессии в грибе-хозяине Trichoderma reesei (T. reesei) и повторно собирали случайным образом с помощью методик ПЦР. Сигнальную последовательность аспартатпротеазы pep1 из T. reesei (SEQ ID NO: 63), искусственно прерывающуюся интроном pep1, вводили на N-конце (5'-конце) каждой последовательности гена фитазы. Методику рекомбинации Gateway® BP использовали для введения генов в вектор pDonor221 (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями поставщика. Полученные входящие плазмиды рекомбинировали с вектором назначения pTTTpyr2, что приводило к образованию конечных векторов экспрессии. pTTTpyr2 сходен с вектором pTTTpyrG, описанным ранее (РСТ-публикация WO 2011/063308), за исключением того, что ген pyrG заменен геном pyr2. Вектор pTTTpyr2 содержит промоторные и терминаторные области cbhI T. reesei, селектируемый маркер amdS Aspergillus nidulans, селектируемый маркер pyr2 T. reesei и теломерные последовательности T. reesei (для репликации). Эти плазмиды размножали в клетках Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, США), а ДНК очищали и подвергали проверке последовательности.

Все манипуляции с грибами, включая процедуры высокопроизводительной трансформации, инокуляции, ферментации и сбора, выполняли в 96-луночных титрационных микропланшетах (MTP). Плазмиды вводили путем трансформации в подходящий штамм-хозяин T. reesei, используя способ трансформации протопластов, опосредованной полиэтиленгликолем (PEG). Вкратце, смеси для трансформации, содержащие примерно 0,5-2 мкг ДНК и 5×10⁶ протопластов в общем объеме 50 мкл, обрабатывали 200 мкл 25% раствора PEG с последующим разбавлением равным объемом раствора 1,2 М сорбита/10 мМ Tris/10 мМ CaCl₂, рН 7,5. Затем протопластам давали возможность регенерировать в жидкой среде для роста, содержащей сорбит для поддержания осмотического давления. 100 мкл смеси для трансформации переносили в 96-луночные MTP, содержащие 300 мкл минимальной среды с добавлением сорбита (0,30 М - 0,84 М). Планшеты выращивали в течение 3 дней в шейкере-инкубаторе при 28°C и влажности 80% до образования грибного мицелия. При необходимости 20 мкл выращиваемых культур переносили в свежую минимальную среду с 10 мМ ацетамидом для усиления давления отбора и выращивали в течение дополнительных 2 дней.

Для экспрессии белков фитаз трансформированные штаммы T. reesei культивировали следующим образом. 20 мкл жидких культур использовали для инокуляции 400 мкл среды для продуцирования (9 г/л казаминовых кислот, 10 г/л (NH₄)₂SO₄, 4,5 г/л KH₂PO₄, 1 г/л MgSO₄*7H₂O, 1 г/л CaCl₂*2H₂O, 33 г/л буфера PIPPS (pH 5,5), 0,25% микроэлементов T. reesei (100%: 175 г/л лимонной кислоты (безводной), 200 г/л FeSO₄*7H₂O, 16 г/л ZnSO₄*7H₂O, 3,2 г/л CuSO₄*5H₂O, 1,4 г/л MnSO4*H₂O, 0,8 г/л H₃BO₃)) в 96-луночных MTP. MTP инкубировали в шейкере-инкубаторе при тех же условиях роста, что описаны выше. После 5 дней ферментации культуры фильтровали путем центрифугирования с использованием гидрофильных мембран из PVDF для получения осветленных образцов надосадочной жидкости, используемых для анализа рекомбинантных ферментов фитаз.

ПРИМЕР 2

Получение и определение характеристик ферментов фитаз

Очистка и нормализация белков

Штаммы T. reesei, кодирующие рекомбинантные ферменты фитазы, культивировали, как описано выше, и осветленные образцы надосадочной жидкости использовали для очистки ферментов фитаз. Отфильтрованные образцы надосадочной жидкости культуры разбавляли в 5 раз промывочным буфером (25 мМ ацетат Na, pH 5,5) и загружали на катионообменную смолу (WorkBeads 40S от Bio-Works), уравновешенную очищенной водой в фильтровальном планшете MTP (фильтровальный планшет с глубокими лунками Millipore MultiScreen Solvinert типа 96-луночного MTP, гидрофильная мембрана с размером пор 0,45 мкм, № MDRLN0410). MTP помещали в центрифугу, фильтрат удаляли в течение 1 мин. центрифугирования (100 x g). Образцы белка фитазы элюировали с использованием элюирующего буфера (25 мМ ацетат Na, 0,5 М NaCl, pH 5,5) в течение 1 мин. центрифугирования (100 x g). Образцы, полученные на стадии очистки белка, разбавляли в 5 раз Na-ацетатным буфером (25 мМ ацетат Na, 0,5 М NaCl, pH 5,5) до конечного объема 100 мкл в 96-луночных MTP для УФ-спектроскопии (Costar, 3635). Оптическое поглощение образцов измеряли при 280 нм, и концентрации белка рассчитывали в соответствии с калибровочной кривой для белка фитазы с известной концентрацией, охватывающей диапазон 0-1750 ppm. Исходя из определенных концентраций белка, все образцы после очистки разбавляли до целевого значения 150 ppm в буфере (100 мМ ацетат Na, 0,5 М NaCl, pH 5,5) в 96-луночных MTP и хранили при 5°C до использования в анализах, описанных ниже.

Концентрацию белка фитазы в каждом образце определяли с помощью обращенно-фазовой HPLC (RP-HPLC). Нормализованные образцы загружали в колонку Agilent Zorbax 300 (SB-C3, 2,1×50 мм) в системе для HPLC Agilent 1260. Градиент растворителя A (0,1% об./об. TFA в воде) и растворителя B (0,07% TFA в ацетонитриле) применяли в соответствии с таблицей 2. Объем вводимой пробы составлял 10 мкл, температура колонки составляла 60°C, и скорость потока составляла 1 мл/мин. Оптическое поглощение элюента измеряли при 220 нм и интегрировали с помощью программного обеспечения ChemStation (Agilent Technologies). Концентрацию белка в образцах фитазы определяли, исходя из калибровочной кривой белка фитазы с известной концентрацией, охватывающей диапазон 0-350 ppm.

Таблица 2. Условия градиента HPLC, используемые для определения концентрации белка для очищенных нормализованных ферментов фитаз Время (минуты) Растворитель А Растворитель B 0 80 20 0,1 80 20 1,6 35 65 1,65 5 95 1,95 5 95 2 80 20 2,3 80 20

Очистку образцов фитаз PHY-11895, PHY-11932 и PHY-12663 и экстрактов коммерческих продуктов Quantum Blue 5G и Natuphos E 10000G (способ экстракции описан в примере 5) выполняли следующим образом. Для образцов проводили замену буфера в колонках PD10 (предварительно уравновешенных буфером, представляющим собой 10-30 мМ ацетат Na, pH 5,5), а затем их очищали с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий HIC. В зависимости от образца использовали одну из следующих колонок для HIC (Phenyl HP XK26, или HiTrap Phenyl HP, или Phenyl 15, HR5/5). Колонку для HIC предварительно уравновешивали загрузочным буфером (20 мМ Na-ацетатный буфер, pH 5,5, содержащий 1,0-1,3 М сульфата аммония). Связавшийся белок фитазу элюировали с использованием линейного градиента сульфата аммония в 10 мМ ацетате Na, pH 5,5. Для собранных фракций из колонки для HIC проводили замену буфера с использованием колонок Sephadex G25 M, XK50/35 или PD10 (предварительно уравновешенных буфером, представляющим собой 10-30 мМ ацетат Na, pH 5,5). Согласно оценкам конечная чистота всех очищенных образцов фитаз (фитаз PHY-11895, PHY-11932 и PHY-12663 и экстрактов коммерческих продуктов Quantum Blue 5G и Natuphos E 10000G) превышала 95%. Концентрацию белка в конечных очищенных образцах определяли путем спектрофотометрического измерения оптического поглощения при 280 нм и с использованием расчетных коэффициентов экстинкции. Для двух коммерческих продуктов (Quantum Blue 5G и Natuphos E 10000G) использовали расчетный коэффициент экстинкции двух близкородственных общедоступных последовательностей фитазы (SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 60). Коэффициенты молярной экстинкции рассчитывали с использованием программного обеспечения Geneious® версии 10.2.4.

ПРИМЕР 3

Анализы ферментов фитаз in vitro

Следующие анализы использовали для измерения различных свойств полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов, а также коммерчески доступных фитаз.

Эталонная фитазная активность (FTU)

Образцы фитазы анализировали в отношении активности с помощью способа определения эталонной фитазной активности (FTU). Использовали следующую модифицированную процедуру согласно ISO 30024: "Кормовые продукты для животных - Определение фитазной активности". Для подготовки к анализу жидкие образцы фитазы разбавляли в буфере для анализа (250 мМ ацетат Na, 1 мМ CaCl2 и 0,01% Tween-20, pH 5,5) для получения измерения в пределах линейного диапазона калибровочной кривой для фосфата в следующем анализе фитазы по FTU. Для твердых образцов 1,0 г образца отвешивали и экстрагировали в 100 мл буфера для анализа путем перемешивания на магнитной мешалке в течение 20 минут. Образцы надосадочной жидкости собирали после фильтрации (фильтр из стекловолокна GA-55, Advantec) и дополнительно разбавляли до примерно 0,04 FTU/мл. Анализ образцов проводили в соответствии со следующей процедурой: 1 мл разбавленных образцов фитазы смешивали с 2 мл 7,5 мМ раствора субстрата IP6 (фитат натрия из риса, Shanghai AZ Import and Export, Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd, № Z0201301181) в буфере для анализа и инкубировали на водяной бане в течение 60 мин. при 37°C. Реакции останавливали с помощью 2 мл кислого реагента молибдат/ванадат, и содержание неорганического фосфата определяли количественно с помощью спектрофотометрии при 415 нм. Результаты корректировали путем вычитания оптического поглощения холостого буфера из оптического поглощения образцов фитазы. Калибровочную кривую для фосфата строили по высушенному гидрофосфату калия и использовали для расчета количества высвободившегося фосфата из каждого образца. Одну FTU определяли как количество фермента фитазы, которое приводит к образованию 1 мкмоль фосфата/мин.

Удельная активность в отношении субстрата IP6 при pH 3,5 или 5,5

Фитазы анализировали в отношении фитазной активности с использованием раствора субстрата IP6 (фитат натрия из риса, Shanghai AZ Import and Export, Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd, № Z0201301181). Для оценки при pH 5,5 образцы фермента фитазы в концентрации 150 ppm подвергали серийному разведению до конечной концентрации 0,18 ppm с использованием 100 мМ Na-ацетатного буфера, 0,025% Tween-20 и 0,05 мМ CaCl₂, pH 5,5, в 384-луночном MTP перед анализом. 47 мкл субстрата IP6 (0,20 мМ) в 100 мМ ацетате Na, 0,025% Tween-20 и 0,05 мМ CaCl₂, pH 5,5, добавляли в каждую лунку 384-луночного MTP, и добавляли 3 мкл разбавленного образца фермента фитазы до конечного объема 50 мкл.

Для оценки активности при pH 3,5 образцы фермента фитазы в концентрации 150 ppm подвергали серийному разведению до конечной концентрации 0,11 ppm в 100 мМ Na-ацетатном буфере, 0,025% Tween-20 и 0,05 мМ CaCl₂, pH 5,5, в 384-луночном MTP перед анализом. 47 мкл субстрата IP6 (0,20 мМ) в 100 мМ глицине, 0,025% Tween-20 и 0,05 мМ CaCl₂, pH 3,3, добавляли в каждую лунку 384-луночного MTP, и добавляли 3 мкл разбавленного образца фермента фитазы до конечного объема 50 мкл.

Реакционные планшеты MPT инкубировали в течение 10 минут при 25ºC в шейкере iEMS (Thermo Scientific) при непрерывном перемешивании (1400 об./мин.), и реакции останавливали путем добавления 45 мкл стоп-реагента PiBlue (набор для анализа фосфата PiBlue™, POPB-DP, BioAssay Systems, США). Содержимое планшетов перемешивали и герметично закрывали перед инкубированием для проявления цвета в течение 30 мин. при 25°C в шейкере iEMS (650 об./мин.). После инкубирования цветообразование определяли путем измерения оптического поглощения при 620 нм на планшет-ридере (SpectraMax, Molecular Devices). Активность каждого образца фитазы в отношении субстрата IP6 рассчитывали, исходя из аппроксимированной калибровочной кривой для белка фитазы с известной концентрацией и активностью, охватывающей диапазон 0-350 ppm, в виде среднего значения для трех повторностей. Затем рассчитывали удельную активность в мкмоль фосфата/мг/мин. для каждого образца фитазы, используя активность при рН 3,5 или 5,5, деленную на концентрацию белка фитазы в образце, определенную с помощью RP-HPLC (как описано в примере 2).

Для вариантов фитазы, описанных в таблице 3В и таблице 21, получение образцов и анализ активности выполняли, как описано в данном документе. Аликвоты очищенного белка (пример 2) разбавляли до целевой концентрации 100 ppm в буфере (100 мМ ацетат Na, 0,5 М NaCl, pH 5,5) с последующим серийным разведением до конечной концентрации 0,1 ppm с использованием 100 мМ Na-ацетатного буфера, 0,025% Tween-20 и 0,05 мМ CaCl₂, pH 5,5. Затем определяли активность при pH 5,5 и 3,5, как описано в примере 3, за исключением того, что использовали 96-луночные MTP вместо 384-луночных MTP (осуществляли реакцию 70 мкл субстрата IP6 (0,20 мМ) в 100 мМ ацетате Na, 0,025% Tween 20 и 0,05 мМ CaCl₂, pH 5,5, с аликвотой разбавленного фермента объемом 10 мкл. Реакцию останавливали, используя 170 мкл реагента PiBlue).

Определение температуры плавления (Tm) с помощью DSC

Измерения с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) проводили с использованием капиллярной системы MicroCal™ VP-DSC (GE Healthcare). DSC представляет собой мощный аналитический инструмент для определения характеристик стабильности белков и других биомолекул. Он измеряет энтальпию (ΔH) и температуру (T_m) термически индуцированных структурных переходов в растворе. Получали образцы белка фитазы, разбавленные до конечной концентрации 0,4 мг/мл в 100 мМ Na-ацетатном буфере, pH 5,5. 400 мкл этих образцов белка, а также эталонный образец, содержащий идентичное количество буфера, не содержащего белков, добавляли в 96-луночный планшет. Планшет помещали в отсек автоматического пробоотборника с контролируемой температурой, поддерживаемый при 10°C. Образцы белка и эталонный образец сканировали при 20-120°C со скоростью сканирования 2°C в минуту. Температуру плавления (Tm) определяли как температуру максимума пика перехода из свернутого состояния в развернутое. Максимальное изменение Tm составляло ± 0,2°C. Пакет программного обеспечения ORIGIN (MicroCal, GE Healthcare) использовали для вычитания исходного уровня и расчета значений Tm.

ПРИМЕР 4

Оценка удельной активности и термостабильности ферментов фитаз

Образцы полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов, полученные с помощью способа, описанного в примере 1 и примере 2, оценивали в отношении их удельной фитазной активности при pH 3,5 и 5,5 и в отношении их термостабильности с помощью способов, описанных в примере 3. В исследование включали коммерческие фитазные продукты Quantum Blue® (AB Vista) и Natuphos® 10000 E (BASF Nutrition). Эти два продукта выбирали, поскольку они относятся к наиболее термостабильным по своей природе продуктам, являющимся коммерчески доступными. В таблицах 3A и 3B представлены результаты анализа удельной активности при pH 3,5 и pH 5,5 в мкмоль фосфата/мг/мин. и термостабильности (Tm) в°C, измеренной с помощью DSC, при этом н. о. означает, что значение не определено. Результаты показывают, что все полипептиды из клады фитаз с высокой Tm и их фрагменты демонстрируют значение Tm, значительно более высокое, чем у коммерческих продуктов. Эти полипептиды из клады фитаз с высокой Tm и их фрагменты демонстрируют удельную активность, которая сопоставима с удельной активностью коммерческих продуктов при pH 5,5 или превышает ее. При pH 3,5 значения удельной активности всех полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов являются более высокими, чем у коммерческих продуктов. Более высокая термостабильность может быть весьма благоприятной в условиях брикетирования, особенно при MLA или при внесении в твердом составе. Более высокая удельная активность при кислом значении pH может быть весьма благоприятной в кислых условиях, имеющихся в пищеварительном тракте моногастричных животных.

Таблица 3A. Удельная активность, измеренная при pH 3,5 и pH 5,5, и термостабильность, измеренная с помощью DSC, для различных ферментов фитаз Название образца Удельная активность при pH 5,5
(мкмоль фосфата/мг/мин) Удельная активность при pH 3,5
(мкмоль фосфата/мг/мин) Tm, определенная с помощью DSC
(°C) PHY-10931 402 н. о. 94 PHY-10957 365 н. о. 93 PHY-11569 335 н. о. 94 PHY-11658 614 н. о. 94 PHY-11673 246 н. о. 93 PHY-11680 425 н. о. н. о. PHY-11895 335 526 97 PHY-11932 436 622 93 PHY-12058 275 н. о. 94 PHY-12663 363 741 94 PHY-12784 478 н. о. 93 PHY-13177 612 н. о. 94 PHY-13371 263 572 96 PHY-13460 408 708 98 PHY-13513 267 624 99 PHY-13594 449 686 97 PHY-13637 319 654 98 PHY-13705 489 775 97 PHY-13713 261 589 98 PHY-13747 679 646 96 PHY-13779 744 880 97 PHY-13789 475 696 101 PHY-13798 288 602 98 PHY-13868 348 574 97 PHY-13883 387 508 95 PHY-13885 340 608 99 PHY-13936 270 635 98 PHY-14004 423 574 98 PHY-14215 430 410 н. о. PHY-14256 669 847 98 PHY-14277 407 696 98 PHY-14473 360 702 96 PHY-14614 367 605 97 PHY-14804 268 489 95 PHY-14945 367 692 97 PHY-15459 535 434 н. о. PHY-16513 476 342 н. о. Natuphos E 10000 320 290 86 Quantum Blue 274 400 88

н. о. означает, что значение не определено

Таблица 3B. Удельная активность, измеренная при pH 3,5 и pH 5,5, и термостабильность, измеренная с помощью DSC, для различных ферментов фитаз Название образца Удельная активность при pH 5,5
(мкмоль фосфата/мг/мин) Удельная активность при pH 3,5
(мкмоль фосфата/мг/мин) Tm, определенная с помощью DSC
(°C) PHY-16812 476 717 98 PHY-17403 н. о. н. о. 101 PHY-17336 н. о. н. о. 100 PHY-17225 366 418 101 PHY-17186 н. о. н. о. 101 PHY-17195 н. о. н. о. 100 PHY-17124 341 555 99 PHY-17189 н. о. н. о. 101 PHY-17218 423 597 101 PHY-17219 402 548 101 PHY-17204 415 586 100 PHY-17215 н. о. н. о. 101 PHY-17201 480 625 101 PHY-17205 449 657 101 PHY-17224 н. о. н. о. 101 PHY-17200 483 670 101 PHY-17198 н. о. н. о. 101 PHY-17199 н. о. н. о. 101 PHY-17214 н. о. н. о. 101 PHY-17197 н. о. н. о. 101 PHY-17228 376 410 101 PHY-17229 329 665 100 PHY-17152 259 422 99 PHY-17206 н. о. н. о. 100 PHY-13594 449 687 97 PHY-13885 340 596 99 PHY-13789 475 700 101

Масс-спектроскопию высокого разрешения (MS) выполняли для подтверждения аминокислотных последовательностей полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов - PHY-13594, PHY-11895, PHY-12663, PHY-13637, PHY-13789, PHY-13885, PHY-13936, PHY-14004, PHY-14256 и PHY-14277 (SEQ ID NO: 1, 8, 11, 17, 22, 26, 27, 28, 30, 31). Анализы методом MS подтверждали предсказанный С-конец SEQ ID NO: 1, 8, 11, 17, 22, 26, 27, 28, 30, 31. Кроме того, анализ методом MS выявил усечения N-конца SEQ ID NO: 1, 8, 11, 17, 22, 26, 27, 28, 30, 31. Наиболее часто наблюдаемая N-концевая аминокислота соответствует положению 4 по отношению к предсказанной зрелой последовательности, но также наблюдались усечения по положениям 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10.

ПРИМЕР 5

Исследования стабильности ферментов фитаз при брикетировании

Тесты выхода в корме при брикетировании для полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов выполняли на установке для брикетирования в Технологическом институте (Южный Стендеруп, Дания). Следует отметить, что показатели выхода при брикетировании в корме зависят от нескольких факторов, в том числе: конкретной кормовой основы, условий кондиционирования и брикетирования, анализа, используемого для определения активности, и т. д.

Измеряли выход в корме при брикетировании для ферментов фитаз PHY-11895, PHY-11932, PHY-12663, PHY-13594, PHY-13637, PHY-13789, PHY-13885, PHY-13936, PHY-14256, PHY-14277 и эталонных коммерческих фитаз Quantum® Blue 5G (AB Vista) и Natuphos® E 10000G (BASF Nutrition). Жидкие образцы эталонных коммерческих образцов фитазы получали с помощью экстракции фермента фитазы из порошкообразных продуктов Quantum Blue 5G и Natuphos E 10000G с использованием 100 мМ Na-ацетатного буфера, pH 5,5. Активность жидких образцов фермента фитазы измеряли с помощью анализа эталонной фитазной активности (FTU), описанного в примере 3, и их добавляли в корм в соответствующих дозах. Твердые образцы для исследования стабильности при брикетировании получали путем нанесения жидких образцов PHY-11895, PHY-11932, PHY-12663, PHY-13637, PHY-13789, PHY-13885 на носитель из цельных зерен пшеницы в соответствии со следующей процедурой. Измельченные цельные зерна пшеницы переносили в смеситель-купе, оснащенный зазубренным лезвием ножа. Образец жидкой фитазы (максимум 40% об./вес) добавляли к порошку из измельченных цельных зерен пшеницы при перемешивании. Смесь образца жидкой фитазы и порошка из измельченных цельных зерен пшеницы выкладывали на поддон и сушили при 40°C в течение 8-10 часов в печи. После сушки твердый фитазный продукт перемалывали с помощью мельницы Bühler (модели MLT 204) с зазором между валками, установленным на 0. Эталонный образец коммерческого продукта Quantum Blue 5G добавляли дозами в корм в твердом виде (как есть) для сравнения. Анализ твердых фитазных продуктов проводили с помощью анализа эталонной фитазной активности (FTU), и продукты добавляли в корм в соответствующих дозах.

Кормовая композиция представляла собой кукурузно-соевый рацион, содержащий: 62,5% кукурузы, 31% соевой муки, 4,4% соевого масла, 1,2% известняка, 0,5% VIT/MIN (премикса Farmix Leghennen) и 0,4% хлорида натрия. Содержание влаги в корме составляло приблизительно 12-14% (вес/вес). От 120 кг до 200 кг предварительно перемешанного корма, описанного выше, смешивали с жидкими (MLA) либо с твердыми образцами фермента фитазы в горизонтальном ленточном смесителе при комнатной температуре (22-24°C) в течение 10 минут до достижения конечной концентрации фитазы в корме 5 FTU/г. Количество жидкого образца фитазы, добавляемого в корм, составляло от 0,2 до 0,5% (вес/вес).

После смешивания образцы корма, содержащие фитазу, кондиционировали в течение 30 секунд при 60°C, 80°C, 85°C, 90°C либо 95°C в каскадном смесителе KAHL и затем брикетировали. Термин "кондиционирование", используемый в данном документе, означает перемешивание смеси корм/фермент и ее обработку паром до достижения целевой температуры 60°C, 80°C, 85°C, 90°C или 95°C в течение времени выдержки 30 секунд. Температуру кондиционирования контролировали вручную, регулируя 3 паровых клапана, из которых пар под давлением 2 атм. направлялся на смесь корм/фермент. На выходе из кондиционера температуру поддерживали на уровне целевой температуры +/- 0,3°C. Такое кондиционирование паром обычно приводит к увеличению содержания воды в корме на 2-5,5 вес. % при температурах кондиционирования от 60 до 95°C. Сразу после стадии кондиционирования смеси корм/фермент формировали в брикеты на брикетировочном прессе Simon Heesen, оснащенном пресс-формой Ø 3 мм * 35 мм и двигателем мощностью 7,5 кВт. Скорость подающего шнека регулировали до достижения производительности, составляющей примерно 300 кг/час, а скорость ролика устанавливали на 500 об./мин. Систему оставляли работать в течение примерно 8 минут после достижения целевой температуры кондиционирования, чтобы нагреть брикетировочную пресс-форму. Затем собирали образцы брикетированного корма массой 5-7,5 кг и сразу охлаждали в холодильном шкафу с перфорированным дном при расходе окружающего воздуха 1500 м3 воздуха/ч в течение 15 минут. В ходе охлаждения содержание воды в брикетах падало до уровня, сопоставимого с содержанием воды в кормовой смеси, содержащей фитазу, до кондиционирования паром (мешанке). Образцы уменьшали в размерах с использованием делителя образцов в соответствии с ISO_6497_2002, и выход фитазы определяли следующим образом.

Образцы корма, содержащие фитазу - как мешанку, так и брикеты - перемалывали с помощью лабораторной мельницы Retsch (модели ZM 200, оснащенной ситом с диаметром отверстий 0,75 мм) и затем анализировали для измерения фитазной активности с помощью следующего способа, который является модификацией процедуры согласно ISO 30024: "Кормовые продукты для животных - Определение фитазной активности".

Для экстрагирования фермента фитазы из образцов корма 20,0 г (+/- 0,05 г) молотой мешанки и брикетированного корма смешивали со 100 мл экстрагирующего буфера (250 мМ ацетат Na, 1 мМ CaCl₂, 0,01% Tween-20, pH 5,5) в ротационном смесителе в течение 20 минут при комнатной температуре. Образцы надосадочной жидкости собирали после фильтрации (фильтр из стекловолокна GA-55 от Advantec). Образцы надосадочной жидкости дополнительно разбавляли экстрагирующим буфером для получения измерения в пределах линейного диапазона калибровочной кривой для фосфата в следующем анализе фитазы по FTU (0,04 FTU/мл).

Один мл разбавленных экстрагированных образцов фитазы смешивали с 2 мл 7,5 мМ раствора субстрата IP6 (фитат натрия из риса, Shanghai AZ Import and Export, Zhejiang Orient Phytic Acid Co. Ltd, № Z0201301181) в экстрагирующем буфере и инкубировали на водяной бане в течение 60 мин. при 37°C. Реакции останавливали с помощью 2 мл кислого реагента молибдат/ванадат, и высвобождение неорганического фосфата определяли количественно с помощью спектрофотометрии при 415 нм. Результаты корректировали путем вычитания оптического поглощения соответствующего образца в нулевой момент времени (образца, который не инкубировали в течение 60 минут, 37°C). Калибровочную кривую для фосфата строили по высушенному гидрофосфату калия и использовали для расчета количества высвободившегося фосфата из каждого образца. Одну единицу (FTU) определяли как количество фермента фитазы, которое приводит к образованию 1 мкмоль фосфата/мин. Процент выхода в корме при брикетировании рассчитывали с помощью следующей формулы: (фитазная активность в брикете (FTU/г), деленная на фитазную активность в мешанке (FTU/г)) * 100.

В таблице 4 перечислены значения процента выхода в корме при брикетировании для ферментов фитаз, вносимых методом MLA при температурах 60, 80, 85, 90 и 95°C, как показано в таблице 3. Выход при брикетировании при 95°C составлял по меньшей мере 50% для всех тестируемых полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов, вносимых методом MLA. Для сравнения, экстрагированные коммерческие эталонные фитазы Quantum Blue и Natuphos E 10000 демонстрировали гораздо более низкий выход в корме, а именно 15% и 25% соответственно в тех же условиях. Эти данные иллюстрируют высокую устойчивость полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов.

При 60°C выход в корме при брикетировании при внесении методом MLA составлял от 71% до 85% для всех тестируемых полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов. На первый взгляд может показаться противоречивым, что устойчивые фитазы, раскрытые в данном документе, теряют от 15 до 29% активности при кондиционировании при 60°C и последующем брикетировании, при том, что температура кондиционирования 60°C более чем на 30°C ниже, чем Tm устойчивых фитаз. Это позволяет предположить, что первоначальная потеря не связана с термической инактивацией в кондиционере, что дополнительно подтверждается тем фактом, что при повышении температуры до 80°C наблюдаются лишь ограниченные дополнительные потери. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, и это было описано для других ферментов (фитазы и ксиланазы; отчет об испытании 875: Совет по сельскому хозяйству и продовольствию Дании, заявка на патент WO2014120638 и Novus Insight, Issue 3, 2015), что может существовать фракция фитазы и ксиланазы, которую сложно экстрагировать/извлечь из корма после кондиционирования и брикетирования. Однако полагают (опять-таки не ограничиваясь какой-либо теорией), что по меньшей мере часть этой неизвлекаемой фракции по-прежнему является биологически активной в организме животного - другими словами, неизвлекаемая фракция может не быть необратимо инактивированной вследствие термического стресса. Скорее полагают (опять-таки не ограничиваясь какой-либо теорией), что неизвлекаемая фракция связана в корме таким образом, что ее нельзя экстрагировать in vitro. В качестве альтернативы полагают (опять-таки не ограничиваясь какой-либо теорией), что в действительности весь белок-фермент фитаза экстрагируется, но в результате кондиционирования и брикетирования наблюдается кажущаяся более низкая активность фитаз при измерении в анализе in vitro. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что внесение фитаз методом MLA по сравнению с сухой формой и/или формой с покрытием приведет к увеличению количества этой неизвлекаемой, но биологически активной формы фитаз в результате непосредственного физического взаимодействия с кормом.

Отсюда следует, что подходящим способом оценки термоустойчивости фитаз, вносимых методом MLA, является не сравнение активности, выход которой можно получить в корме, до и после кондиционирования и брикетирования, а скорее сравнение выхода фитазной активности после кондиционирования и брикетирования при низкой, например, составляющей 80°C, и высокой, например, составляющей 95°C, температуре кондиционирования, которая находится в пределах коммерчески значимого диапазона температур кондиционирования.

Таблица 4. Сравнение выхода ферментативной активности фитазы после внесения методом MLA при увеличении температуры от 60 до 95°C в течение 30 секунд % выхода ферментативной активности Образец фитазы 60°C 80°C 85°C 90°C 95°C PHY-11895 77 67 н. о. 66 64 PHY-11932 н. о. н. о. 68 66 50 PHY-12663 85 н. о. 70 67 51 PHY-13594 82 76 н. о. 67 55 PHY-13637 80 78 н. о. 75 68 PHY-13789 80 76 н. о. 77 74 PHY-13885 72 66 н. о. 63 55 PHY-13936 н. о. 79 н. о. 75 72 PHY-14256 76 71 н. о. 63 58 PHY-14277 75 70 н. о. 65 59 Quantum Blue 84 н. о. 66 53 15 Natuphos E 10000 87 77 н. о. 67 25

н. о. означает, что значение не определено

В таблице 5 показано соотношение показателей выхода в корме при брикетировании при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд. Для полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов, вносимых методом MLA, соотношение показателей выхода в корме при брикетировании при 95°C составляло от 0,72 до 0,98 по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд. Соответствующее число для экстрагированной коммерческой эталонной фитазы Natuphos E 10000 составляло 0,32. Данные показывают, что полипептиды из клады фитаз с высокой Tm и их фрагменты, раскрытые в данном документе, являются весьма устойчивыми к изменениям температуры кондиционирования в пределах коммерчески значимого диапазона температур.

Таблица 5. Соотношение показателей выхода в корме при брикетировании при внесении методом MLA при 95°C в течение 30 секунд по сравнению с внесением методом MLA при 80°C в течение 30 секунд Название образца Соотношение PHY-11895 0,96 PHY-11932 н. о. PHY-12663 н. о. PHY-13594 0,72 PHY-13637 0,87 PHY-13789 0,98 PHY-13885 0,83 PHY-13936 0,91 PHY-14256 0,82 PHY-14277 0,84 Quantum Blue 0,22* Natuphos E 10000 0,32

* Результат определения соотношения приведен для процесса при 95°C по сравнению с процессом при 85°C, а не 80°C

н. о. означает, что значение не определено

В таблице 6 показан выход в корме при брикетировании при 95°C для фитаз PHY-11895, PHY-11932, PHY-12663, PHY-13637, PHY-13789, PHY-13885 и Quantum Blue 5G при внесении в твердом виде. Все полипептиды из клады фитаз с высокой Tm и их фрагменты характеризуются показателями выхода в корме при брикетировании, составляющими по меньшей мере 64% при 95°C при внесении в твердом виде на носителе из измельченных цельных зерен пшеницы. Коммерческий порошкообразный продукт Quantum Blue 5G характеризуется 58% выходом при тестировании в тех же условиях.

Таблица 6. Процент выхода в корме при брикетировании для ферментов фитаз, вносимых в твердом виде % выхода ферментативной активности Образец фитазы 95°C PHY-11895 71 PHY-11932 83 PHY-12663 64 PHY-13637 78 PHY-13789 75 PHY-13885 72 Quantum Blue 5G 58

ПРИМЕР 6

Оценка ферментов фитаз in vivo

Оценка эффективности PHY-12663, PHY-11932 и PHY-11895

Эффективность фитаз PHY-12663, PHY-11932 и PHY-11895 in vivo оценивали у бройлеров. Исследование проводили в Техасском университете A&M. Тестировали восемь видов обработки рациона: рацион положительного контроля (PC), составленный с учетом пищевых потребностей бройлеров, отрицательный контроль (NC), составленный с дефицитом усваиваемого фосфора (на 0,16% ниже, чем в PC) и кальция (на 0,19% ниже, чем в PC), и NC с добавлением фитаз PHY-12663, PHY-11932 или PHY-11895 в дозах 500 и 1000 FTU/кг. В таблице 7 представлен состав рациона с расчетными и проанализированными значениями питательной ценности, используемыми в этом исследовании.

Таблица 7. Состав рациона (расчетный и проанализированный) для оценки фитаз PHY-12663, PHY-11932 и PHY-11895 in vivo Ингредиент, г/кг, как есть PC, стартерный корм
0-10 дней NC, стартерный корм
0-10 дней PC,
ростовой корм
11-21 день NC, ростовой корм
11-21 день PC, финишный корм
22-42 дня NC, финишный корм
22-42 дня Кукуруза 587,5 609,5 625 647 664,5 686,5 Соевая мука, 48% 332 328,5 277 273,5 226,5 223 DL-Met98 2,925 2,9 2,6 2,575 2,45 2,425 Лизин-HCL 1,95 2,025 2,025 2,1 2,325 2,4 L-треонин, 98,5% 0,675 0,7 0,7 0,7 0,925 0,925 Жир, смесь a/v 15,5 8 24,5 17 29 21 Известняк 14,45 13 13,35 11,95 11,95 10,5 Фосфат монокальция 15,45 6,5 13,9 4,9 11,75 2,8 Соль 4,325 4,325 3,325 3,35 2,6 2,625 Бикарбонат натрия 0 0 1 1 2 2 Витаминный премикс 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 Микроэлементный премикс 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Рисовые отруби 23,14 23,14 34,465 34,465 44,07 44,07 Расчетные показатели питательных веществ, % Сырой белок 21,81 21,82 19,59 19,60 17,63 17,65 Сырой жир 4,40 3,73 5,53 4,86 6,20 5,49 Сырые волокна 2,85 2,88 2,84 2,88 2,84 2,88 Кальций 0,9 0,7 0,82 0,622 0,72 0,521 Общий фосфор 0,73 0,545 0,691 0,505 0,639 0,455 Доступный фосфат 0,45 0,263 0,411 0,222 0,359 0,172 ME для домашней птицы, ккал/кг 3000 3000 3100 3100 3176 3174 Ксантофиллы, мг/кг 9,99 10,36 10,63 11,0 11,3 11,7 Усваиваемый Met 0,59 0,589 0,533 0,532 0,496 0,494 Усваиваемый Lys 1,18 1,18 1,05 1,05 0,949 0,95 Проанализированные показатели питательных веществ, % Сырой белок 19,87 19,74 18,8 18,6 17,5 17,2 Жир 4,54 4,17 5,53 5,12 5,96 5,85 Зола 5,98 5,25 4,71 3,96 4,53 3,97 Общий фосфор 0,74 0,56 0,73 0,50 0,67 0,53 Кальций 1,00 0,89 0,97 0,78 0,79 0,64

В качестве носителя фермента фитазы использовали измельченную рисовую шелуху.

Суточных бройлеров-самцов Cobb 500 распределяли в группы обработки рациона, каждая из которых включала 10 дублирующих загонов с 30 цыплятами в каждом загоне. Основу рационов составляли кукуруза, соевая мука и рисовые отруби в виде мешанки. В день 21 удаляли по пять птиц из каждого дублирующего загона, и собирали большеберцовые кости для определения содержания золы в обезжиренной большеберцовой кости. Рационы составляли в соответствии с 3-фазной программой кормления (стартерный корм 0-10 дней, ростовой корм 11-21 день и финишный корм 22-42 дня). Рационы и воду применяли ad libitum в течение всего 42-дневного исследования.

Данные анализировали с использованием ANOVA, средние значения по видам обработки разделяли с использованием критерия HSD Тьюки, результаты с P < 0,05 считаются значимыми. Рассчитывали следующие параметры продуктивности: ADG (среднесуточный прирост), ADFI (среднесуточное потребление корма) и FCR (коэффициент конверсии корма) для периода исследования 0-42 дня. В таблице 8 показаны результаты определения показателей роста для бройлеров, кормившихся рационами с добавлением различных фитаз в различных дозах в возрасте от 0 до 42 дня, и содержание золы в большеберцовой кости, измеренное в возрасте 21 дня. Снижение содержания фосфора (P) и кальция (Ca) в рационах NC коррелирует с более низкими ADG, ADFI и содержанием золы в большеберцовой кости, а также более высоким FCR по сравнению с PC. Все тестируемые фитазы - PHY-12663, PHY-11932 и PHY-11895 - приводили к улучшению ADG, ADFI, содержания золы в большеберцовой кости и FCR у бройлеров по сравнению с рационом NC. Обработка фитазами PHY-12663, PHY-11932 и PHY-11895 в среднем приводила к улучшению ADG на 12 и 14%, ADFI на 8 и 10%, FCR на 3,3 и 3,7%, содержания золы в большеберцовой кости на 9 и 9,7% при добавлении в дозах 500 и 1000 FTU/кг корма соответственно по сравнению с рационом NC. Кроме того, эффективность всех фитаз была лучшей или незначимо отличающейся по сравнению с теми, кто кормился рационом PC, по всем параметрам. Эти данные показывают, что полипептиды из клады фитаз с высокой Tm и их фрагменты (PHY-12663, PHY-11932 и PHY-11895) способны значительно улучшать рост скелета и продуктивность бройлеров.

Таблица 8. Показатели роста за 42 дня и содержание золы в большеберцовой кости в возрасте 21 дня для бройлеров, кормившихся рационами с добавлением фитаз PHY-12663, PHY-11932 или PHY-11895 при 500 и 1000 FTU/кг Обработка Доза фитазы (FTU/
кг) ADG ADFI FCR Содержание золы в большеберцовой кости,
% в день 21 PC 0 69,9 ^a 114,5 ^a 1,639^ab 52,4^a NC 0 62,3^b 103,3^b 1,659 ^a 47,5^b NC+PHY-12663 500 68,5 ^a 109,6^ab 1,600^c 51,8^a NC+PHY-12663 1000 70,8 ^a 113,0 ^a 1,597^c 52,0^a NC+PHY-11932 500 70,0 ^a 113,0 ^a 1,614^bc 51,8^a NC+PHY-11932 1000 71,6 ^a 114,9 ^a 1,606^c 52,2^a NC+PHY-11895 500 70,4 ^a 112,4 ^a 1,599^c 51,7^a NC+PHY-11895 1000 70,7 ^a 112,5 ^a 1,591^c 52,1^a Статистические показатели SEM 1,11 1,70 0,01 0,26 P для рационов <.0001 0,0002 <.0001 <.0001

^{a, b, c:} разные верхние индексы в столбце указывают на значимое различие при P < 0,05

FCR скорректирован по смертности

Оценка эффективности PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 и PHY-13885

Эффективность PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 и PHY-13885 in vivo оценивали у бройлеров в AH Pharma (Геброн, Мэриленд, США). Тестировали десять видов обработки, включая рацион положительного контроля (PC), составленный с учетом пищевых потребностей бройлеров, и рацион отрицательного контроля (NC). Рацион NC был составлен с дефицитом усваиваемого фосфора (без неорганического фосфата, на 0,24% ниже, чем в PC), кальция (на 0,19% ниже, чем в PC), усваиваемых AA (на 0,04%, 0,03% и 0,03% ниже, чем в PC, для Lys, Met+Cys, Thr соответственно) и ME (на 69 ккал/кг ниже по сравнению с PC).

Эффективность PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 и PHY-13885 тестировали по отдельности в рационе NC в двух дозах - 500 или 1000 FTU/кг корма. Самцы цыплят-бройлеров (Ross 308) кормились одним и тем же престартерным рационом в возрасте от 0 до 5 дней и получали тестовые рационы в возрасте от 6 до 15 дней. Для изучения видов обработки рациона птиц случайным образом распределяли по девяти клеткам на каждый вид обработки с 8 птицами в каждой клетке. Основу рационов составляли маис, пшеница, соевая мука, рапсовая мука и рисовые отруби (ингредиенты рационов показаны в таблице 9).

Таблица 9. Состав, расчетные и проанализированные показатели питательных веществ в рационах (% от скармливаемого количества) Ингредиент, % Стартерный корм
(0-5 дней) Положительный контроль
(6-15 дней) Отрицательный контроль
(6-15 дней) Кукуруза 28,26 27,57 34,48 Пшеница 26 32 32 Соевая мука, 48% СР 29,95 21,79 19,4 Каноловая мука 3 6 6 Рисовые отруби 5 5 5 Растительный и животный жир 2,99 3,12 0,5 L-лизин-HCl 0,212 0,22 0,246 DL-метионин 0,361 0,289 0,276 L-триптофан 0,033 0,036 Соль 0,366 0,363 0,262 Известняк 1,84 1,57 1,51 Фосфат дикальция 1,27 1,3 0 Витаминно-микроэлементный премикс 0,25 0,25 0,25 Диоксид титана 0,5 0,5 0,5 Расчетные показатели питательных веществ ME, ккал/кг 2998 3025 2950 Сырой белок 22 20 19,33 Кальций 1 0,9 0,715 Общий фосфор 0,689 0,68 0,422 Доступный Р 0,45 0,45 0,209 Na 0,18 0,18 0,14 Усваиваемый Lys 1,27 1,1 1,06 Усваиваемый Met+Cys 0,94 0,84 0,81 Усваиваемый Thr 0,84 0,75 0,72 Проанализированные показатели питательных веществ ME*, ккал/кг н. о. 3022 2955 Сырой белок н. о. 19,46 18,77 Кальций н. о. 1,36 1,01 Общий фосфор н. о. 0,69 0,53 Na н. о. 0,208 0,164

н. о. означает, что значение не определено

*ME: метаболизируемая энергия

Показатели веса тела и потребление корма регистрировали в дни 6 и 15. В течение последних 4 дней экскременты собирали ежедневно, взвешивали и объединяли в пределах клеток. Объединенные экскременты по каждой клетке использовали для измерения удержания фосфора (P) в соответствии с официальным способом AOAC 965.17. В день 15 собирали правые большеберцовые кости у шести птиц в каждой клетке и использовали для измерения содержания золы в большеберцовой кости.

Данные анализировали с использованием ANOVA, средние значения по видам обработки разделяли с использованием критерия HSD Тьюки. Результаты с P < 0,05 считались статистически значимым различием. В таблице 10 показан эффект PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 и PHY-13885 в отношении продуктивности. Содержание золы в большеберцовой кости измеряли в возрасте 15 дней, а удержание фосфора измеряли у бройлеров в возрасте 11-15 дней. Все тестируемые фитазы - PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 и PHY-13885 - приводили к улучшению ADG, ADFI, содержания золы в большеберцовой кости и удержания фосфора у бройлеров по сравнению с NC.

Таблица 10. Показатели роста с 6 по 15 дни, содержание золы в большеберцовой кости в день 15, удержание фосфора с 11 по 15 дни у бройлеров, кормившихся рационами с добавлением фитаз PHY-13789, PHY-13637, PHY-14004 и PHY-13885 при 500 и 1000 FTU/кг Обработка Доза фитазы (FTU/кг) ADG (г) ADFI (г) FCR Содержание золы в большеберцовой кости,
день 15 Удержание P (% от потребляемого P) PC 0 34,7^a 44,9 ^a 1,292 ^b 43,9^abc 57,6^c NC 0 32,1^b 43,4 ^a 1,349 ^a 40,1^f 57,4^c NC+PHY-13789 500 33,9^a 44,1 ^a 1,303 ^b 42,0^e 66,2^b NC+PHY-13789 1000 34,9^a 44,6 ^a 1,280 ^b 43,7^abcd 77,7^a NC+PHY-13637 500 34,1 ^a 44,3 ^a 1,298 ^b 42,7^cde 67,6^b NC+PHY-13637 1000 34,9 ^a 44,4 ^a 1,272 ^b 44,0^abc 78,0^a NC+PHY-14004 500 33,6 ^a 43,8 ^a 1,304 ^b 42,8^bcde 68,5^b NC+PHY-14004 1000 34,5 ^a 44,3 ^a 1,281 ^b 44,2^a 78,3^a NC+PHY-13885 500 33,9 ^a 44,1 ^a 1,300 ^b 42,4^de 67,6^b NC+PHY-13885 1000 34,6 ^a 44,2 ^a 1,276 ^b 44,1^ab 78,6^a Статистические показатели SEM 0,289 0,515 0,010 0,299 0,716 P <.0001 0,7565 <.0001 <.0001 <.0001

^{a, b, c и т. д.:} разные верхние индексы в столбце указывают на значимые различия при P < 0,05

Фитаза PHY-13789 улучшала ADG на 5,4 и 8,4%, FCR на 3,4 и 5,1%, содержание золы в большеберцовой кости на 4,6 и 8,8%, удержание фосфора на 15,3 и 35,4% по сравнению с NC при добавлении в дозах 500 и 1000 FTU/кг соответственно. Фитаза PHY-13637 улучшала ADG на 6,1 и 8,6%, FCR на 3,8 и 5,7%, содержание золы в большеберцовой кости на 6,3 и 9,6%, удержание фосфора на 17,7 и 35,8% по сравнению с NC при добавлении в дозах 500 и 1000 FTU/кг соответственно. Фитаза PHY-14004 улучшала ADG на 4,5 и 7,5%, FCR на 3,3 и 5%, содержание золы в большеберцовой кости на 6,5 и 10,1%, удержание фосфора на 19,3 и 36,4% по сравнению с NC при добавлении в дозах 500 и 1000 FTU/кг соответственно. Фитаза PHY-13885 улучшала ADG на 5,6 и 7,8%, FCR на 3,6 и 5,4%, содержание золы в большеберцовой кости на 5,5 и 9,8%, удержание фосфора на 17,7 и 36,9% по сравнению с NC при добавлении в дозах 500 и 1000 FTU/кг соответственно. Полипептиды из клады фитаз с высокой Tm и их фрагменты в среднем улучшали ADG на 5,4 и 8,1%, FCR на 3,5 и 5,3%, содержание золы в большеберцовой кости на 5,7 и 9,6% и удержание фосфора на 17,5 и 36,1% по сравнению с NC. Эффективность всех фитаз во всех тестируемых дозах незначимо отличалась от PC в отношении ADG, ADFI и FCR, несмотря на значительное снижение содержания питательных веществ (полное удаление неорганического фосфора и снижение содержания Ca, усваиваемых AA и ME) в NC в этом испытании. Все фитазы характеризовались сходным содержанием золы в большеберцовой кости по сравнению с PC, за исключением PHY-13789 и PHY-13885 при 500 FTU/кг. Удержание фосфора в виде процентной доли от потребляемого P улучшалось при всех видах обработки фитазой по сравнению с PC. Результаты определения содержания золы в большеберцовой кости и удержания P подтверждают, что эти фитазы являются эффективными в высвобождении фосфора.

Результаты двух испытаний показывают, что все тестируемые полипептиды из клады фитаз с высокой Tm и их фрагменты обеспечивают значительное улучшение продуктивности животных.

ПРИМЕР 7

Идентификация новой клады ферментов фитаз

Полипептидные последовательности полипептидов из клады фитаз с высокой Tm и их фрагментов, показанных в примере 3, использовали для создания скрытой марковской модели (HMM) для определения сходства последовательностей. MUSCLE версии 3.8.31 (MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. R.C Edgar (2004) Nucleic Acid Res 32:1792) использовали для выравнивания последовательностей с использованием параметров по умолчанию. Затем использовали программное обеспечение для построения HMM HMMER версии 3.1 b1 (доступное на http://hmmer.org/) для создания HMM на основе множественного выравнивания последовательностей. Использовались всего два параметра: Предыдущие значения=Нет и Значения веса=Нет. Использовали следующую команду: /usr/bin/hmmbuild --pnone --wnone Variants_for_filing_draft_5.hmm Variants_for_filing_draft_5.fsa, при этом wnone=относительные значения веса отсутствуют (всем последовательностям присваивается единый вес), и pnone=не использовать никаких предыдущих значений, а параметры представляют собой частоты. Все параметры вероятности сохраняются в виде отрицательных натуральных логарифмов вероятности с округлением с точностью до пяти знаков справа от десятичной точки. Например, вероятность сохраняется как 0:25 log 0:25=1:38629. Особый случай нулевой вероятности сохраняется как символ *. На фигуре 1 (панели от A до 1BB) показаны баллы вероятности согласно HMM для каждого положения вдоль полипептидной последовательности фитаз из клады фитаз с высокой Tm. Совокупные баллы (COMP) для HMM показаны жирным шрифтом на верхних 3 панелях фигуры 1A. Положение (P) и консенсусный остаток (C) для каждой аминокислоты показаны в столбце 1 под P/C. Консенсусную последовательность полипептида фитазы из клады фитаз с высокой Tm строили на основе HMM, показанной на фигуре 1, и указывали под SEQ ID NO: 64.

Затем HMM использовали для получения баллов последовательностей согласно HMM для глобального множества из примерно 7000 уникальных фитаз, которое включало последовательности фитаз, доступные в общедоступных базах данных и патентах. Корреляцию рангов и баллов последовательностей с термостабильностью (Tunfold и Tm, определенными с помощью DSC) сравнивали для различных последовательностей (данные не показаны). Исходя из этого анализа, все новые полипептиды из клады фитаз с высокой Tm имеют баллы последовательности согласно НММ, составляющие более 1200, как проиллюстрировано на примере в таблице 11 для фитаз, перечисленных в таблицах 3А и 3В.

Таблица 11. Баллы последовательностей, полученные на основе HMM для иллюстративных фитаз из клады фитаз с высокой Tm ID образца Балл последовательности согласно HMM PHY-13594 1670 PHY-13885 1665 PHY-14945 1657 PHY-14277 1656 PHY-13637 1654 PHY-13705 1653 PHY-13779 1653 PHY-14614 1653 PHY-13789 1651 PHY-13936 1650 PHY-14256 1649 PHY-13371 1648 PHY-11895 1648 PHY-14004 1647 PHY-13713 1646 PHY-12663 1646 PHY-14804 1646 PHY-13460 1645 PHY-10957 1645 PHY-11658 1644 PHY-13177 1643 PHY-12058 1642 PHY-13798 1642 PHY-13883 1642 PHY-11932 1639 PHY-10931 1637 PHY-13747 1633 PHY-14473 1629 PHY-13513 1628 PHY-11569 1627 PHY-12784 1623 PHY-11673 1615 PHY-13868 1604 PHY-11680 1537 PHY-14215 1499 PHY-15459 1330 PHY-16513 1221 PHY-16812 1676 PHY-17403 1664 PHY-17336 1667 PHY-17225 1654 PHY-17186 1649 PHY-17195 1652 PHY-17124 1629 PHY-17189 1650 PHY-17218 1652 PHY-17219 1650 PHY-17204 1648 PHY-17215 1651 PHY-17201 1615 PHY-17205 1649 PHY-17224 1651 PHY-17200 1656 PHY-17198 1653 PHY-17199 1614 PHY-17214 1651 PHY-17197 1647 PHY-17228 1653 PHY-17229 1612 PHY-17152 1625 PHY-17206 1649

Множественное выравнивание последовательностей для предсказанных зрелых последовательностей ферментов из клады фитаз с высокой Tm, перечисленных в таблице 11: [PHY-13594 (SEQ ID NO: 1); PHY-10931 (SEQ ID NO: 2); PHY-10957 (SEQ ID NO: 3); PHY-11569 (SEQ ID NO: 4); PHY-11658 (SEQ ID NO: 5); PHY-11673 (SEQ ID NO: 6); PHY-11680 (SEQ ID NO: 7); PHY-11895 (SEQ ID NO: 8); PHY-11932 (SEQ ID NO: 9); PHY-12058 (SEQ ID NO: 10); PHY-12663 (SEQ ID NO: 11); PHY-12784 (SEQ ID NO: 12); PHY-13177 (SEQ ID NO: 13); PHY-13371 (SEQ ID NO: 14); PHY-13460 (SEQ ID NO: 15); PHY-13513 (SEQ ID NO: 16); PHY-13637 (SEQ ID NO: 17); PHY-13705 (SEQ ID NO: 18); PHY-13713 (SEQ ID NO: 19); PHY-13747 (SEQ ID NO: 20); PHY-13779 (SEQ ID NO: 21); PHY-13789 (SEQ ID NO: 22); PHY-13798 (SEQ ID NO: 23); PHY-13868 (SEQ ID NO: 24); PHY-13883 (SEQ ID NO: 25); PHY-13885 (SEQ ID NO: 26); PHY-13936 (SEQ ID NO: 27); PHY-14004 (SEQ ID NO: 28); PHY-14215 (SEQ ID NO: 29); PHY-14256 (SEQ ID NO: 30); PHY-14277 (SEQ ID NO: 31); PHY-14473 (SEQ ID NO: 32); PHY-14614 (SEQ ID NO: 33); PHY-14804 (SEQ ID NO: 34); PHY-14945 (SEQ ID NO: 35); PHY-15459 (SEQ ID NO: 36); PHY-16513 (SEQ ID NO: 37)]; PHY-16812 (SEQ ID NO: 64); PHY-17403 (SEQ ID NO: 65); PHY-17336 (SEQ ID NO: 66); PHY-17225 (SEQ ID NO: 67); PHY-17186 (SEQ ID NO: 68); PHY-17195 (SEQ ID NO: 69); PHY-17124 (SEQ ID NO: 70); PHY-17189 (SEQ ID NO: 71); PHY-17218 (SEQ ID NO: 72); PHY-17219 (SEQ ID NO: 73); PHY-17204 (SEQ ID NO: 74); PHY-17215 (SEQ ID NO: 75); PHY-17201 (SEQ ID NO: 76); PHY-17205 (SEQ ID NO: 77); PHY-17224 (SEQ ID NO: 78); PHY-17200 (SEQ ID NO: 79); PHY-17198 (SEQ ID NO: 80); PHY-17199 (SEQ ID NO: 81); PHY-17214 (SEQ ID NO: 82); PHY-17197 (SEQ ID NO: 83); PHY-17228 (SEQ ID NO: 84); PHY-17229 (SEQ ID NO: 85); PHY-17152 (SEQ ID NO: 86); и PHY-17206 (SEQ ID NO: 87), с публично раскрытыми микробными фитазами [WP 064555343.1 Buttiauxella noackiae (SEQ ID NO: 38); AAS45884.1 Citrobacter braakii (SEQ ID NO: 39); RDH40465.1 бактерии Coxiellaceae (SEQ ID NO: 40); WP 094337278.1 Enterobacteriaceae (SEQ ID NO: 41); WP 001297112 Escherichia coli (SEQ ID NO: 42); WP 072307456.1 Hafnia alvei (SEQ ID NO: 43); WP 084912871.1 Rouxiella badensis (SEQ ID NO: 44); WP 009636981.1 Serratia sp. (SEQ ID NO: 45); WP 004701026.1 Yersinia aldovae (SEQ ID NO: 46); WP 050140790.1 Yersinia frederiksenii (SEQ ID NO: 47); WP 004392102.1 Yersinia kristensenii (SEQ ID NO: 48); WP 049646723.1 Yersinia mollaretii (SEQ ID NO: 49); WP 050539947.1 Yersinia rohdei (SEQ ID NO: 50); фитазой APPM из EP3222714-0003 (SEQ ID NO: 51); US8101391-0002 (SEQ ID NO: 52); US8101391-0004 (SEQ ID NO: 53); US8101391-0035 (SEQ ID NO: 54); US8101391-0049 (SEQ ID NO: 55); US8143046-0001 (SEQ ID NO: 56); US8143046-0003 (SEQ ID NO: 57); US8460656-0002 (SEQ ID NO: 58); US8557555-0013 (SEQ ID NO: 59); US8557555-0024 (SEQ ID NO: 60); US20160083700-0003 (SEQ ID NO: 61); WO2010034835-0002 (SEQ ID NO: 62)] осуществляли с помощью выравнивания MAFFT в Geneious® версии 10.2.4. На основе этого выравнивания последовательностей MAFFT создавали филогенетическое дерево, показывающее родство между последовательностями, с использованием Geneious Tree Builder в Geneious® версии 10.2.4, которое показано на фигуре 2.

ПРИМЕР 8

Оценка ферментов фитаз у птиц in vivo

В этом примере оценивали полезность иллюстративной биосинтетической бактериальной 6-фитазы, продуцируемой генно-инженерным штаммом Trichoderma reesei, при добавлении к базовому рациону со сниженным содержанием Ca и P по содержанию золы в большеберцовой кости бройлеров и усвояемости P в подвздошной кишке (AID P) по сравнению с рационом с достаточным содержанием питательных веществ без добавок. Кроме того, проводили наблюдения за потреблением корма, показателями роста и конверсией корма.

Материалы и способы

Экспериментальные и контрольные рационы. Рационы положительного контроля (PC) на основе кукурузы и соевой муки составляли таким образом, чтобы удовлетворять рекомендуемые потребности в питательных веществах (с достаточным содержанием P и Ca) для птиц в ходе стартерной (дни 1-21) и финишной фаз (дни 22-42) [National Research Council. Nutrient Requirements of Poultry. 9th rev. ed. Natl Acad Press, Washington, DC; 1994]. Рационы отрицательного контроля (NC) составляли с показателями снижения содержания кальция (Ca) и доступного фосфора (P), составляющими 2,0 г/кг и 1,9 г/кг в рационах для стартерной фазы и 2,0 г/кг и 1,8 г/кг в рационах для финишной фазы соответственно. См. таблицу 12. Все стартерные рационы содержали диоксид титана (добавленный в количестве 4 г/кг) в качестве неперевариваемого маркера. Рационы отрицательного контроля тестировали в виде самостоятельных рационов или с добавлением 250, 500 или 1000 FTU/кг биосинтетической бактериальной 6-фитазы, продуцируемой генно-инженерным штаммом Trichoderma reesei. Рационы предоставляли птицам ad libitum в виде мешанки.

Таблица 12. Состав ингредиентов и питательных веществ (г/кг, в расчете на скармливаемое количество) рационов отрицательного контроля (NC) и положительного контроля (PC) в стартерной (дни 0-21) и финишной (дни 22-42) фазах Стартерная фаза (дни 0-21) Финишная фаза (дни 22-42) Ингредиент (г/кг) PC NC PC NC Маис 526 549 627 646 Соевая мука (48% СР) 338 333,5 242 240,5 Каноловая мука 50 50 50 50 Соевое масло 38,9 31,0 43,3 36,1 Фосфат монокальция 14,9 5,55 10,8 2,15 Известняк 15,3 14,0 15,4 13,8 Бикарбонат натрия - - 2,00 2,00 Соль 4,70 4,75 2,78 2,80 DL-метионин 2,83 2,80 2,03 2,00 Лизин-HCL 2,13 2,20 1,78 1,80 L-треонин 0,80 0,80 0,60 0,60 Диоксид титана 4,00 4,00 - - Минеральный премикс для домашней птицы 0,35 0,35 0,35 0,35 Витаминный премикс для домашней птицы 2,00 2,00 2,00 2,00 Расчетные показатели питательных веществ (г/кг) Сухое вещество 882,73 880,59 883,353 881,48 Сырой белок 217,61 217,42 180,83 181,65 Сырые волокна 16,38 16,67 15,98 16,27 Общий кальций 9,99 8,00 9,01 6,99 Общий фосфор 7,15 5,22 5,95 4,18 Доступный фосфор 4,5 2,56 3,50 1,70 Метаболизируемая энергия (ME) (ккал/кг) 3024,94 3025,25 3174,97 3174,90 Доступный метионин 5,87 5,85 4,67 4,67 Доступные общие серосодержащие аминокислоты 9,00 8,99 7,40 7,41 Доступный лизин 12,00 11,99 9,49 9,51 Доступный триптофан 2,09 2,08 1,62 1,62 Доступный треонин 7,91 7,89 6,45 6,47 Доступный аргинин 13,03 12,97 10,45 10,46 Доступный валин 9,00 9,00 7,53 7,57

Птицы, содержание и план эксперимента. 500 цыплят-бройлеров Cobb разных полов (50% самцов, 50% самок) получали в день вылупления из коммерческого инкубатория, где их вакцинировали против инфекционного бронхита и болезни Ньюкасла с питьевой водой. Вакцинацию против инфекционного бурсита проводили в дни 11-14 также с питьевой водой. Птиц распределяли в загоны для напольного содержания по исходному весу тела (BW), так что в каждом загоне находились птицы, имеющие примерно равный вес тела. В общей сложности 1176 птиц распределяли в 49 загонов по 24 птицы в загоне - 9 загонов для NC и по 10 загонов для всех других видов обработки, при этом каждый загон содержал 50% самцов и 50% самок, согласно полностью рандомизированному плану. Загоны находились в бройлерном птичнике с контролируемыми условиями среды с режимом освещения LD 18:6 и начальной температурой 35°C, снижающейся до 24°C в день 28.

Отбор образцов и измерения. Иллюстративные подвыборки всех рационов анализировали в отношении содержания сухого вещества (DM), сырого белка (CP), сырого жира (CF), золы, Р, калия (K), магния (Mg), Ca, натрия (Na), фитата и фитазы.

Вес тела и потребление корма (FI) измеряли в дни 1, 21 и 42 в загоне и использовали для расчета BW, среднесуточного прироста веса (ADG), среднесуточного потребления корма (ADFI) и коэффициента конверсии корма, скорректированного по смертности (FCR). Смертность проверяли и регистрировали ежедневно.

В дни 21 и 42 4 птиц (2 самцов, 2 самок, пол определялся в момент отбора образца) и 6 птиц (3 самцов и 3 самок) соответственно случайным образом выбирали в каждом загоне, умерщвляли газообразным CO₂, и их левые большеберцовые кости собирали и объединяли (по загонам) для определения содержания золы в обезжиренной большеберцовой кости. Переваренное содержимое подвздошной кишки собирали у подвергнутых эвтаназии птиц в день 21, объединяли по каждому загону и замораживали в машине для дегидратации Labconco FreeZone 12+ (Labconco, Канзас-Сити, Миссури). Образцы высушенного корма и переваренного содержимого анализировали в отношении содержания P и Ca, чтобы рассчитать усвояемость питательных веществ, с использованием диоксида титана в качестве инертного маркера.

Химический анализ. Во всех анализах образцы анализировали в двух повторностях. Питательные вещества в корме и переваренном содержимом подвздошной кишки анализировали в соответствии со следующими способами: сырой белок - NEN-EN-ISO 16634 [NEN-ISO 6492, en. Animal feedstuffs - Determination of fat content. International Organization for Standardization, Switzerland; 1999]; сырой жир - NEN-ISO 6492 [NEN-ISO 6865, en. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. International Organization for Standardization, Switzerland; 2000]; сырые волокна - NEN-ISO 6865 [NEN-EN-ISO 16634, en. Animal Feeding Stuff - Determination of Nitrogen Content using Dumas combustion. International Organization for Standardization, Switzerland; 2008]. Фосфор, Ca, магний, калий и натрий в корме и P и Ca в переваренном содержимом анализировали с помощью микроволнового разложения и оптико-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (OES) в соответствии со способом AOAC 2011.14 [AOAC International. Method 2011.14: Calcium, Copper, Iron, Magnesium, Manganese, Potassium, Phosphorus, Sodium, and Zinc in Fortified Food Products. Official Methods of Analysis of AOAC International; 2011]. Концентрации фитатного фосфора (PP [гексафосфата инозитола (IP6)]) в рационах и показатели фитазной активности в рационах определяли в DuPont Laboratories (Брабранд, Дания) с помощью способов, описанных в Yu et al. [Yu, S, Cowieson, A, Gilbert, C, Plumstead, P, Dalsgaard, S. Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin. J Anim Sci 2012;90:1824-1832]. Одну фитазную единицу (FTU) определяли как количество фермента, которое приводит к высвобождению 1 мкмоль неорганического ортофосфата из субстрата, представляющего собой фитат натрия, в минуту при pH 5,5 и 37°C [AOAC International. Method 2000.12: Phytase activity in feed: Colorimetric enzymatic method. Official Methods of Analysis of AOAC International. 17th edition; Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA; 2000].

Содержание золы в большеберцовой кости измеряли с помощью способа, описанного ниже: удаляли малоберцовые кости, мышечную и соединительную ткань, а кости высушивали при 100°C в течение по меньшей мере 12 часов перед обезжириванием в диэтиловом эфире в течение 7-8 часов и сушкой на воздухе. Обезжиренные большеберцовые кости вновь высушивали при 100°C в течение по меньшей мере 12 часов, а затем озоляли в керамических тиглях при 600°C в течение 24 часов.

Расчеты. Коэффициент конверсии корма (FCR) рассчитывали, исходя из общего BWG и общего потребления корма (скорректированного по весу смертности) в дни 0-21, дни 22-42 и дни 0-42. Как ADG, так и ADFI рассчитывали с корректировкой по смертности, например, ADFI рассчитывали по общему потреблению корма в каждой фазе, деленному на общее количество дней кормления. ADG, скорректированный по смертности, рассчитывали по ADFI, скорректированному по смертности, деленному на FCR, скорректированный по смертности.

Кажущуюся усвояемость P и Ca в подвздошной кишке (AID, %) рассчитывали по следующей формуле с использованием диоксида титана в качестве инертного маркера:

AID=1 - [(Ti_d/Ti_i) × (N_i/ N_d)],

где Ti_d означает концентрацию титана в рационе, Ti_i означает концентрацию титана в переваренном содержимом подвздошной кишки, N_i означает концентрацию питательных веществ (P или Ca) в переваренном содержимом подвздошной кишки, и N_d означает концентрацию питательных веществ в рационе. Все проанализированные значения выражали в граммах на килограмм сухого вещества.

Статистический анализ. Данные представлены по загонам в качестве экспериментальных единиц. Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием платформы Fit Model JMP 14.0 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, 1989-2019) для исследования эффекта видов обработки при рандомизированном плане. Разделение средних значений осуществляли с использованием критерия действительно значимого различия Тьюки. Линейный и квадратичный ответ при увеличении дозы фитазы анализировали с использованием ортогональных полиномов. Различия считали статистически значимыми при P < 0,05; при P < 0,10 считали тенденцией.

Результаты

Анализ рационов. Анализ показателей фитазной активности в конечных рационах подтвердил целевые уровни доз (таблица 13). Проанализированные значения CP в базовых (контрольных) рационах находились в пределах 10% от расчетных значений. Достигнутые показатели снижения содержания Р в рационах NC вполне соответствовали целевым показателям снижения; согласно проанализированным значениям общее содержание Р снижалось на 1,8 г/кг в стартерных и 2,3 г/кг в финишных рационах.

Таблица 13. Проанализированные значения содержания питательных веществ (г/кг) в конечных рационах по фазам Стартерная фаза (0-21 день) Финишная фаза (22-42 дня) Ингредиент PC NC* PC NC* Сухое вещество 886 883 889 886 Сырой белок 221 228 186 184 Сырой жир 59,8 54,3 62,2 62,0 Зола 58,8 44,4 51,4 43,6 Фитат 8,32 8,38 8,70 9,09 Фитат-P 2,35 2,4 2,45 2,56 Фосфор 7,1 5,3 7,0 4,8 Калий 10,1 10,1 9,6 9,0 Магний 1,9 1,9 1,8 1,7 Кальций 10,3 8,6 10,4 8,0

*Значения представляют собой средние значения для видов обработки NC и NC+фитаза, поскольку была получена одна партия базового рациона NC.

Проанализированная фитазная активность (FTU/кг) составляла 43, 24, 282, 480, 882 в стартерной фазе и < 50, < 50, 253, 594, 1110 в финишной фазе для PC, NC, NC+250 FTU/кг, NC+500 FTU/кг и NC+1000 FTU/кг соответственно. Фитазную активность в рационах анализировали в Технической службе производства кормов DuPont, Брабранд, Дания.

Усвояемость питательных веществ. AID P не была значимо снижена у птиц, кормившихся рационами NC по сравнению с PC (таблица 14). При уровне дозы 500 FTU/кг или выше добавление фитазы приводило к увеличению AID P по сравнению с NC, а при 1000 FTU/кг фитаза улучшала AID P по сравнению с РC (P < 0,05). Выраженная в единицах г/кг, усвояемость P в подвздошной кишке в рационах улучшалась благодаря фитазе при добавлении ее в дозах 500 FTU/кг или выше (+ 1,39 г/кг по сравнению с NC при 500 FTU/кг и+1,76 г/кг по сравнению с NC при 1000 FTU/кг; P < 0,05). При этих уровнях доз усвояемость P, выраженная в г/кг в рационе, была эквивалентной таковой в рационе PC. На AID Ca не влияла обработка рациона, но для нее наблюдалась тенденция к линейному увеличению (P < 0,10) с увеличением дозы фитазы от 0 до 1000 FTU/кг.

Таблица 14. Эффект экспериментальной фитазы в отношении кажущейся усвояемости P и Ca в подвздошной кишке (AID) у бройлеров и усвояемости Р в рационах в г/кг в день 21 Измеряемые параметры PC NC NC+фитаза (FTU/кг)¹ SEM P-значение 250 500 1,000 AID P (%)² 50,1^bc 39,0^c 57,7^abc 65,2^ab 72,2^a 5,77 <0,001 AID Ca (%)² 40,2 39,2 47,0 51,1 55,3 4,93 0,240 Усвояемость P (г/кг рациона)² 3,55^a 2,06^b 3,06^ab 3,46^a 3,82^a 0,3 <0,001

¹Биосинтетическая бактериальная 6-фитаза, продуцируемая генетически модифицированным микроорганизмом Trichoderma reesei (T. reesei).

² Увеличение дозы фитазы с 0 (NC) до 1000 FTU/кг приводило к линейному и квадратичному увеличению AID P (P < 0,05) и почти значимому линейному увеличению в отношении Ca (P=0,052).

a, b, c - средние значения, полученные методом наименьших квадратов, в строке с разными буквами в верхнем регистре различаются (P < 0,05, критерий Тьюки).

Содержание золы в большеберцовой кости. Эффект обработки рациона в отношении содержания золы в большеберцовой кости характеризовался высокой значимостью (P < 0,001) и представлен в таблице 15. По сравнению с PC птицы, кормившиеся рационом NC, продемонстрировали снижение содержания золы в большеберцовой кости в день 21 и в день 42 (-6,7 и -4,1 процента соответственно; P < 0,05). По сравнению с NC добавление фитазы приводило к улучшению содержания золы в большеберцовой кости в образцах, отобранных как в день 21, так и в день 42, при всех трех уровнях доз (P < 0,05); содержание золы в большеберцовой кости при всех обработках фитазой было эквивалентным PC.

Таблица 15. Эффект экспериментальной фитазы в отношении показателей роста и содержания золы в большеберцовой кости у бройлеров по фазам^1,2 PC NC NC+фитаза (FTU/кг)³ SEM P-значение 250 500 1,000 Стартерная фаза (дни 0-21) BW в день 21 (кг/птица) 0,90^a 0,71^b 0,86^a 0,88^a 0,89^a 0,010 <0,001 ADFI (г/день) 56,6^a 46,3^b 54,1^a 54,3^a 55,4^a 0,764 <0,001 ADG (г/день) 40,6^ab 31,7^c 39,0^b 39,5^ab 40,8^a 0,431 <0,001 FCR (г/г) 1,396^ab 1,460^a 1,390^b 1,377^b 1,358^b 0,016 <0,01 Содержание золы в большеберцовой кости в день 21 (% DM) 50,4^a 43,7^b 49,3^a 49,9^a 50,9^a 0,463 <0,001 Финишная фаза (дни 22-42) BW в день 42 (кг/птица) 2,70^a 1,85^b 2,64^a 2,70^a 2,74^a 0,031 <0,001 ADFI (г/день) 157,7^a 121,5^b 154,4^a 156,1^a 156,0^a 1,89 <0,001 ADG (г/день) 86,9^a 58,2^b 84,7^a 87,2^a 87,8^a 1,135 <0,001 FCR (г/г) 1,815^b 2,093^a 1,823^b 1,792^b 1,779^b 0,029 <0,001 Содержание золы в большеберцовой кости в день 42 (% DM) 46,4^a 42,3^b 46,5^a 46,5^a 47,0^a 0,70 <0,001 Общие показатели (дни 0-42) ADFI (г/день) 118,3^a 92,9^b 115,1^a 116,4^a 116,7^a 1,186 <0,001 ADG (г/день) 71,3^ab 50,6^c 69,1^b 70,9^ab 71,8^a 0,648 <0,001 FCR (г/г) 1,661^b 1,835^a 1,666^b 1,643^b 1,626^b 0,019 <0,001

¹ Все данные о продуктивности скорректированы по смертности

² Увеличение дозы фитазы с 0 (NC) до 1000 FTU/кг приводило к линейному и квадратичному увеличению всех измеряемых параметров (P < 0,05)

³ Биосинтетическая бактериальная 6-фитаза, продуцируемая генетически модифицированным микроорганизмом Trichoderma reesei (T. reesei).

a, b, c - средние значения, полученные методом наименьших квадратов, в строке с разными буквами в верхнем регистре различаются (P < 0,05, критерий Тьюки).

Потребление корма и показатели роста. Эффект обработки рациона в отношении потребления корма, веса тела и конверсии корма также представлен в таблице 15. Обработка влияла на все меры ответа во всех фазах роста (стартерной, финишной, в целом; P < 0,01 во всех случаях). Значимые различия в отношении смертности не наблюдались (данные не показаны).

По сравнению с PC птицы, кормившиеся рационом NC, демонстрировали сниженный BW в день 21 и день 42, увеличенный FCR в течение финишной фазы и в целом и сниженные ADG и ADFI в течение всех фаз (P < 0,05).

Добавление экспериментальной фитазы при любом уровне дозы позволяло птицам преодолеть дефицит P в рационах NC с улучшением ADFI, BW и ADG, а также FCR в течение всех фаз (P < 0,05), так что они были эквивалентными PC в течение всех фаз независимо от дозы фитазы. Уровень дозы экспериментальной фитазы 1000 FTU/кг приводил к получению птиц со средним BW в день 42, составляющим 2,74 кг, и средним общим FCR, составляющим 1,626 (по сравнению с 1,661 в случае с PC).

В заключение, это исследование продемонстрировало, что экспериментальная вариантная фитаза была эффективной при поддержании показателей роста, содержания золы в большеберцовой кости и усвояемости Р в подвздошной кишке, эквивалентных рациону с достаточным содержанием питательных веществ, при добавлении в рационы, составленные со снижением содержания неорганического P из MCP на 1,8-1,9 г/кг, и введении при уровнях доз от 250 до 1000 FTU/кг. Благоприятные эффекты были наибольшими при 1000 FTU/кг. Значение замещения фосфора из фосфата монокальция согласно оценкам составляло 1,64 и 2,07 грамма на килограмм рациона соответственно при 500 и 1000 FTU/кг (что равнялось 1,39 и 1,76 г/кг усваиваемого Р из MCP) согласно наблюдаемому увеличению содержания усваиваемого фосфора.

ПРИМЕР 9

Оценка ферментов фитаз у свиней in vivo

Целью этого исследования была оценка эффективности добавления в рацион иллюстративной экспериментальной биосинтетической бактериальной 6-фитазы у поросят-отъемышей, кормившихся рационом на основе кукурузно-соевой муки без добавления неорганического фосфата по сравнению с добавлением неорганического P из MCP, в отношении содержания золы и минерализации в большеберцовой кости и в отношении показателей роста. Существующую коммерческую фитазу включали в исследование для целей сравнения. Вторая цель заключалась в том, чтобы определить значение эквивалентности фитазы усваиваемому P в тестируемых условиях.

Материалы и способы

Экспериментальные и контрольные рационы. Рацион положительного контроля (PC) на основе кукурузы и SBM составляли для удовлетворения пищевых потребностей поросят весом от 10 до 25 кг (NRC, 2012), и он содержал 2,9 г/кг усваиваемого P и 7,0 г/кг Ca (таблица 16). Рацион отрицательного контроля (NC) составляли без неорганического фосфата (1,1 г/кг усваиваемого P) и со сниженным содержанием Ca (5,0 г/кг). NC тестировали в виде самостоятельного рациона, а также при добавлении к рациону 500 или 1000 FTU/кг коммерческой фитазы, 250, 500 или 1000 FTU/кг экспериментальной фитазы или при добавлении MCP при 3 уровнях (+ 0,7, + 1,4 и+1,8 г/кг усваиваемого Р из MCP), что соответствовало содержанию усваиваемого Р, составляющему 1,8, 2,5 и 2,9 г/кг (последнее представлено в рационе PC). Это давало в общей сложности 9 видов обработки рационов. В рационы с добавлением MCP добавляли дополнительный известняк, чтобы поддерживать соотношение Ca и P в диапазоне от 1,2 до 1,3 (таблица 16). Коммерческая фитаза представляла собой микробную 6-фитазу из Buttiauxella sp., экспрессируемую в Trichoderma reesei (Axtra® PHY, DuPont Nutrition and Biosciences) и описанную в данном документе как PhyB. Экспериментальная фитаза представляла собой биосинтетическую бактериальную фитазу, описанную в данном документе как PhyX. PhyX продуцируется в результате ферментации грибным штаммом-продуцентом (Trichoderma reesei), который экспрессирует биосинтетический вариант консенсусного гена бактериальной фитазы, собранного посредством предковой реконструкции со смещением последовательности для Buttiauxella sp. (DuPont Nutrition and Biosciences). Рационы предоставляли поросятам ad libitum в виде мешанки, а вода была в свободном доступе.

Таблица 16. Состав ингредиентов и питательных веществ (г/кг, в расчете на скармливаемое количество) рационов отрицательного контроля (NC) и NC с повышенным уровнем усваиваемого Р из включенного MCP, скармливаемых поросятам-отъемышам (в возрасте 42-70 дней) NC NC+усваиваемый P из MCP (г/кг) 0,7 1,4 1,8 (PC) Ингредиент (г/кг) Кукуруза 400 400 400 400 Соевая мука (48% СР) 293,35 292,85 292,65 292,65 Рис 150 150 150 150 Рисовые отруби 50,0 50,0 50,0 50,0 Жом сахарной свеклы 30,0 30,0 30,0 30,0 Животный жир 36,7 36,7 36,7 36,7 Фосфат монокальция (MCP) - 3,30 6,70 8,80 Карбонат кальция 6,70 7,40 8,20 8,60 Соль 4,10 4,10 4,10 4,10 L-лизин-HCl 4,00 4,00 4,00 4,00 DL-метионин 1,70 1,70 1,70 1,70 L-треонин 1,50 1,50 1,50 1,50 L-триптофан 0,50 0,50 0,50 0,50 Noxyfeed¹ 0,20 0,20 0,20 0,20 Диоксид титана 5,00 5,00 5,00 5,00 Наполнитель (диатомовая земля) 10,0 6,50 2,50 - Витаминно-минеральный премикс² 6,00 6,00 6,00 6,00 Тестируемый продукт с носителем³ 0,25 0,25 0,25 0,25 Расчетные показатели питательных веществ (г/кг) Метаболизируемая энергия (ME) (Мкал/кг) 3,35 3,35 3,35 3,35 Чистая энергия (NE) (Mкал/кг) 2,52 2,52 2,52 2,52 Сырой белок 194 194 194 194 Эфирный экстракт 63,3 63,3 63,2 63,2 Общий кальций 5,00 5,75 6,53 7,00 Общий фосфор 4,00 4,76 5,53 6,00 Усваиваемый фосфор 1,06 1,76 2,46 2,90 Нефитатный фосфор 1,28 2,00 2,80 3,30 Общий лизин 13,4 13,4 13,4 13,4 Лизин SID⁴ 12,3 12,3 12,3 12,3 Треонин SID 7,70 7,70 7,70 7,70 Метионин SID 4,43 4,43 4,43 4,43 Триптофан SID 2,42 2,42 2,42 2,42

¹ Антиоксидант, содержащий BHT, пропилгаллат и лимонную кислоту.

²Предоставляемые на килограмм рациона: железо (из FeSO₄⋅H₂O) - 120 мг; йод (из Ca(IO₃)₂) - 0,75 мг; кобальт (из 2CoCO₃⋅3Co(OH)₂⋅H₂O) - 0,6 мг; медь (из CuSO₄⋅5H₂O) - 6 мг; марганец (из MnO) - 60 мг; цинк (из ZnO) - 100 мг; селен (E8) (из Na₂SeO₃) - 0,37 мг; витамин A - 10000 МЕ; витамин D3-2000 МЕ; витамин E (альфа-токоферол) - 25 мг; витамин B1-1,5 мг; витамин B2-3,5 мг; витамин B6-2,4 мг; витамин B12-20 мкг; витамин K3-1,5 мг; пантотенат кальция - 14 мг; никотиновая кислота - 20 мг; фолиевая кислота - 0,5 мг; биотин - 50 мкг.

³Тестируемый продукт смешивают с носителем на основе пшеницы для получения целевой дозы, в группе контрольной обработки животные получают только носитель без тестируемого продукта.

⁴SID=со стандартизированной усвояемостью в подвздошной кишке.

Свиньи, содержание и план эксперимента. Экспериментальные процедуры соответствовали Европейской директиве 2010/63/EU и Руководящим принципам Испании по уходу за животными и их использованию в исследованиях (B.O.E. номер 252, Real Decreto 2010/2005). В общей сложности 162 поросят разных полов (50% самцов, 50% самок), полученных в результате скрещивания пород пьетрен x (крупная белая x ландрас), получали при отъеме в возрасте 21 день (исходный вес тела (BW) 6 ± 1 кг), и им скармливали обычный престартерный адаптационный рацион до достижения возраста 42 дней (BW ~ 10-11 кг). Затем поросят разделяли на блоки в зависимости от веса тела и пола и распределяли в загоны (по 2 свиньи на загон и 9 загонов на вид обработки) согласно полностью рандомизированному блочному плану. Тестовые рационы вводили свиньям от возраста 42 дней до возраста 70 дней. Загоны группировали друг с другом в помещении для животных с контролируемыми условиями среды, в котором температуру вначале поддерживали на уровне 30°C, а затем снижали на 1°C в неделю.

Отбор образцов и измерения. Иллюстративные подвыборки всех рационов анализировали в отношении содержания сухого вещества (DM), органического вещества (OM), сырого белка (CP), эфирного экстракта (EE), золы, минеральных веществ, фитата и фитазы.

Свиней взвешивали индивидуально перед началом эксперимента и повторно в дни 14 и 28 для расчета среднесуточного прироста (ADG). Расход корма оценивали в день 14 и день 28 и использовали для расчета среднесуточного потребления корма (ADFI). Коэффициент конверсии корма (FCR) рассчитывали из ADFI и ADG.

В день 28 испытания одного поросенка на загон подвергали эвтаназии путем передозировки при внутривенном введении пентобарбитала натрия, и иссекали правую стопу передней и задней конечности для определения содержания золы и минерализации (Ca и P) в пястных/плюсневых костях. Конечности хранили при -20ºC до проведения анализа.

Химический анализ. Все образцы анализировали в двух повторностях. Содержание сухого вещества, золы, CP и эфирного экстракта в корме анализировали в соответствии со способами AOAC (2000a) (925.09, 942.05, 968.06 и 920.39 соответственно). Содержание азота определяли посредством метода Дюма с помощью анализатора азота FP-528 (LECO Corp., Сент-Джозеф, Миссури, США). Содержание органического вещества (OM) рассчитывали в виде разницы между содержанием DM и золы. Анализ экзогенной фитазной активности в кормах выполняли согласно Engelen et al (1994). Одну фитазную единицу (FTU) определяли как количество фитазы, которое приводит к высвобождению 1 ммоль неорганического фосфата в минуту из 0,0051 моль/л фитата натрия при стандартном pH 5,5 и температуре 37°C (AOAC, 2000b).

Содержание золы в костях определяли в отношении как III/IV пястной кости, так и III/IV плюсневой кости правой передней и задней стопы соответственно. После извлечения кости сначала использовали для определения характеристик их целостности в испытании механических свойств по 3 точкам с использованием испытательной системы Instron (Норвуд, Массачусетс, США) модели 2519-106, оснащенной датчиком нагрузки на 2 кН. Биомеханические параметры, такие как внешняя жесткость, предельная сила, смещение и работа до разрушения, использовали для определения характеристик целостности костей (Turner, 2006). Затем кости использовали для определения содержания DM в них в печи при 103°C в течение 4 часов, а затем их сжигали в сушильной печи в течение 3 часов при 200°C перед их помещением в муфельную печь при 550°C в течение 72 часов и определением содержания золы в них. Золу пястных костей затем измельчали с помощью пестика и ступки и отправляли в лабораторию SCT (Университет Лериды, Испания) для определения содержания минеральных веществ (Ca, P, Mg) с помощью масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS; Agilent Technologies, модель 7700X) после разложения серной кислотой. Состав минеральных веществ (Ti, Ca, P, Mg, Fe, Zn и Cu) в кормах также анализировали в образцах золы с помощью ICP-MS в лаборатории SCT (Pacquette and Thompson, 2018).

Статистический анализ. Данные были представлены с использованием загона в качестве экспериментальной единицы, за исключением содержания золы в костях и прочности костей, которые были представлены с использованием свиньи в качестве экспериментальной единицы. Данные анализировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием платформы Fit Model JMP 14.0 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, 1989-2019) для исследования эффекта видов обработки при рандомизированном плане. Разделение средних значений осуществляли с использованием критерия действительно значимого различия Тьюки. Кроме того, проводили 2-факторный анализ ANOVA с факторами "фитаза" (PhyG в сравнении с PhyB) и "доза" (500 и 1000) для сравнения двух фитаз при двух уровнях доз 500 и 1000 FTU/кг. Линейный и квадратичный ответ при увеличении дозы фитазы анализировали с использованием ортогональных полиномов. Кроме того, проводили линейную регрессию с увеличением количества добавляемого усваиваемого P из MCP (например, NC, NC+0,7, NC+1,4 и NC+1,8 г/кг усваиваемого P из MCP) для содержания золы в пястных костях, ADG и FCR. Эквивалентность усваиваемому P рассчитывали, используя Y-значения для данной дозы фитазы и вычисляя соответствующие X-значения. Различия считали значимыми при P < 0,05; при P < 0,10 считали тенденцией.

Результаты

Анализ рационов. Проанализированные значения содержания питательных веществ в рационах представлены в таблице 17. Показатели фитазной активности в рационах NC составляли≤50 FTU/кг, что указывает на отсутствие перекрестного загрязнения фитазой. Показатели активности в рационах с добавлением фитазы находились в пределах 10% от целевых значений, за исключением обработки NC+PhyX 250 и NC+PhyX 500, при которых показатели активности составляли соответственно -20 и+27% по сравнению с целевой дозой. Проанализированное содержание P в рационах NC, содержащих добавленный P из MCP, было близким к ожидаемым значениям, определенным на основе предполагаемых уровней добавления MCP.

Содержание золы, минеральных веществ в костях и прочность костей. В возрасте 70 дней (день 28 эксперимента) содержание золы, Ca и P в пястных костях было снижено у поросят, кормившихся базовым рационом NC, по сравнению с PC (P < 0,05; таблица 18). Добавление обеих фитаз и при всех уровнях доз приводило к улучшению содержания золы в костях и Р в костях (%) по сравнению с NC (P < 0,05). При 500 и 1000 FTU/кг содержание золы в пястных костях и P в пястных костях было эквивалентно PC. Увеличение дозы PhyX с 0 (NC) до 1000 FTU/кг приводило к линейному и квадратичному увеличению содержания золы в пястных костях в день 28 (P < 0,05). Добавление фитазы не влияло на содержание Ca в пястных костях. Наблюдался линейный ответ в отношении содержания золы и P в пястных костях при увеличении уровней MCP-P в рационах (P < 0,05). Для содержания золы в плюсневых костях был продемонстрирован такой же ответ, как и для результатов исследования содержания золы в пястных костях.

Влияние видов обработки рациона на биомеханические параметры пястных костей представлено в таблице 18. Предельная сила (N) была более низкой для NC (P < 0,05) по сравнению со всеми другими видами обработки. Все виды обработки фитазой при всех уровнях доз приводили к улучшению предельной силы по сравнению с NC. Обе фитазы при 1000 FTU/кг поддерживали одинаковую предельную силу по сравнению с PC. Обе фитазы при 500 FTU и 1000 FTU улучшали жесткость (мПа) по сравнению с NC, а при 1000 FTU/кг поддерживали жесткость (мПа) и работу до разрушения (Дж) по сравнению с PC, который содержал дополнительно 1,8 г усваиваемого Р из MCP на кг рациона. При сравнении двух уровней доз для двух фитаз фитаза при 1000 FTU/кг демонстрировала более высокие показатели содержания золы в костях, предельной силы (N), жесткости (мПа) и работы до разрушения (Дж) по сравнению с 500 FTU/кг (P < 0,05). Взаимодействия между источником фитазы и уровнями доз обнаружено не было.

Показатели роста. Эффект обработки рациона в отношении показателей роста представлен в таблице 19. За исключением ADFI в течение дней 0-14 (тенденция, P=0,08), все меры ответа, относящиеся к показателям роста, ухудшались (ADG и ADFI снижались; FCR увеличивался) у поросят, кормившихся рационом NC, по сравнению с рационом PC (P < 0,05).

В течение первой фазы эксперимента (дни 0-14) как PhyX, так и PhyB при 1000 FTU/кг приводили к более высокому ADG и сниженному FCR (P < 0,05) по сравнению с NC и были эквивалентны рациону PC, содержащему 1,8 г/кг добавленного Р из MCP.

В течение второй фазы эксперимента (дни 15-28) PhyX в дозе 250 FTU/кг или выше улучшала ADG по сравнению с NC, а в дозе 500 FTU/кг или выше улучшала FCR по сравнению с NC (P < 0,05). PhyB также улучшала ADG и FCR по сравнению с NC при обоих уровнях доз (P < 0,05). В дозе 500 FTU/кг или выше обе фитазы давали значения ADG и FCR, эквивалентные PC, содержащему 1,8 г/кг добавленного P из MCP.

В течение полной фазы (дни 0-28) обе фитазы при всех уровнях доз улучшали ADG по сравнению с NC, и обе фитазы улучшали FCR по сравнению с NC в дозе 500 FTU/кг или больше (P < 0,05). Для любой фитазы в дозе 500 FTU/кг или выше ADG и FCR были эквивалентны PC, содержащему 1,8 г/кг добавленного P из MCP. Кроме того, увеличение дозы PhyX с 0 до 1000 FTU/кг приводило к линейному и квадратичному увеличению ADG и снижению FCR в течение полной фазы (P < 0,05). Для ADG и FCR наблюдался линейный ответ при увеличении уровней МСР-Р в рационе (P < 0,05). При сравнении двух уровней доз для двух фитаз FCR был ниже при 1000 FTU/кг по сравнению с 500 FTU/кг (1,59 по сравнению с 1,66, P < 0,05). Наблюдалась тенденция к более высокому ADG при 1000 FTU/кг по сравнению с 500 FTU/кг (635 по сравнению с 590, P=0,08), и не было обнаружено различий в потреблении корма (данные не показаны). Взаимодействия между источником фитазы и уровнями доз обнаружено не было.

Эквивалентность неорганическому P. Значения эквивалентности усваиваемому пищевому Р (г/кг рациона) для PhyX и PhyB рассчитывали, исходя из содержания золы в костях, ADG и FCR в качестве параметров ответа, используя наблюдаемые ответы на увеличение содержания усваиваемого Р из MCP в качестве эталона. Ответы на увеличение содержания усваиваемого Р из MCP были линейными и положительными по всем трем мерам ответа (P < 0,001; таблица 20). Независимо от используемого параметра ответа расчетные значения эквивалентности усваиваемому P увеличивались с увеличением дозы фитазы и были наиболее высокими при 1000 FTU/кг (таблица 20). При этом уровне дозы значения эквивалентности усваиваемому P были более высокими для PhyX, чем для PhyB (среднее значение по параметрам ответа составляло 1,83 г/кг по сравнению с 1,66 г/кг соответственно), и были наиболее высокими для ADG и наиболее низкими для содержания золы в костях в качестве параметра ответа.

Таблица 20. Линейный регрессионный анализ содержания золы в костях, ADG, FCR в ответ на увеличение содержания усваиваемого фосфора из MCP^1,2

a b R² P-значение Содержание золы в пястных костях 25,0 4,27 0,99 < 0,001 ADG 465,9 83,5 0,97 < 0,001 FCR 1,9 -0,17 0,98 < 0,001

¹ Проводили линейную регрессию с увеличением количества добавляемого усваиваемого Р из MCP (например, NC, NC+0,7, NC+1,4 и NC+1,8 г/кг усваиваемого Р из MCP) в отношении содержания золы в пястных костях, ADG и FCR с использованием уравнения Y=a+bX, где Y представляет собой параметры ответа, а X представляет собой увеличивающееся количество добавляемого усваиваемого P из MCP.

² R² получен на основе регрессии из средних значений по видам обработки. Эквивалентность усваиваемому P рассчитывали, используя значения параметров ответа (Y, например, содержания золы в костях) для данной дозы фитазы и вычисляя соответствующие значения замещения MCP-P (X).

В заключение, это исследование показало, что экспериментальная фитаза (PhyX) была эффективной при поддержании содержания золы в пястных костях поросят, содержания P в костях и показателей роста, эквивалентных рациону с достаточным содержанием питательных веществ (содержащему 2,9 г/кг усваиваемого P, с 1,8 г/кг усваиваемого P из MCP), при добавлении к рациону на основе кукурузно-соевой муки без добавления неорганического P при уровне дозы 500 или 1000 FTU/кг. Ответы были наибольшими при уровне дозы 1000 FTU/кг, при котором согласно оценкам экспериментальная фитаза могла замещать примерно 1,83 г/кг усваиваемого P в рационе поросят-отъемышей, кормящихся рационами на основе кукурузы и SBM, содержащими рис и рисовые отруби.

ПРИМЕР 10

Разработка и оценка химерных полипептидов из клады фитаз с высокой Tm

Был разработан ряд химерных полипептидов для оценки вклада перестановки/замены областей на N-конце и/или C-конце полипептидов из клады фитаз с высокой Tm, описанных в примере 4 (PHY-13594, PHY-13789 и PHY-13885). Для целей этого исследования N-конец определяли как остатки 1-13 в соответствии с SEQ ID NO: 1, сердцевинную область определяли как остатки 14-325 в соответствии с SEQ ID NO: 1, а C-конец определяли как остатки от 326 до конца каждого полипептида, описанного в примере 7, в соответствии с SEQ ID NO: 1. Белки получали с помощью способов, описанных в примере 1, и образцы осветленной надосадочной жидкости культуры использовали для измерения термостабильности с помощью DSC и удельной фитазной активности при pH 3,5 и pH 5,5 с помощью способов, описанных в примере 3. Осуществляли создание химерных молекул, содержащих N-концевые области HAP-фитаз, обнаруживаемых у Buttiauxella sp. (NCIMB 41248 Buttiauxella, SEQ ID NO: 88), C. braakii (AAS45884 Citrobacter braakii, SEQ ID NO: 89) и E. piscicida (YP007628727 Edwardsiella tarda, WP_015461291.1 Edwardsiella piscicida, SEQ ID NO: 90), с использованием фитаз PHY-13594, PHY-13789 и PHY-13885 для сравнения. Аналогичным образом осуществляли создание химерных молекул, содержащих С-концевые области HAP-фитаз, обнаруживаемых у H. alvei (WO2010034835-0002 Hafnia alvei, SEQ ID NO: 94), Y. mollaretii (WP032813045 Yersinia mollaretii, SEQ ID NO: 95) и Buttiauxella sp. (NCIMB 41248 Buttiauxella, SEQ ID NO: 96), с использованием PHY-13594, PHY-13789 и PHY-13885 для сравнения. Используются следующие сердцевинные области фитазы: SEQ ID NO: 100 для PHY-13594, SEQ ID NO: 101 для PHY-13789 и SEQ ID NO: 102 для PHY-13885. В таблице 21 описаны различные тестируемые химерные конструкции и приведены результаты в отношении термостабильности, удельной активности при pH 3,5 и соотношения удельной активности при pH 3,5 и pH 5,5. Как показано в таблице 21, модификации N-конца либо С-конца трех оцениваемых фитаз с высокой Tm приводят к образованию ферментов с весьма сходной термостабильностью, что указывает на то, что структурные детерминанты для поддержания термостабильности этих фитаз с высокой Tm находятся в аминокислотной последовательности сердцевинных областей. Все полипептиды из клады фитаз с высокой Tm, описанные в таблице 21, также демонстрируют более 100 FTU/мг при тестировании с использованием анализа, описанного в примере 2.

Таблица 21. Результаты определения термостабильности, измеренной с помощью DSC для различных химерных ферментов фитаз Название образца Модифицированный химерный элемент N-концы Сердцевина фитазы С-концы Tm, определенная с помощью DSC (°C) Удельная активность при pH 3,5 (мкмоль P/мг/мин.) Соотношение удельной активности при pH 3,5 и pH 5,5 PHY-17434 N-концы Buttiauxella sp. PHY-13594 PHY-13594 91 н. о. н. о. PHY-17230 С-концы PHY-13594 PHY-13594 H. alvei 94 436 1,2 PHY-17240 С-концы PHY-13594 PHY-13594 Y. mollaretii 95 567 1,3 PHY-13594 отсутствует PHY-13594 PHY-13594 PHY-13594 97 687 1,5 PHY-17041 N-концы Buttiauxella sp. PHY-13789 PHY-13789 99 862 1,5 PHY-17050 N-концы C. braakii PHY-13789 PHY-13789 100 690 1,4 PHY-17202 N-концы E. piscicida PHY-13789 PHY-13789 100 771 1,7 PHY-17117 С-концы PHY-13789 PHY-13789 Hafnia 96 754 1,5 PHY-17032 С-концы PHY-13789 PHY-13789 Buttiauxella sp. 97 419 1,1 PHY-17126 С-концы PHY-13789 PHY-13789 Y. mollaretii 98 645 1,4 PHY-13789 отсутствует PHY-13789 PHY-13789 PHY-13789 101 700 1,5 PHY-17059 N-концы Buttiauxella sp. PHY-13885 PHY-13885 97 552 1,7 PHY-17068 N-концы C. braakii PHY-13885 PHY-13885 98 605 1,8 PHY-17174 С-концы PHY-13885 PHY-13885 Buttiauxella sp. 95 448 1,6 PHY-17088 С-концы PHY-13885 PHY-13885 Y. mollaretii 96 436 1,5 PHY-13885 отсутствует PHY-13885 PHY-13885 PHY-13885 99 596 1,8

В целях иллюстрации на фигуре 3 изображена трехмерная структура иллюстративной фитазы из клады фитаз с высокой Tm, смоделированная с использованием кристаллической структуры, опубликованной для близкородственной 6-фитазы Hafnia alvei (код записи в PDB: 4ARO, фитаза в комплексе с мио-инозитолгексакиссульфатом), и показанная в виде ленточной диаграммы. Модель строили с использованием MOE (v2013.08, Chemical Computing Group Inc.) и визуализировали с помощью программы из системы программного обеспечения PyMOL (версия 1.8.4.2, Schrodinger, LLC). Черным цветом изображен "сердцевинный" домен, а светло-серыми оттенками изображены N- и C-концевые области, которые были заменены/переставлены в экспериментах, показанных в данном документе. Эта модель согласуется с множественным выравниванием последовательностей на основе структуры, представленным в Arizaet al (Degradation of Phytate by the 6-Phytase from Hafnia alvei: A Combined Structural and Solution Study, PLOS, 8: 1-13) с использованием кристаллической структуры 6-фитазы Hafnia alvei.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой сконструированный полипептид фитазу, обладающий фитазной активностью, характеризующийся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1. Полипептид входит в состав кормовой добавки для животных. Использование добавки согласно изобретению позволяет улучшить продуктивность животных. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 21 табл., 10 пр.

1. Сконструированный полипептид фитаза, обладающий фитазной активностью, характеризующийся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1.

2. Сконструированный полипептид фитаза по п. 1, где аминокислотная последовательность сконструированного полипептида фитазы имеет балл согласно скрытой марковской модели (HMM), составляющий по меньшей мере 1200.

3. Сконструированный полипептид фитаза, характеризующийся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с аминокислотами в положениях 14-325, соответствующих аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1.

4. Сконструированный полипептид фитаза по любому из пп. 1, 2, где указанный полипептид фитаза содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID:NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 64.

5. Сконструированный полипептид фитаза по любому из пп. 1, 2, где указанный полипептид фитаза содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 87.

6. Композиция кормовой добавки для животных, содержащая сконструированный полипептид фитазу по любому из пп. 1-5, где сконструированный полипептид фитазу применяют (i) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, или (ii) с по меньшей мере одним другим ферментом, или (iii) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, и по меньшей мере одним другим ферментом, или (iv) согласно любому из (i), (ii) или (iii) с дополнительным включением по меньшей мере одного другого компонента, представляющего собой кормовую добавку, и при этом сконструированный полипептид фитаза необязательно присутствует в количестве, составляющем по меньшей мере 0,1 г/т корма.

7. Композиция кормовой добавки для животных, содержащая сконструированный полипептид фитазу по любому из пп. 4, 5, где сконструированный полипептид фитазу применяют (i) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, или (ii) с по меньшей мере одним другим ферментом, или (iii) в комбинации с пробиотиком, содержащим по меньшей мере один бактериальный штамм, и по меньшей мере одним другим ферментом, или (iv) согласно любому из (i), (ii) или (iii) с дополнительным включением по меньшей мере одного другого компонента, представляющего собой кормовую добавку, и при этом сконструированный полипептид фитаза необязательно присутствует в количестве, составляющем по меньшей мере 0,1 г/т корма.

8. Способ улучшения продуктивности животного по одному или более показателям, включающий введение животному эффективного количества сконструированного полипептида фитазы по любому из пп. 1-5 или композиции кормовой добавки для животных по п. 6 или 7.

9. Способ по п. 8, где один или более показателей выбраны из группы, состоящей из увеличенной эффективности использования корма, увеличенного прироста веса, сниженного коэффициента конверсии корма, улучшенной усвояемости питательных веществ или энергии в корме, улучшенного удержания азота, улучшенной способности избегать отрицательных эффектов некротического энтерита и улучшенного иммунного ответа.

10. Способ по п. 8 или 9, где животное представляет собой моногастричное животное, выбранное из группы, состоящей из домашней свиньи и домашней птицы.

11. Способ по п. 10, где домашняя свинья выбрана из группы, состоящей из поросят, растущих свиней и свиноматок.

12. Способ по п. 10, где домашняя птица выбрана из группы, состоящей из индеек, уток, кур, цыплят-бройлеров, несушек, гусей, фазанов, перепелов и эму.

13. Способ по п. 8 или 9, где животное представляет собой жвачное животное, выбранное из группы, состоящей из крупного рогатого скота, молодых телят, коз, овец, жирафов, бизона, лося, вапити, яков, индийского буйвола, оленя, северного оленя, карибу, верблюдов, альпак, лам, антилопы, вилорога и нильгау.