СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИОБЛАСТОВ IN VITRO ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИОЦИТОВ ДЛЯ ПИЩЕВЫХ ЦЕЛЕЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N5/00 A23J1/02 

Изобретение относится к области клеточной технологии, биотехнологии и пищевой промышленности, а именно связано с разработкой способа культивирования мышечных клеток in vitro для создания биомассы, используемой для пищевых целей.

Возможность выращивания выделенных из животных тканей, в том числе мышечной, доказана успешными экспериментами, проводимыми с начала 20 века. Однако на данный момент удается выращивать мышечную ткань лишь в небольших количествах [Edelman et al., 2005]. Более того, клеточные технологии ориентированы на создание именно органов, в медицинских целях. Такой подход требует создание сложной конструкции из различных тканей, обеспечивающей дальнейшее длительное выживание клеток и нормальное функционирование органа. Создание же технологии производства мышечных клеток для использования в пищевых целях является более простой задачей.

На данный момент существует 2 подробно описанных подхода к созданию «культивируемого мяса» [Boland et al., 2003, Zandonella, 2003], которые основаны на выращивании мышечных клеток в суспензии в питательной среде, с использованием поддерживающей структуры. Владимир Миронов предлагает создание биореактора, в котором клетки выращиваются на коллагеновых сфероидах, служащих основой для прикрепления и дифференцировки клеток, либо из таких сфероидов «печатают» орган [Mironov et al., 2009]. В подходе Уильяма Ван Еелена, запатентовавшего свою идею в США и Германии [Van Eelen et al., 1999], в качестве такой поддерживающей структуры используется коллагеновая сеть, питательная среда время от времени обновляется или фильтруется через нее. Также существуют идеи об использовании других типов поддерживающих структур, таких как большие листы съедобного или легко отделяемого материала, - мышечная ткань может использоваться для дальнейшей обработки после скручивания до необходимой толщины [Edelman et al., 2005]. Однако данные подходы до сих пор остаются лишь теоретическими, поскольку с их помощью еще не удалось обеспечить масштабное производство массы мышечных клеток. Предлагаемый же нами способ культивирования миобластов предполагает использование иммортализованной линии клеток, что позволяет отказаться от постоянного отбирания клеток у животных.

Разные исследователи предлагают использовать различные типы поддерживающих структур: шарики из съедобного коллагена с порами [Edelman et al., 2005], коллагеновая губка, полученная их быков [Van Eelen et al., 1999]. Известны каркасы, изготовленные также из фибронектина, ламинина или синтетических материалов, таких как альгинат, политимидиловая или полиуридиловая кислота [US patents №5686091, №5863984, №5916265]. Российские исследователи предлагают использовать в качестве каркасов губки, полученные из плазмы крови животных, с высокоразвитой поверхностью [патент РФ №2314719]. Однако при использовании таких исходных материалов для создания поддерживающей структуры (несинтетические - животного происхождения) велика вероятность загрязнения биомассы патогенами, значительно увеличивается риск попадания в нее пестицидов, мышьяка, диоксина, гормонов, а при использовании синтетических веществ появляется необходимость удаления данных структур для применения в пищевых целях, что усложняет процесс и увеличивает время производства. Агароза, из которой создаются гели в патентуемом изобретении, является линейным полисахаридом, образованным из чередующихся остатков β-D-галактопиранозы и 3,6-ангидридо-α-1-галактопиранозы, объединенных 1→4 связью. Агарозу получают из агара, путем экстрагирования из красных (филофора) и бурых водорослей (Gracilaria, Gelidium, Ceramium и др.), произрастающих в Белом море и Тихом океане, и образующих в водных растворах плотный студень. Такой материал (агароза) является натуральным, поэтому его деградация не является обязательной. Кроме того, данный материал позволяет создавать пористые гели с необходимым диаметром пор, варьируя процентность агарозы. Также описанные подходы предполагают использование отдельно твердой фазы (неподвижной) - поддерживающей структуры и жидкой фазы - питательной среды в постоянном движении. В предлагаемом же нами способе агарозный гель содержит в порах питательные элементы, в достаточном количестве для достижения клетками необходимой плотности. Таким образом, создается одна твердая фаза.

Также предлагается выращивать мышечные клетки в ферментере с использованием периодического культивирования с добавлением субстрата: питательные вещества добавляют в низких концентрациях в процессе ферментации. Одним из преимуществ метода является возможность регулирования скорости роста клеток, которую можно соизмерять со скоростью подачи кислорода. Данная технология немного технически проще, чем описанная выше (с использованием агарозных гелей), и соизмерима с ней по эффективности.

Питательные среды, используемые в опытах по культивированию мышечных клеток, в большей массе содержат БСА (бычий сывороточный альбумин) [Shah, 1999], и/или белковую компоненту, и/или некоторые факторы животного происхождения [Merten, 1999]. Однако такие компоненты неприемлемы для культивирования клеток для пищевых целей по уже указанной причине, а именно ввиду большой вероятности загрязнения биомассы патогенами и токсичными веществами; также ввиду высокой стоимости. В связи с этим в патентуемом изобретении предлагается использовать в качестве питательной среды или компонентов питательной среды экстракты организмов, синтезирующих большой процент белка от их биомассы (бактерий, либо дрожжей, либо водорослей, либо растений). Получается, используются белки неживотного происхождения (биотехнологического происхождения - полученные в клетках бактерий - например, E.coli; дрожжей - например, Saccharomyces; водорослей - например, Spirulina; растений - например, Glycine max). Любые другие вещества белковой природы, предполагаемые для использования при осуществлении способа культивирования, также предлагаются биотехнологического происхождения (рекомбинантные белки), например переносчики кислорода (наряду с питательными элементами необходимы для жизнеобеспечения клеток), например гемоглобин, что также отличает данное изобретение от существующих подходов. Такой подход позволяет создать безопасный продукт, с низкой себестоимостью, что является его бесспорным преимуществом.

Основным типом клеток мышечной ткани являются миоциты - зрелые клетки скелетных мышц (у взрослого человека в длину 2-3 см, в ширину - 100 мкм), представляющие собой синцитий: множество ядер в одной цитоплазме. Предшественниками миоцитов являются миобласты. Показано, что последовательность экспрессии генов и синтеза белков в процессе дифференцировки мышечной ткани in vitro, в целом, подобна таковой in vivo [Мануйлова и др., 2001].

Определенные сигналы, такие как наличие в среде факторов роста фибробластов или гепатоцитов (FGF, HGF - fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor), могут поддерживать миобласты в пролиферативном состоянии. Если же данные факторы убрать из питательной среды, клетки перестают делиться, дифференцируются и сливаются.

Процесс дифференцировки является кооперативным: дифференцирующиеся миобласты секретируют факторы, стимулирующие другие миобласты к дифференцировке.

В данном изобретении предлагается использовать FGF, HGF для поддержания миобластов в пролиферативном состоянии, а отсутствие данных факторов - для дифференцировки и слияния миобластов.

Механизм, регулирующий число мышечных клеток и их размер, связан с наличием экстраклеточного сигнального белка, миостатина, а также его ингибиторов. На мышах показано, что при отсутствии экспрессии гена, кодирующего миостатин, мышцы вырастают в 2-3 раза больше, чем в норме. Оказывается, мутации того же гена наблюдаются у определенных пород скота: при селекции животных с большой мышечной массой бессознательно выбрались те особи, которые дефектны по гену миостатина. Миостатин относится к суперсемейству сигнальных белков TGFβ (transforming growth factor beta), в норме он секретируется мышечными клетками. Очевидно, что его функция - ограничение роста мышц. Небольшие количества данного белка можно обнаружить у взрослого человека, а при СПИДе (синдром приобретенного иммунного дефицита) у пациентов с выраженной потерей мышечной массы детектируются повышенные количества миостатина.

Нарастание большей мышечной массы наблюдается и при использовании ингибиторов миостатина, например фоллистатина и пептидов на его основе [Nakatani et al., 2008].

Патентуемый способ предполагает использование ингибиторов миостатина в качестве компонентов питательной среды, либо использование линий миобластов с отсутствием рецептора к миостатину, либо с отсутствующей экспрессией миостатина. Последние два подхода особенно актуальны, поскольку в данном случае не придется добавлять в среду ингибиторы миостатина, что удешевит производство.

Подход с использованием иммортализованной линии миобластов любых животных является уникальным, другие исследователи предлагают постоянно отбирать миобласты, либо сателлитные клетки [Van Eelen, 1999], либо мезенхимальные клетки [патент РФ №2314719], либо тканевые экспланты [Benjaminson et al., 2002]. Однако предлагаемый в данном изобретении подход удобнее, поскольку периодическое отбирание клеток требует дополнительных затрат. Кроме того, каждую новую партию клеток от животных необходимо проверять на наличие патогенов, определять наличие токсических веществ, гормонов, пестицидов. Более того, продукт не будет одинаковым от партии к партии (ввиду разных вкусовых качеств, консистенции, внешнего вида продукта), что может негативно сказаться на спросе на продукцию, а также на продуктивности метода. В добавление необходимо сказать, что при использовании тканевых эксплантов высока вероятность отмирания доли клеток ввиду недоступности для них питательных веществ, поскольку ткань подразумевает скопление клеток, скрепленных межклеточными контактами. Отмирающие клетки могут выделять токсические вещества. Кроме того, питательная среда будет расходоваться на рост других типов клеток, помимо мышечных, что выразится в меньшем содержании мышечных клеток в пищевом продукте, чем при использовании в качестве исходной миобластной линии клеток.

Таким образом, патентуемое изобретение представляет собой способ культивирования мышечных клеток in vitro для получения биомассы, используемой для пищевых целей, при котором в качестве культивируемых клеток используется иммортализованная линия миобластов любого животного. В такой линии клеток обеспечиваются отсутствие экспрессии миостатина ввиду генетического состава самих клеток; либо нормальный уровень экспрессии миостатина, но в этом случае обеспечивается введение в питательную среду ингибиторов миостатина; либо отсутствие экспрессии рецептора к миостатину. Иммортилизованная клеточная линия культивируется в ферментерах, либо на тонких агарозных гелях, содержащих в порах компоненты питательной среды. Для поддержания пролиферации миобластов клеткам подается FGF и/или HGF. Для дифференцировки миобластов обеспечивается недоступность данных факторов для клеток. Особенностями питательной среды являются: использование в качестве источника азота (аминокислот, в т.ч. незаменимых) вместо БСА белков неживотного происхождения; при использовании клеток с нормальной экспрессией миостатина - использование ингибиторов миостатина (например, фоллистатина и его аналогов); использование переносчиков кислорода, например гемоглобина, полученных с помощью биотехнологических методов. Питательной средой или компонентами питательной среды могут быть экстракты организмов, синтезирующих большой процент белка от их биомассы, они же являются источником микроэлементов, витаминов (бактерии, либо дрожжи, либо водоросли, либо растения).

Таким образом, настоящее изобретение является уникальным ввиду подходов, используемых для реализации способа. Заявленный способ культивирования мышечных клеток in vitro позволяет достичь технического результата - получения безопасной биомассы (не содержащей патогены, токсические вещества) для пищевых целей. Кроме того, данный способ позволяет получить биомассу в масштабируемых количествах, а также уменьшить время создания такой биомассы.

Пример 1. Получение биомассы мышечных клеток с использованием ферментера.

Миобласты помещали в среду, содержащую деионизированную воду, сбалансированный буферный солевой раствор (для снабжения клеток необходимыми ионами и поддержания осмотического баланса), глюкозу, бикарбонат (с его помощью поддерживали необходимое значение pH - между 7,2 и 7,5), дрожжевой экстракт (содержит на 100 г: белка 47-56 г (все, в т.ч. незаменимые аминокислоты), жиры - 2-6 г, золу - 6 г, лизин - 4,2 г, метионин + цистин 1,7 г; антиоксиданты: глутатион и серосодержащие аминокислоты; витамины: PP, холин, группы B - B1, B2, B6, B9, B12; микроэлементы: кальций 0,086 г, магний 0,18 г, натрий 3,6 г, калий 2,6 г, фосфор 0,104 г); в качестве переносчика кислорода - гемоглобин, полученный с помощью биотехнологических методов. Буферный раствор содержал ионы Na+, К+ (незаменимы в некоторых внутриклеточных реакциях, имеют важное значение также для поддержания осмотического баланса клеток). При использовании клеток с нормальной экспрессией миостатина в среду добавляли дополнительный компонент - фоллистатин (ингибитор миостатина), полученный с помощью биотехнологических методов.

Получившуюся смесь клеток и питательной среды с добавлением в нее факторов роста фибробластов и гепатоцитов для поддержания пролиферативного состояния миобластов помещали в ферментер (биореактор). Осуществляли периодическое культивирование с добавлением субстрата: питательные вещества добавляли в низких концентрациях в процессе ферментации. При достижении необходимого объема биомассы клеткам перестали подавать FGF, HGF. В результате, миобласты дифференцировались в миоциты. По завершении данного этапа клетки собирали, формируя биомассу для последующего использования в пищевых целях.

Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).

Пример 2. Создание иммортализованной линии миобластов с отсутствующей экспрессией миостатина

Линию миобластов получали с использованием клеток от молодого животного, поскольку в таких клетках длина теломерных участков больше, чем у взрослого, тем более, старого животного, что обеспечивает больший пролиферативный потенциал.

В таких отобранных клетках животного добивались отсутствия экспрессии гена, кодирующего миостатин, с помощью нокаута данного гена (у Bos taurus - в положении 2q14-q15) введением замещающей векторной конструкции и последующего отбора измененных клеток.

Такие миобласты иммортализовывали введением в клетки конструкции, осуществляющей встраивание гена теломеразы в геном клетки, в конкретное место, обеспечивающее необходимый уровень экспрессии данного гена. Теломераза - это рибозим, способный удлиннять теломеры, был обнаружен в бессмертных клеточных линиях. Множество различных типов клеток было иммортализовано с помощью данного фермента, и ни одна не показала признаков нарушения роста, связанного с раковой трансформацией [Harley, 2002].

Пример 3. Создание иммортализованной линии миобластов с отсутствующей экспрессией рецептора миостатина.

Создали линию миобластов (см.пример 2), добились отсутствия экспрессии гена, кодирующего рецептор миостатина, иммортализовали данную линию клеток (см.пример 2).

Пример 4. Приготовление агарозного геля с питательной средой для культивирования миобластной линии клеток, не экспрессирующей миостатин или рецептор к миостатину.

Поскольку средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 000 кДа, агароза такой процентности вполне подходит для наших целей. Таким образом, приготовили 2% агарозу, с использованием деионизированной воды, сбалансированного буферного солевого раствора (ионы Na+ (120 мМ), К+), стерильного раствора глюкозы, стерилизованного раствора бикарбоната. В качестве питательных элементов в агарозу добавляли порошок спирулины (содержит антиоксидант β-каротин, а также железо, кальций, натрий, калий, медь, магний, марганец, цинк, фосфор, селен, витамины A, B1, B2, B3, B6, B12, PP, биотин, фолиевую кислоту, инозитол, пантотенат, витамины C и E, гамма-линоленовую кислоту и глютаминовую кислоту; 100 г продукта содержат: белки: 65 г, жиры: 6 г, углеводы: 12 г, зола 8 г), в качестве переносчика кислорода - гемоглобин, полученный с помощью биотехнологических методов. Все компоненты, помимо воды, добавляли в агарозу, охлажденную до 40-35°C, тщательно перемешивали. Заливали гель из такой агарозы толщиной не более 0,5 см.

Пример 5. Приготовление агарозного геля с питательной средой для культивирования миобластной линии клеток, экспрессирующей миостатин.

Приготовили раствор, описанный в примере 4, на основе агарозы, с дополнительным компонентом - фоллистатином (ингибитор миостатина), полученным с помощью биотехнологических методов. Заливали гель из такого раствора толщиной не более 0,5 см.

Пример 6. Получение миобластной клеточной массы в большом объеме

Приготовили агарозный гель (см. пример 4, пример 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), с использованием в качестве источника питательных элементов соевый изолят (экстрагированный из Glycine max белок, очищенный от липидов, полисахаридов, ингибитора трипсина, содержит на 100 г: белка 90 г (все, в т.ч. незаменимые, аминокислоты), жиры - 0 г, золу - 6 г, волокна - 0,3 г, метионин 1,7 г; антиоксиданты: глутатион и серосодержащие аминокислоты; витамины: PP, холин, группы B - B1, B2, B6, B9, B12; микроэлементы: кальций 0,086 г, магний 0,18 г, натрий 3,6 г, калий 2,6 г, фосфор 0,104 г), поместили миобласты на такой гель на достаточном для получения оптимального объема биомассы расстоянии друг от друга. Обрабатывали клетки факторами роста фибробластов и гепатоцитов в необходимом для достижения максимального объема клеточной массы количестве. Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).

Пример 7. Получение клеточной массы миоцитов в большом объеме

Приготовили агарозный гель (см. пример 4, пример 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), поместили миобласты на такой гель, обеспечили их пролиферацию до необходимого уровня (см. пример 6). Далее перестали подавать клеткам FGF, HGF. В результате, миобласты дифференцировались в миоциты, клеточная масса приобрела вид «мышечного среза». При применении гелей толщиной 0,1 см такие гели не удаляли, использовали выращенную биомассу вместе с ними.

Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).

Пример 8. Получение мышечной биомассы с использованием двух типов гелей.

Приготовили агарозный гель (см. примеры 2 - 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), в который также ввели FGF, HGF, для обеспечения пролиферации миобластов до достижения оптимальной клеточной плотности.

Затем приготовили второй агарозный гель (см. пример 4, пример 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), без использования FGF, HGF.

При остановке роста клеток агарозный гель расплавили, клеточную массу переместили на приготовленный второй гель, обеспечив дифференцировку миобластов в миоциты. Таким образом, получили биомассу, имеющую вид «мышечного среза».

Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).

Поскольку при заливании тонких гелей увеличивается площадь поверхности для выращивания клеток, такой способ получения мышечной биомассы позволяет масштабировать производство такой биомассы.

Пример 9. Проверка возможности использования биомассы миоцитов, получаемой согласно патентуемому способу, в пищевых целях.

Для эксперимента использовали взрослых самцов крыс линии Вистар, 180-190 г. Экспериментальные животные поступили из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН. Животных содержали в условиях SPF-вивария с соблюдением режима приема пищи и воды.

Карантин

Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы (опыт и контроль) с помощью метода рандомизации. Животные, не соответствующие критериям, были исключены из исследования в течение карантина.

Содержание животных

Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Световой режим: 12 ч - свет, 12 ч - темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 19-25°C, относительная влажность - 50-70%. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. При изменении погодных условий контролировался воздухообмен в помещении с помощью анемометра и путем измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Был установлен режим проветривания, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час, концентрацию CO₂ не более 0.15 объемных %, аммиака - не более 0.001 мг/л. Животные получали воду ad libitum.

Эксперимент

1 группа (контрольная 1). Отобранным животным контрольной группы давали вареное мясо 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.

2 группа (опытная 1). Приготавливали питание для животных опытной группы: полученную в результате культивирования в ферментере биомассу миоцитов центрифугировали для отделения питательной среды, питательную среду сливали. Получившуюся биомассу клеток варили и давали животным 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.

3 группа (контрольная 2). Отобранным животным контрольной группы давали сырое мясо 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.

4 группа (опытная 2). Полученную в результате культивирования в ферментере биомассу миоцитов центрифугировали для отделения питательной среды, питательную среду сливали. Получившуюся биомассу клеток давали животным 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.

Данный режим питания выдерживали 30 дней.

Исследовали несколько показателей подострой токсичности крыс.

Регистрация показателей

Общее состояние оценивалось при ежедневном осмотре животных. Взвешивание, измерение ректальной температуры, потребления воды и корма выполнялось раз в неделю и после окончания кормления.

Физиологические исследования проводились до начала опыта и через 30 дней после начала исследования.

1. Влияние на массу тела

Точность используемых весов была верифицирована до начала исследования. Результаты взвешивания крыс представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние кормления мясом и биомассой мышечных клеток на массу тела крыс (г, M±m) Сроки исследования (дни) Экспериментальная группа Опыт 1 Контроль 1 Опыт 2 Контроль 2 Фон 190±1,5 188±2,7 192±3,7 180±2,9 7-й день 187±2,4 187±3,1 186±3,2 175±2,8 14-й день 185±3,1 185±2,9 180±3,2 170±2,3 21-й день 184±3,0 180±2,8 170±2,9 168±2,4 30-й день 186±2,8 175±3,0 164±3,1 160±2,3

Анализ приведенных в таблице 1 данных показывает, что вес животных равномерно уменьшался на протяжении всего срока исследования как в контрольных, так и во всех опытных группах. Наблюдали различия между опытными и контрольными группами животных в скорости потери массы: бóльшую скорость снижения веса наблюдали в опытных группах, в группе, которую кормили сырой биомассой мышечных клеток, наблюдали наибольшую скорость снижения массы тела.

2. Влияние на двигательную и исследовательскую активность

В таблице 2 представлены данные по влиянию кормления мясом и биомассой мышечных клеток на спонтанную двигательную активность крыс (СДА). Крысы по одной помещались в регистрационную камеру автоматического регистратора «Coulburn Instruments», где за каждые 5 минут на протяжении 35 минут у них регистрировалось количество движений.

Таблица 2 Влияние кормления мясом и биомассой мышечных клеток на СДА крыс (г, M±m) Сроки исследования (дни) Экспериментальная группа Контроль 1 Опыт 1 Контроль 2 Опыт 2 0-5 51.2±18.1 88.9±20.4 86.4±41.9 72.6±27.3 6-10 46.1±30.5 76.4±11.9 72.2±24.9 70.2±21.9 11-15 43.0±21.9 70.5±17.4 21.9±11.5 65.3±23.6 16-20 22.1±4.7 42.5±15.0 29.4±16.5 67.9±15.0 21-25 31.1±12.4 40.8±2.5 13.0±6.4 64.8±10.2 26-30 31.2±13.6 41.4±9.3 41.1±10.5 67.2±9.0 31-35 18.1±13.6 42.9±2.5 18.4±7.0 72.8±8.8

Данные по контрольным животным свидетельствуют, что на протяжении исследования имело место общее снижение СДА (типичное явление в условиях длительных исследований). Однако в опытных группах снижение активности было менее выражено, в случае кормления вареной биомассой мышечных клеток оно составило около 50%, в случае кормления сырой биомассой мышечных клеток наблюдали небольшое снижение активности, которое элиминировалось к концу эксперимента.

Данные по влиянию кормления мясом и биомассой мышечных клеток на структуру поведения крыс в «открытом поле» представлены в таблице 3.

Таблица 3 Влияние кормления мясом и биомассой мышечных клеток на поведение крыс (г, M±m) Сроки исследования (дни) Экспериментальная группа Опыт 1 Контроль 1 Опыт 2 Контроль 2 Латентный период 92±11 105±19 99±19 109±13 Горизонтальная активность 3.3±1.2 2.3±0.4 1.6±0.4 1.9±0.6 Вертикальная активность 2.1±0.8 2.4±0.5 1.8±0.9 2.7±0.3 Заглядывания 2.8±0.3 4.2±0.4 3.0±0.8 3.1±0.4 30 день Латентный период 89±13 113±25 94±14 116±27 Горизонтальная активность 4.1±1.1 2.4±1.0 2.6±0.09 0.9±0.1 Вертикальная активность 3.0±0.8 2.4±1.2 3.1±0.7 1.0±0.1 Заглядывания 4.5±0.6 1.5±0.4 6.8±1.0 2.0±1.1

Как видно из представленных данных, практически во всех экспериментальных группах животных (исключая контрольные группы) отмечается достоверное укорочение латентного периода, во всех группах наблюдается недостоверное увеличение активности, оцениваемое по количеству вертикальных стоек, пересечений и заглядываний, по сравнению с фоновыми данными, что является характерным для животных, вторично помещаемых в условия «открытого поля». При этом каких-либо статистически достоверных различий в структуре поведения животных опытных групп от групп контроля не отмечается.

Выводы

Тесты на подострую токсичность показали, что выращенная биомасса мышечных клеток не приводит к гибели животных: животные всех четырех групп выжили.

Животные всех групп потеряли в весе. Крысы группы кормленых вареной биомассой мышечных клеток потеряли меньше в весе, чем животные группы кормленых вареным мясом. Крысы кормленых сырой биомассой мышечных клеток потеряли больше в весе, чем животные группы кормленых сырым мясом.

Исследование двигательной и исследовательской активности показали, что кормление биомассой мышечных клеток позволяет добиться меньшего снижения двигательной активности животных и увеличения исследовательской активности, по сравнению с кормлением мясом.

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования биомассы миоцитов, полученных с использованием патентуемого способа, в пищевых целях. Исходя из наблюдений за животными можно говорить о диетическом эффекте пищи из предлагаемой мышечной биомассы.

Список литературы

1. Benjaminson MA, Gilchriest JA, Lorenz M. In vitro edible muscle protein production system (MPPS): stage 1, fish. Acta Astronau. 2002 Dec; 51(12):879-89.

2. Boland T, Mironov V, Gutowska A, Roth EA, Markwald RR. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2003 Jun; 272(2):497-502.

3. Edelman P.D., McFarland D.C., Mironov V.A. and Matheny J.G., Commentary: In vitro-cultured meat production. 2005. Tissue Eng., 11: 659-662.

4. Harley C.B. Telomerase is not an oncogene. 2002. Oncogene, 21(4), 494-502.

5. Merten O.W. Safety issues of animal products used in serum-free media. 1999. Dev. Biol. Stand., 99: 167-180.

6. Mironov V, Visconti RP, Kasyanov V, Forgacs G, Drake СJ, Markwald RR: Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials 2009, 30:2164-2174.

7. Nakatani M, Takehara Y, Sugino H, Matsumoto M, Hashimoto O, Hasegawa Y, Murakami T, Uezumi A, Takeda S, Noji S, Sunada Y, Tsuchida K. Transgenic expression of a myostatin inhibitor derived from follistatin increases skeletal muscle mass and ameliorates dystrophic pathology in mdx mice. 2008. The FASEB Journal Vol.22. P.477-487.

8. Shah, G. Why do we still use serum in production of biopharmaceuticals. 1999. Dev. Biol. Stand., 99: 17-22.

9. US patent №5686091 International Class A61F 002/00 Biodegradable foams for cell transplantation/ Leong Kam W., Lo Hungnan, Kadiyala Sudhakar; The Johns Hopkins University School of Medicine, Application No. 219017 filed on 03/28/1994.

10. US patent №5863984, International Classes C08L 089/00, A61F 002/00 Biostable porous material comprising composite biopolymers/ Doillon, Charles J.,Pietrucha Krystina, Gaudreault, Rene C; Universite Laval, Cite Universitaire, Application No. 566297 filed on 12/01/1995.

11. US patent №5916265, US Classes: 424/423,623/23.72, International Class A61F 002/02 Method of producing a biological extracellular matrix for use as a cell seeding scaffold and implant/Hu Jie; Application No. 468270 filed on 06/06/1995.

12. Van Eelen, W.F., W.J. van Kooten, W. Westerhof and C. Mummery, 1999. WO/1999/031223: Industrial production of meat from in vitro cell cultures. Patent Description. http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?WO=1999031223.

13. Zandonella C. Tissue engineering: The beat goes on. 2003. Nature, 421: 884-886/

14. Н.Мануйлова E.C., Гордеева О.Ф., Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки: спонтанная и направленная дифференцировка // Известия Ан. Серия биологическая. 2001. №6. С.704-710.

15. Патент №2314719 Российская Федерация, МПК7 C12N 5/06, А23L 1/31. Способ получения мясного продукта / Рогов И.А., Валихов А.Ф., Демин Н.Я., Кроха Н.Г., Лисицын А.Б., Семенов Г.В., Титов Е.И., Тутельян В.А., Рогов С.И., Эрнст Л.К.; заявитель и патентообладатель МГУПБ - заявка №2006119540, заявл. 06.06.2006; опубл.20.01.2008, Бюл. №2.

Изобретение относится к области клеточной технологии, биотехнологии, пищевой промышленности. Предложен способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов, где в качестве культивируемых клеток используют иммортализованные миобласты животного, клетки выращивают с использованием питательной среды с белками неживотного происхождения, а также содержащей гемоглобин, при этом клетки поддерживают в пролиферативном состоянии с помощью факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов для образования биомассы, а затем вызывают дифференцировку миобластов в миоциты путем удаления из среды факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов, а в случае нормальных по экспрессии миостатина клеток в среду добавляют ингибитор миостатина. Способ может быть использован в пищевой промышленности для создания безопасных мясных пищевых продуктов в масштабных количествах с уменьшенным временем создания таких продуктов. 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 9 пр.

1. Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов, отличающийся тем, что в качестве культивируемых клеток используют иммортализованные миобласты животного, клетки выращивают с использованием питательной среды с белками неживотного происхождения, также содержащей гемоглобин, при этом клетки поддерживают в пролиферативном состоянии с помощью факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов для образования биомассы, а затем вызывают дифференцировку миобластов в миоциты путем удаления из среды факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов, а в случае нормальных по экспрессии миостатина клеток в среду добавляют ингибитор миостатина, полученную биомассу используют в пищевых целях.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки выращивают на агарозном геле 0,01-0,5 см в толщину, в пористую структуру которого введена питательная среда.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки выращивают исключительно в жидкой питательной среде с использованием ферментера.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивируют миобласты, дефектные по миостатину.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивируют миобласты с нормальной экспрессией гена миостатина в присутствии ингибитора миостатина в качестве компонента питательной среды.

6. Способ по п.1, по которому культивируют миобласты, дефектные по рецептору к миостатину.