СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ У ПОТОМСТВА БЕЛЫХ КРЫС С "ХИМИЧЕСКИМ НАСЛЕДСТВЕННЫМ ГРУЗОМ" Российский патент 2014 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, точнее к токсикологии.

Чрезвычайно важной и актуальной на современном этапе становится проблема проявлений воздействия химических токсикантов в последующих поколениях [1, 2]. С проблемой влияния химических веществ на последующие поколения тесно переплетаются вопросы изучения в популяции мутационного груза, характеризующего частоту наследственно обусловленной патологии, связанной с влиянием факторов окружающей среды. Разработка подходов к оценке мутационного груза является одной из основных задач при определении реальной мутагенной нагрузки на население [3, 4]. Таким образом, в настоящее время назрела проблема изучения проявлений наследственного мутационного груза, а также анализа причин и механизмов данного явления. Из имеющихся на сегодняшний день в арсенале генотоксикологии методов для решения указанных задач наиболее перспективным представляется метод гель-электрофореза единичных клеток [5]. Данный метод обладает рядом преимуществ, среди которых высокая чувствительность, возможность оценки в любых клетках, небольшое количество требуемого экспериментального материала, относительно низкие стоимость и длительность проведения экспериментов [6, 7]. Однако, несмотря на свои преимущества, метод ДНК-комет требует определенных трудозатрат, наличия материальных и технических ресурсов [8].

Задачей изобретения является расширение арсенала методов оценки генетических нарушений у экспериментальных животных.

Поставленная задача решается путем изучения поведения потомства белых крыс, подвергшихся воздействию токсического вещества, в тесте «открытое поле» с регистрацией количества актов «обнюхивание», «локомоции», «движение на месте», расчета прогностического индекса и интерпретации полученного результата.

Авторы не обнаружили описания способов оценки генетических нарушений, имеющих перечисленные выше признаки. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «новизна».

Показатели поведения белых крыс, выявляемые в тесте «открытое поле», используются для оценки состояния центральной нервной системы животных [9]. Использования результатов этологических исследований для оценки генетических нарушений авторами не найдено. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляется следующим образом.

Исследованию подвергают половозрелых белых крыс - потомков особей, подвергшихся воздействию токсического вещества. Поведение животных изучают с помощью теста «открытое поле» [9], фиксируя количество актов «обнюхивание», «локомоции», «движение на месте».

Рассчитывают прогностический индекс по формуле:

Р=1/(1+е^-у),

где Р - прогностический индекс, вероятность наличия генетических изменений;

е - математическая константа, равная 2,72;

у - регрессионное уравнение:

у=7,04-0,65Х₁+1,45Х₂-0,64Х₃,

где цифровые показатели - константы и регрессионные коэффициенты;

Х₁ - количество актов «обнюхивания»;

Х₂ - количество актов «локомоции»;

X₃ - количество актов «движения на месте».

При Р больше 0 и меньше 0,5 вероятность наличия генетических изменений определяют как минимальную, при Р больше 0,5 и меньше 1 вероятность генетических изменений оценивают как высокую.

Заявленное решение позволяет выявлять возможное наличие генетических изменений в клетках белых крыс без проведения трудоемких генетических исследований. Способ также позволяет проводить выбраковку животных с изменениями в геноме перед экспериментом.

Показатели поведения, использованные в данном решении, характеризуют ориентировочно-исследовательское поведение (обнюхивания), двигательную активность (локомоции) и тревожность (движение на месте) [9]. Известно, что генетически предопределяются общие принципы установления межнейронных связей, основная архитектоника, которые впоследствии и определяют особенности функционирования ЦНС. Кроме этого, наследуются элементы поведения [10]. Данный факт позволяет связать генетические изменения, обнаруженные в тканях головного мозга экспериментальных животных, и показатели поведения: процент ДНК в хвосте кометы у особей опытной группы составил 3,98 (2,3-5,8)%, у контрольных - 0,56 (0,08-3,95)% при р=0,00001.

Обработка результатов обследования потомства белых крыс, подвергавшихся воздействию винилхлорида, проводилась нелинейным регрессионным анализом (логистическая регрессия) [11].

Достоверность полученных информативных показателей по результатам регрессионного анализа представлена в таблице 1.

Таблица 1   Const.B0 Акты обнюхивание локомоции Движение на месте Estimate 7,040777 -0,65067 1,45352 -0,63896 p-level 0,078059 0,02119 0,006294 0,174864

Уровень значимости для модели составил 0,00001. Оценка эффективности предлагаемого способа прогнозирования генетических нарушений проводилась в обучающей и контрольной выборках. В обучающей выборке (81 особь) правильное распознавание составило для белых крыс с повреждением ДНК 98,18% и 92,31% - для животных контрольной группы. В контрольной выборке (49 крысы) правильное распознавание составило 96,97% и 87,50% соответственно.

Пример 1

Белая крыса опытной группы, полученная от особи, подвергавшейся воздействию винилхлорида. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:

X1 - количество актов «обнюхивания» - 25,

Х2 - количество актов «локомоция» - 22,

Х3 - количество актов «движения на месте» - 2.

Подставляем полученные значения в формулы:

у=7,04-0,65×27+1,45×22-0,64×5=1,41

P=1/(1+2,72^-1,41)=0,8.

Делаем вывод, что у данного животного высокая вероятность генетических изменений, что подтверждают результаты исследования генетических изменений методом «ДНК-комет». У данной особи процент ДНК в хвосте кометы составил 4,68%.

Пример 2

Белая крыса контрольной группы, полученная от особи, не подвергавшейся воздействию винилхлорида. При обследовании в тесте «открытое поле» выявлены числовые значения показателей:

X1 - количество актов «обнюхивания» - 20,

Х2 - количество актов «локомоции» - 5,

Х3 - количество актов «движения на месте» - 5.

Подставляем полученные значения в формулы:

у=7,04-0,65×27+1,45×22-0,64×5=-1,81

P=1/(1+2,72^-1,41)=0,14.

Делаем вывод, что у данной особи вероятность генетических изменений минимальная (процент ДНК в хвосте кометы составил 0,12%).

Литература

1. Антонова И.В. Роль экзогенных факторов в формировании врожденных пороков развития / И.В.Антонова, Е.В.Богачева, Ю.Ю.Китаева // Экология человека. - 2010. - №6. - С.30-35.

2. Домшлак М.Г. Информационное письмо «О необходимости расширения генетических исследований при оценке влияния химических веществ на половую функцию работников» / М.Г.Домшлак, Е.Н.Макарова-Землянская // Медицина труда и промэкология. - 2009. - №10. - С.45-48.

3. Даутов Ф.Ф. Факторы окружающей среды и здоровье населения / Ф.Ф.Даутов // Практическая медицина. - 2010. - №2. - С.68-72.

4. Дурнев А.Д. Анализ и значение мутаций в зародышевых клетках / А.Д.Дурнев // Медицинская генетика. - 2011. - №2. - С.3-11.

5. Арутюнян P.M. Анализ повреждения ДНК и хромосом методами молекулярной цитогенетики / P.M.Арутюнян, Г.Г.Оганесян // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2011. - №9. - С.57-63.

6. Жанатаев А.К. Метод ДНК-комет в генотоксикологических исследованиях / А.К.Жанатаев, А.Д.Дурнев, С.Б.Середенин // Гигиена и санитария. - 2011. - №5. - С.86-90.

7. Brendler-Schwaab, S. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing / S.Brendler-Schwaab, A.Hartmann, S.Pfuhler, G.Speit // Mutagenesis. - 2005. - Vol.20, №4. - P.245-54.

8. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Метод, рекомендации / Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А. и др. - М., 2006.

9. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я.Буреш, О.Бурешова, Д.П.Хьюстон. - М.: Высш. шк., 1991. - 399 с.

10. Булаева К.Б. Генетические основы психофизиологии человека / К.Б.Булаева. - М.: Наука, 1991. - 208 с.

11. Трухачева Н.В. Математическая статистика в медико-биологических исследованиях с применением пакета Statistica. ГЭОТАР-Медиа. 2012. - 384 с.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к токсикологии. Исследуют поведение потомства белых крыс, подвергшихся воздействию токсического вещества, с помощью теста «открытое поле». Регистрируют количество актов «обнюхивание», «локомоции», «движения на месте». Рассчитывают прогностический индекс по формуле: Р=1/(1+е^-у), где Р - прогностический индекс - вероятность наличия генетических изменений; е - математическая константа, равная 2,72; у - регрессионное уравнение: у=7,04-0,65Х_|+1,45Х₂-0,64Х₃, где цифровые показатели - константы и регрессионные коэффициенты; Х₁ - количество актов «обнюхивание»; Х₂ - количество актов «локомоции»; Х₃ - количество актов «движение на месте». При Р больше 0 и меньше 0,5 вероятность наличия генетических изменений определяют как минимальную, при Р больше 0,5 и меньше 1, вероятность генетических изменений оценивают как высокую. Способ расширяет арсенал методов оценки генетических нарушений у экспериментальных животных. 1 табл., 2 пр.

Способ оценки генетических морфофункциональных нарушений у потомства белых крыс с химическим наследственным грузом, включающий обследование потомства животных, подвергшихся воздействию химического вещества, отличающийся тем, что исследуют поведение животных в тесте «открытое поле», регистрируют количество актов «обнюхивание», «локомоции», «движение на месте», рассчитывают прогностический индекс по формуле:
Р=1/(1+е^-y),
где Р - прогностический индекс - вероятность наличия генетических изменений;
е - математическая константа, равная 2,72;
y - регрессионное уравнение:
y=7,04-0,65Х₁+1,45Х₂-0,64Х₃, где
цифровые показатели - константы и регрессионные коэффициенты;
Х₁ - количество актов «обнюхивание»;
Х₂ - количество актов «локомоции»;
X₃ - количество актов «движение на месте»,
при Р больше 0 и меньше 0,5 вероятность наличия генетических нарушений определяют как минимальную, при Р больше 0,5 и меньше 1 вероятность генетических нарушений оценивают как высокую.