СПОСОБ ОЦЕНКИ СУММАРНОЙ ВЕЛИЧИНЫ ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G16B40/00 

Изобретение относится к области медико-биологических исследований и предназначено для оценки суммарной величины индуцированных повреждений ДНК в тканях эмбрионов, плацент и других биологических образцах лабораторных животных с учетом продолжительности действия генотоксиканта непосредственно на клетки эмбрионов и плаценты и, может применяться в экспериментальной фармакологии и целевых программах доклинических исследований (далее - ДКИ) для оценки генотоксического риска возникновения врожденных пороков развития (далее - ВПР) и прогноза безопасности будущего медицинского применения лекарственных средств (далее - ЛС) в популяции беременных женщин и детей.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что формирование репродуктивной патологии часто связано с повреждающим действием генотоксикантов - веществ, способных вызывать повреждения ДНК и мутации, которые инициируют включение молекулярно-клеточных механизмов тератогенеза и, как следствие, возникновению ВПР у детей [Бочков, Н.П. Наследственность человека и мутагены внешней среды / Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев - М.: Москва, 1989. - 252 с.; Шредер О.В., Шредер Е.Д., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Сопряженность генотоксических и тератогенных эффектов, вызываемых циклофосфамидом, и их модификация афобазолом // Гигиена и санитария - 2011. - №5. - с. 64-68.].

Исследование генотоксичности и репродуктивной токсичности в экспериментах на животных является обязательной доклинической частью программы разработки ЛС для возможности их последующего клинического исследования, регистрации и безопасного медицинского применения в человеческой популяции. Актуальность оценки генотоксических механизмов эмбриотоксического риска для поддержки клинических исследований с участием популяции беременных женщин и детей определяют необходимость повышения надежности и весомости доказательств безопасности ЛС еще на доклиническом этапе исследования [ICH S11. Nonclinical safety testing in support of development of pediatric medicines. EMA/CHMP/ICH/616110/2018 / EMEA; 2020. (дата обращения 04.10.2021)].

Из уровня техники известны различные подходы для оценки генотоксичности средовых факторов и ЛС в биологических образцах грызунов.

Например, известен способ анализа «ДНК - комет», связанный с исследованием поврежденности ДНК в органах беременных мышей и их эмбрионов [Kido R., Sato I., Tsuda S. Detection of in vivo DNA damage induced by ethanol in multiple organs of pregnant mice using the alkaline single cell gel electrophoresis (Comet) assay // J VetMedSci. - 2006. - 68(1). - p. 41-7.]. Исследование проводят с использованием щелочной версии метода ДНК-комет по схеме: приготовление гель-слайдов, получение микропрепаратов, лизис, щелочная денатурация, электрофорез, нейтрализация / фиксация, окрашивание и микроскопический анализ. Оценку повреждения ДНК проводят в образцах 7 дневных эмбрионов мышей через 4, 8, 12 и 24 часа после обработки этанолом. В качестве показателя поврежденности используют параметр «% ДНК-комет». При статистической обработке учитывают среднее значение четырех средних значений временных точек для каждой группы, за единицу измерения принимают мышь.

При статистической обработке данных используют F-тест на однородность дисперсии между 2 группами, рассчитывают среднее значение или медиану показателя поврежденности ДНК с помощью t-критерия Стьюдента или критерия Манна-Уитни. По выводам авторов способа, повреждение ДНК были без отчетливого увеличения степени повреждения и не удалось найти результирующего подтверждения мутации после повреждения ДНК, вызванного этанолом и дальнейшее исследование связи между канцерогенностью или тератогенностью этанола и наблюдаемыми повреждениями ДНК.

К недостаткам этого известного способа следует отнести то, что на основе анализа отдельных точечных оценок и усреднения значений поврежденности ДНК невозможно определить риски возникновения аномалий развития на последующих этапах эмбриогенеза. С помощью такого подхода можно регистрировать первичные ДНК повреждения и их средние значение в разные временные периоды, однако невозможно оценить совокупный уровень повреждения генома в масштабе эмбриональных тканей и риски формирования тератогенных поражений.

Также известен способ анализа «ДНК - комет», связанный с исследованием поврежденности ДНК в тканях эмбрионов мышей [Tsuda S., Kosaka Y., Matsusaka N., Sasaki Y.F Detection of pyrimethamine-induced DNA damage in mouse embryo and maternal organs by the odified alkaline single cell gel electrophoresis assay // Mutation Research 415. - 1998. - p. 69-77.]. Мышей ICR обрабатывают потенциальным тератогеном с генотоксическим потенциалом PYR на 13-й день беременности мышей однократной пероральной дозой 50 мг PYR/кг. Плаценты матери и плода и два эмбриона берут через 6 и 16 ч после обработки, эмбрионы разделяют на части головы и тела. Все дальнейшие процедуры проводят по модифицированной версии метода щелочного гель-электрофореза (SCG, или Comet) для анализа изолированных ядер вместо изолированных клеток. При анализе учитывают среднее значение показателя поврежденности ДНК в каждой временной точке. Способ направлен на установление эмбриональной и материнской генотоксичности пириметамина (PYR), мощного тератогена и антагониста фолиевой кислоты.

Недостатками указанного известного способа является то, что данная методика лишь уточняет техническую процедуру стандартной версии протокола щелочной версии метода ДНК-комет, не определяя достоверную вероятность развития эмбриотоксического эффекта.

В уровне техники известен способ, связанный оценкой генотоксических эффектов в одно- и двух-клеточных зародышах мышей in vivo и in vitro методом ДНК-комет [Плигина К.Л., Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Даугель-Дауге Н.О., Дурнев А.Д. Оценка генотоксических эффектов в одно- и двух-клеточных зародышах мышей in vivo и in vitro методом ДНК-комет. Медицинская генетика 2020; 19(9): 77-78. DOI: 10.25557/2073-7998.2020.09.77-78].

Основной недостаток описанного метода заключается в том, что оценка генотоксических эффектов в одно- и двух-клеточных зародышах мышей не позволяет оценить масштаб генотоксического риска на ранних этапах эмбриогенеза. Известно, что в процессе внутриутробного развития могут возникать спонтанные повреждения ДНК, приводящие к мутациям или гибели (апоптозу) клеток. Реализация таких аномалий осуществляется, если число поврежденных клеток или отдельных клеточных популяций превышает критический, для нормального развития эмбриона, то есть, уровень поврежденности, который не может быть компенсирован в ходе дальнейшего эмбриогенеза [Бочков, Н.П. Наследственность человека и мутагены внешней среды / Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев - М.: Москва, 1989. - 252 с.].

Из уровня техники выбран способ прототип анализа «ДНК - комет», связанный с исследованием поврежденности ДНК в тканях эмбрионов крыс [О.В. Шредер, Е.Д. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин «Сопряженность генотоксических и тератогенных эффектов, вызываемых циклофосфамидом, и их модификация афобазолом» // Гигиена и санитория №5. - 2011. - с. 64-68.].

Сущность способа состоит в возможности дифференцировать генотоксические эффекты экспериментального тератогена в тканях эмбрионов и плаценты крыс по степени поврежденности ДНК с использованием стандартного протокола метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК - комет»), проводить анализ количественного соотношения клеток с различной степенью поврежденности ДНК в тканях плацент и эмбрионов, учитывать продолжительность повреждающего действия тератогена, обладающего генотоксическим потенциалом.

В отличие от выше описанных способов оценки методом «ДНК - комет» прототип имеет преимущества в возможности определять степень генотоксического поражения эмбриональных тканей у крыс в динамике по временным точкам экспозиции тератогеном и в то же время усложняет процедуру интерпретации наблюдаемых эффектов.

К недостаткам прототипа следует отнести то, что способ оценки ориентирован в большей степени на изучение сдвигов в количественные соотношения клеток с различной степенью поврежденности ДНК на основе частотных оценок, характеризующих в первую очередь изменение соотношения частот клеток в сторону увеличения количества клеток с высокой степенью повреждения ДНК и применения в качестве индикаторного теста для экспресс-скрининга генотоксичности потенциальных тератогенов и антитератогенов на лабораторных животных.

Однако способ-прототип обеспечивает оценку количественного соотношения клеток с различной степенью поврежденности генома в динамике, что позволяет установить критический, для нормального развития уровень поврежденности эмбриона, который не может быть компенсирован в ходе дальнейшего эмбриогенеза, при этом вызывает сложности при интерпретации совокупной величины генотоксического поражения по эффектам, наблюдаемым в разных временных интервалах.

Общим и основным недостатком выше описанных способов оценки ДНК - комет является отсутствие возможности оценивать суммарный показатель генотоксического поражения эмбриональных и плацентарных тканей за весь период генотоксического действия, то есть, «меры центральной тенденции» для описания множества значений генотоксичности одним-единственным числом. Полученные в результате эксперимента данные усредненного точечного значения повреждений ДНК не достаточны для утверждения генотоксически-обусловленного нарушения течения эмбриогенеза. В отношении изучения безопасности ЛС, аналитические и технические недостатки методики прототипа не позволяют на основе отдельных точечных оценок и частотных сдвигов в соотношении клеток с разной степенью повреждения ДНК объективно оценить масштаб ДНК повреждений, индуцированных генототоксикантом, следовательно, не позволяет получить надежную оценку генотоксического риска возникновения аномалий развития в рамках программы доклинической разработки ЛС.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков. Поставленная задача решается усовершенствованием техники и подхода для надежной и достоверной оценки генотоксического риска применения ЛС в популяции беременных женщин и детей.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в создании информативного и доказательного способа получения оценки генотоксического риска формирования внутриутробной патологии после воздействия потенциальных средовых тератогенов и прогноза эмбриотоксических рисков будущего медицинского применения ЛС для лечения пациентов в состоянии беременности и в области педиатрии.

Одновременно с указанным, технический результат заключается в универсальности предлагаемого способа для оценки генотоксического риска применения ЛС, в рамках доклинической разработки ЛС для различных популяций пациентов.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом оценки суммарной величины генотоксических эффектов ЛС, включающего in vivo исследование предмутагенного состояния генома методом ДНК-комет щелочной версии, заключающегося в том, что исследование проводят в образцах эмбрионов и плацент крыс в двух временных точках (t1 и t2) экспозиции генотоксикантом с регистрацией показателя «%ДНК-комет», далее используют анализ распределения и соотношения клеток с разной степенью поврежденности ДНК, дифференцируют клетки с % ДНК в хвосте кометы до 10%, клетки с % ДНК в хвосте кометы 10% - 50%, клетки с % ДНК в хвосте кометы более 50%, далее оценивают зависимости «%ДНК-комет - время» и «апоптотические кометы - время», определяют параметр AUC_t2-t1 по формуле площади трапеции:

в модификации:

где, AUC_t2-t1 - суммарная величина генотоксических эффектов, то есть, величина рассчитанная как площадь под кривой «%ДНК-комет - время» и % ДНК в хвосте кометы более 50% - время» (% ДНК в хвосте кометы более 50% - время) от первого момента регистрации максимального уровня повреждения t1 до момента времени максимального уровня ДНК-повреждения t2, после которого наблюдается снижение генотоксического эффекта % ДНК в хвосте кометы, то есть, AUC - параметр, характеризующий генотоксическое поражение в масштабе эмбриональных и плацентарных тканей за период всего времени генотоксического действия непосредственно на клетки плацент и эмбрионов и отражает суммарную величину индуцированных генотоксических эффектов исследуемых ЛС.

А - среднее величина показателя «%ДНК-комет»*, рассчитанная на образец в 1 временной точке (t1) - характеризует начало эскалации генотоксического эффекта, индуцированного отдельным экспериментальным тератогеном;

В - средняя величина показателя «%ДНК-комет»*, рассчитанная на образец в 2 временной точке (t2) - характеризует окончание эскалации генотоксического эффекта, индуцированного отдельным экспериментальным тератогеном;

h - разница между двумя временными точками t1 и t2, определяет временной интервал продолжительности гентоксического действия экспериментальных тератогенов.

*3а среднюю величину показателя «%ДНК-комет» принимают среднее значение % ДНК в хвосте кометы рассчитанное на образец (эмбрион или плацента).

Таким образом, за основание трапеции принимают среднее значение показателя «%ДНК-комет», рассчитанное в интервале максимального повреждения ДНК клеток эмбрионов или плаценты крыс, а за высоту - разницу между двумя точками временного интервала, в которые были зарегистрированы максимальные уровни поврежденности ДНК.

Сравнительную оценку контрольной и экспериментальных групп на основе суммарной величины индуцированных генотоксических эффектов, представляющую корректную и надежную меру центральной тенденции производят для целей сравнения риска формирования генотоксически обусловленных аномалий развития эмбрионов крыс при воздействии новых ЛС на этапе доклинической разработки по программе лекарственного обеспечения населения в Российской Федерации (Приказ Минздрава России №66 от 13.02.2013 г.; Постановление правительства РФ №305 от 15.04.2014 г.); или для выявления маркеров генотоксического риска средовых воздействий для разработки профилактических мероприятий.

Сущность способа: Для оценки генотоксического риска на доклиническом этапе разработки ЛС, предназначенных для медицинского применения беременными женщинами и в педиатрической популяции, используют беспородных белых крыс, на 12-15 день беременности, в количестве по 10 самок в контрольную и экспериментальную группы, далее беременных самок в каждой группе разделяют на подгруппы из 5 самок для исследования генотоксических эффектов в эмбриональных и плацентарных тканях в исследования в каждой из двух временных точек экспозиции гентоксикантом. Контрольным самкам вводят физиологический раствор, экспериментальным - исследуемый тератогенный фактор с генотоксическим потенциалом для индуцирования генотоксических эффектов в плацентах и эмбрионах в период активного органогенеза. После экспозиции, распределяют по 5 беременных самок в две подгруппы в каждой из опытных групп для исследования уровня повреждения ДНК в клетках эмбрионов и плаценты в разные интервалы времени действия генотоксикантана. Определяют методом ДНК-комет параметр % ДНК в хвосте кометы в клетках эмбрионов и плаценты контрольной и экспериментальной группы крыс в двух временных точках экспозиции. За статистическую единицу выборки принимают всех эмбрионов и плаценты от каждой беременной самки из пяти в каждой подгруппе, отобранной по временной экспозиции генотоксикантом. Используя критерий Колмогорова-Смирнова, находят распределение клеток с различной степенью поврежденности ДНК, при этом определяют количество клеток с % ДНК в хвосте кометы до 10%, с % ДНК в хвосте кометы 10% - 50%, с % ДНК в хвосте кометы более 50%, далее оценивают смещение в их соотношении в тканях эмбрионов и плацент контрольной и экспериментальной подгрупп в каждой временной точке экспозиции. Далее по выборке эмбрионов и плацент определяют для каждой из 5 крыс в каждой подгруппе среднее значение по показателям % ДНК в хвосте кометы до 50% и клетки с % ДНК в хвосте кометы более 50%, которые принимают за апоптотические кометы. Далее, используя средние значения % ДНК в хвосте кометы до 50%, рассчитанные от каждой самки по выборкам каждой подгруппы крыс 5+5 определяют параметр AUC_t2-t1, характеризующий суммарную величину генотоксических эффектов в плацентах или эмбрионах контрольной и экспериментальной групп в течение интервала времени t1 - t2 максимального повреждающего действия генотоксиканта в соответствие с зависимостью «% ДНК-комет - время», далее, используя средние значения % ДНК в хвосте кометы более 50%, рассчитанные от каждой самки по выборкам каждой подгруппы крыс 5+5 определяют параметр AUC_t2-t1, характеризующий суммарную величину апоптотических эффектов в плацентах или эмбрионах контрольной и экспериментальной групп в течение интервала времени t1 - t2 максимального повреждающего действия генотоксиканта в соответствие с зависимостью «апоптотические кометы -время».

Далее, проводят сравнение параметров AUC, характеризующего зависимость «%ДНК-комет - время» и «апоптотические кометы - время» контрольной группы с каждой экспериментальной группой.

Изобретение является универсальным для оценки генотоксического риска средовых факторов и ЛС, разрабатываемых для разных популяций.

Указанный технический результат достигается за счет следующего.

Внедрение в оборот безопасных и эффективных средств медицинской помощи является одной из ключевых задач программы лекарственного обеспечения населения в Российской Федерации (Приказ Минздрава России №66 от 13.02.2013 г.; Постановление правительства РФ №305 от 15.04.2014 г.). Успешное решение этой задачи осуществляется посредством своевременного усовершенствования нормативно-правового регулирования процесса разработки ЛС. Прежде всего это касается этапа ДКИ, объектом которых являются лабораторные животные и на основе которых, осуществляется первичное экспериментальное подтверждение безопасности и эффективности ЛС в перспективе их медицинского применения (Решение ЕЭК №202 от 26.11.2019 г.; Рекомендации ЕЭК №11 от 17.07.2018 г.; Руководство по экспертизе лекарственных средств, 2013 г.).

Проблема разработки достоверно безопасных и клинически проверенных схем терапевтической помощи беременным женщинам общеизвестна, уходит своими корнями в историю событий талидомидной трагедии и остается актуальной сегодня по причине высокого риска возникновения ВПР у плода. В следствие этого, участие беременных женщин в клинических исследованиях ограничено (ФЗ №61 от 12.04.2010 г. в редакции от 19.12.2022 г.), за исключением случаев, когда ЛС разрабатывается для применения непосредственно в этой целевой популяции или при острой необходимости фармакотерапии. С одной стороны, ограничение участия беременных женщин в клинических исследованиях является надлежащим требованием безопасности с другой, ограничивает возможности разработки и внедрения в клиническую практику эффективных и проверенных схем терапевтической помощи, что указывает на особую актуальность модернизации процесса доклинической разработки ЛС для решения проблемы обеспечения лекарственной безопасности беременных женщин и детей.

Одним из подходов к решению описанной проблемы является совершенствование методологической базы за счет внедрения математических инструментов, в частности, методов имитационного и вероятностного моделирования в ДКИ для более полного изучения фармакологических эффектов на этом этапе и получения надежных прогнозных оценок безопасности и эффективности медицинского применения ЛС в популяции беременных женщин и детей.

Внедрение математических методов в ДКИ обусловлено необходимостью повышения точности и научной значимости заключений о фармакологических эффектах ЛС, наблюдаемых у экспериментальных животных для получения весомых доказательств безопасности и прогнозных оценок их будущего клинического применения.

Актуальность предлагаемого подхода определяется также отсутствием достоверных предикторов безопасности и эффективности применения ЛС при беременности и высокой вероятностью перинатальных рисков, вызванных побочным действием фармакотерапии в виде инициирования мальформаций и/или когнитивных нарушений у потомства, выявляемых в постнатальный период развития.

Следует отметить, что оценка генотоксического риска на основе «меры центральной тенденции» является необходимым условием для построения прогноза вероятности возникновения ВПР с помощью инструментов математического моделирования. Но использование отдельных средних показателей поврежденности ДНК в качестве оценочных не является корректным, что снижает точность оценки. Поэтому в предлагаемом способе и была выстроена необходимость определения суммарной величины ДНК- повреждений с учетом именно периода генотоксической активности средового фактора и фармакодинамических особенностей ЛС, в частности биодоступности и продолжительности действия непосредственно на клетки эмбрионов и плацент.

Согласно вышеизложенному, поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности всех операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Осуществление изобретения выполняется следующим образом. Для количественной оценки уровня ДНК - повреждений в тканях эмбрионов и плаценты применяют метод ДНК-комет (щелочную версию). Общая схема метода включает приготовление гель-слайдов, получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию / фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ.

Предварительно проводят исследование на установление временного интервала максимальной генотоксической активности экспериментального тератогена или ЛС в тканях эмбрионов и плаценты крыс. Для этого выбирают 6 временных точек с учетом фармакодинамических особенностей, в частности, биодоступности тератогена или ЛС. Каждую временную экспозицию генотоксикантом исследуют на выборке из 3 крыс. Выбор интервалов между временными точками экспозиции генотоксикантом исследователь осуществляет с учетом фармакодинамических особенностей средового тератогена или ЛС, на основе литературных сведений или собственных поисковых экспериментов. После установления временных точек с максимальным уровнем повреждений ДНК, индуцированных потенциальным генотоксикантом в образцах эмбрионов и плаценты крыс, планируется основной эксперимент с включением в каждую группу исследования по 10 беременных самок, по 5 в каждую подгруппу временной экспозиции исследуемого средового генотоксиканта или ЛС.

Осуществление предлагаемого способа включает следующие этапы:

1) Взятие материала плацентарной и/или эмбриональной ткани проводят в определенный период эмбриогенеза крыс;

2) Микропрепараты эмбриональных тканей готовят методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток согласно методическим рекомендациям;

3) Микроскопирование проводят под флуоресцентным микроскопом с использованием компьютерного анализа цифровых изображений «ДНК-комет» в программной среде CASP;

4) В качестве показателя поврежденности используют параметр % ДНК в хвосте кометы, рекомендованный для оценки первичных ДНК-повреждений. На каждый микропрепарат рандомизированно анализируют не менее 100 «ДНК-комет» без наложений хвостов. Отдельно подсчитывают апоптотические клетки, выявляемые на микропрепаратах в виде слабо флуоресцирующих «ДНК-комет» с широким диффузным «хвостом»;

5) Далее общее количество исследованных клеток подвергают статистической обработке, в результате которой выявляют клетки с различной степенью фрагментации ДНК методом количественного анализа с применением критерия Колмогорова-Смирнова и построения таблиц частот и процентов. За норму принимают распределение и соотношения клеток с разной степенью поврежденности ДНК в группе контрольных крыс в разные дни активного органогенеза (с 12 по 15 дни беременности крыс).

6) Далее проводят анализ распределения и соотношения клеток с различной степенью поврежденности ДНК в подгруппах контрольной и экспериментальной групп: %ДНК в хвосте кометы до 10%, % ДНК в хвосте кометы 10% - 50%, % ДНК в хвосте кометы более 50%:

- клетки с % ДНК в хвосте кометы до 10%, которые принимают за норму с физиологически допустимым и необходимым, для процессов жизнедеятельности, уровнем ДНК-раскручивания и/или спонтанно-обусловленных разрывов;

- клетки с «% ДНК в хвосте кометы» 10% - 50%, которые оценивают, как показатель генотоксического эффекта с высоким риском мутационных событий, связанных с изменением генетического материала клеток организма, которое может привести к нарушению работы органов, развитию генетических заболеваний и формированию ВПР;

- клетки с «% ДНК в хвосте кометы» более 50% или апоптотические, которые оценивают, как показатель генотоксического эффекта с высоким уровнем повреждения, приводящим к апоптозу (гибели) клетки и как следствие, к нарушению равновесия в соотношении численности активно функционирующих и апоптотических клеток в развивающемся организме, что является маркером формирования апоптоз-зависимых, грубых изменений строения и функции органа или ткани (мальформаций);

7) На основе анализа распределения общее количество исследованных клеток группируют по степени фрагментации ДНК: % ДНК в хвосте кометы до 50% и % ДНК в хвосте кометы более 50%. Определяют средние значения % ДНК в хвосте кометы до 50% и % ДНК в хвосте кометы более 50% по выборкам клеток эмбрионов и плацент от каждой самки и по подгруппе временной экспозиции:

- определяют среднее значение показателя % ДНК в хвосте кометы до 50%, рассчитанное для клеточной совокупности в каждом отдельном образце эмбрионов и плацент от каждой крысы;

- определяют среднее значение % ДНК в хвосте кометы до 50% в каждой подгруппе крыс (5+5) для временных точек t1 и t2;

- определяют абсолютное значение показателя % ДНК в хвосте кометы более 50% (апоптотические кометы), рассчитанное в каждом отдельном образце эмбрионов и плацент и среднее значение по эмбрионам и плацентам каждой из крыс;

- определяют среднее значение % ДНК в хвосте кометы более 50% в каждой подгруппе крыс (5+5) для временных точек t1 и t2;

8) Далее, используя указанные средние значения % ДНК в хвосте кометы до 50% и % ДНК в хвосте кометы более 50% для каждой из временных точек t1 и t2, определяют для каждой контрольной и экспериментальной групп меру центральной тенденции в виде параметров суммарных величин генотоксических и апоптотических эффектов:

где, AUC_t2-t1 - суммарная величина генотоксических эффектов, то есть, величина рассчитанная как площадь под кривой % ДНК в хвосте кометы до 50% - время» или % ДНК в хвосте кометы более 50% - время» (апоптотические клетки - время) от первого момента регистрации максимального уровня повреждения t1 до момента времени максимального уровня ДНК-повреждения t2, после которого наблюдается снижение генотоксического эффекта % ДНК в хвосте кометы.

AUC - параметр, характеризующий генотоксическое поражение в масштабе эмбриональных и плацентарных тканей за период всего времени генотоксического действия и является мерой центральной тенденции, которая отражает суммарную величину индуцированных генотоксических эффектов.

9. Производят межгрупповое сравнение суммарных величин генотоксических эффектов AUC, рассчитанных для зависимости % ДНК в хвосте кометы до 50% - время» или % ДНК в хвосте кометы более 50% - время» (апоптотические клетки - время) как показателей генотоксического риска, и те из них, которые характеризуются большей величиной, считаются группой с более высоким эмбриотоксическим риском формирования ВПР.

Для доказательства правомерности применяемых в предлагаемом способе прогнозных критериев - указанных маркерных показателей % ДНК в хвосте кометы до 50% - время» или % ДНК в хвосте кометы более 50% - время» (апоптотические клетки - время) генотоксически обусловленного тератогенеза у крыс, был использован корреляционный анализ между полученными показателями и аномалиями развития у крыс в сравниваемых группах.

Краткое описание фигур и таблиц. Фигура 1.

Распределение ДНК-комет с различной степенью поврежденности. На фиг. 1 представлены фото ДНК-комет с различной степенью поврежденности, выраженной в % по длине хвоста ДНК клеток, полученные методом микроскопического анализа в эмбриональных тканях крыс. Микроскопирование проводят под флуоресцентным микроскопом с использованием компьютерного анализа цифровых изображений «ДНК-комет» в программной среде CASP.

Фигура 2. Диаграмма сопряженности генотоксических эффектов (AUC_{% ДНК-комет} и AUC_{апопт кометы}) с формированием морфологических пороков развития у крыс (многослойный перцептрон, построенный на базе алгоритмов нейронных сетей в пакете IBM SPSS).

Таблица 1. Сводные данные о распределении частот клеток с различной степенью фрагментации ДНК в эмбриональных тканях и плацентах контрольных и экспериментальных крыс.

Таблица 2. Суммарная оценка генотоксических эффектов в клетках плацент и эмбрионов за весь временной период повреждающего действия экспериментальных тератогенов

Таблица 3. Анализ корреляции между показателями молекулярно-генетических сдвигов в плацентарных тканях и формированием морфогенетических вариантов развития крыс, экспонированых гемической гипоксией, пренатальной алкоголизацией и циклофосфамидом в период внутриутробного развития.

Таблица 4. Анализ корреляции между показателями молекулярно-генетических сдвигов в эмбриональных тканях и формированием морфогенетических вариантов развития крыс, экспонированых гемической гипоксией, пренатальной алкоголизацией и циклофосфамидом в период внутриутробного развития

Таблица 5. Анализ корреляции между показателями молекулярно-генетических сдвигов в плацентарных и эмбриональных тканях в период внутриутробного развития с формированием когнитивного и эмоционального статуса у самцов (потомство F1) экспериментальных моделей тератогенеза в пубертатный период онтогенеза.

Таблица 6. Анализ корреляции между показателями молекулярно-генетических сдвигов в плацентарных и эмбриональных тканях в период внутриутробного развития с формированием когнитивного и эмоционального статуса у самок (потомство F1) экспериментальных моделей тератогенеза в пубертатный период онтогенеза.

Пример конкретной реализации предлагаемого способа.

Для апробации предложенного методического подхода была использована концептуальная схема, применимая для направленного поиска фармакологических корректоров тератогенеза на этапе ДКИ. Основой для построения концептуальной схемы явилась гипотеза о взаимосвязанности показателей патогенетических процессов, наблюдаемых на разных биологических уровнях и предположении о возможности разработки математической модели прогнозирования рисков ВПР на базе функции множественной регрессии.

Формулировка гипотезы в рамках концепции базировалась на системе эмпирических зависимостей, выявленных в результате биостатистического исследования совокупных данных оригинальных исследований:

нулевая гипотеза (Н0): β2=β3=…=βk=0,

против альтернативной (H1): (βj≠0, j=2,3…k., где β - коэффициент регрессии.

То есть, статистически, нулевая гипотеза была сформулирована как отсутствие значимых взаимосвязей между показателями генотоксических эффектов молекулярно-клеточного уровня (независимые переменные X) и врожденными морфогенетическими вариантами у крыс (зависимая переменная У). За доказательство альтернативной гипотезы было принято установление выше описанных взаимосвязей в формате сопряженности процессов молекулярно-клеточного уровня с формированием морфогенетических вариантов эмбриогенеза, расцениваемых как врожденные пороки развития.

Таким образом, было сделано предположение, что для подтверждения гипотезы H1 может быть использована математическая модель у=a+β1x1 + β2х2 + …+ … βnxn, разработанная на базе функции (Y=F(X)) и описывающая корреляционно зависимые изменения, протекающие на молекулярно-клеточном, тканевом, органном и морфофункциональном (системном) уровнях эмбриогенеза экспериментальных крыс.

Подбор целевых параметров для математической модели, отражающей концепцию сопряженности процессов в многоуровневой биологической системе экспериментального тератогенеза, осуществляли из сводной базы результатов оригинальных исследований.

Выбор животных, дозовых нагрузок и временных экспозиций для получения экспериментальных моделей тератогенеза, основывался на литературных данных, методических рекомендациях и результатах собственных пилотных экспериментов.

В исследованиях по оценке генотоксических эффектов группы животных включали беременных самок, в эксперимент включали всех полученных эмбрионов и плаценты на этапе органогенеза (13-15 дни эмбриогенеза).

В исследованиях по оценке эмбиротоксических эффектов выборка включала не менее 10 беременных самок в каждой группе, исследовали всех полученных 20-дневных эмбрионов.

В исследованиях поведенческой и когнитивной деятельности, рандомизировали по 10 самок и 10 самцов из числа потомства первого поколения экспериментальных самок, за исключением моделей тератогенеза.

Для получения беременных самок использовали схему подсадки к самцам на 24 часа в соотношении 2:1, день обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках принимали за 1-й день беременности.

Модель химически-индуцированного тератогенеза создавали однократным внутрибрюшинным (в/б) введением тератогена циклофосфамида (ЦФА) в дозе 20 мг/кг на 14 день беременности самок крыс. Выбор дозы ЦФА основывался на литературных сведениях и данных собственных предварительных экспериментов. Максимальный генотоксический эффект ЦФА в тканях плацент и эмбрионов был выявлен на 15 день эмбриогенеза через 20 и 24 часа экспозиции, соответственно.

Моделирование гемической гипоксии (ГГ) осуществляли внутрибрюшинным введением (в/б) нитрита натрия в дозе 40 мг/кг с 12 по 18 день беременности крыс. Выбор дозы нитрита натрия основывался на литературных сведениях и данных собственных пилотных экспериментов. Максимальный генотоксический эффект гемической гипоксии в тканях плацент и эмбрионов был выявлен на 14 день эмбриогенеза через 3 и 6 часов экспозиции, соответственно.

Моделирование пренатальной алкоголизации (ПА) осуществляли пероральным введением 40% этилового раствора (per os, в дозе 4,3 мл/кг) с 10 по 19 день беременности крыс. Выбор дозы основывался на литературных данных и результатах пилотных экспериментов. По данным пилотных экспериментов максимальный генотоксический эффект в тканях плацент и эмбрионов был выявлен на 13 день эмбриогенеза через 3 и 6 часов экспозиции, соответственно.

Оценка повреждений ДНК проводилась методом компьютерной микроскопии с визуализацией микропрепаратов и автоматизированным расчетом длины хвоста ДНК-комет клеток, выраженной в процентах (%).

Статистический анализ результатов экспериментов осуществляли с использованием программных приложений (Statistica 8.0, IBM SPSS 20). Сравнение групп по количественным признакам проводили с использованием параметрической и непараметрической статистики в зависимости от распределения данных, оценку зависимостей между признаками - методом корреляционного и регрессионного анализа для количественных переменных.

Фиг. 1 содержит фото ДНК-комет с различной степенью поврежденности, выраженной в % по длине хвоста ДНК клеток.

В результате статистической обработки данных установлено соотношение частот клеток с различной степенью фрагментации ДНК в тканях плацент и эмбрионов контрольных крыс, которое было принято за показатель нормального молекулярно-генетического баланса.

В таблице 1 приведены данные о распределении клеток с различной степенью фрагментации ДНК в тканях плацент и эмбрионов контрольных и экспериментальных крыс.

На следующем этапе проведена сравнительная оценка сдвигов в соотношении частот клеток с разной степенью фрагментации ДНК, индуцированных экспериментальными тератогенами. Сдвиг соотношения частот клеток плацент и эмбрионов в сторону увеличения клеток с «% ДНК в хвосте», превышающих 10% определяли, как показатель нарушения молекулярно-генетического равновесия, запускающего процессы тератогенеза.

В результате анализа было установлено, что действие всех экспериментальных генотоксикантов приводили к статистически значимому увеличению поврежденности ДНК в клетках плацент и эмбрионов. Однако были выявлены существенные различия по уровню поврежденности ДНК, времени реализации «максимального» уровня поврежденности ДНК для каждой экспериментальной модели тератогенеза и длительности повреждающего эффекта исследуемых генотоксикантов.

Например, при изучении циклофосфамидной модели тератогенеза максимальный уровень индуцированных ДНК-повреждений зарегистрирован через 20 и 24 часа, соответственно для плацент и эмбрионов. Для модели тератогенеза, индуцированного гемической гипоксией и алкоголем - 3 и 6 часов, соответственно для плацент и эмбрионов.

Суммарная оценка (AUC) уровня повреждения ДНК клеток плацент и эмбрионов с учетом продолжительности генотоксического действия экспериментальных тератогенов.

Биостатистический подход к оценке суммарной величины генотоксического поражения плацент и эмбрионов, базировался на формуле площади трапеции, то есть определялся как полусумма оснований, умноженная на высоту (таблица 2):

где S - площадь трапеции,

А - средняя величина показателя «%ДНК-комет»*, измеренная за 1 временную точку, характеризующую начало эскалации генотоксического эффекта, индуцированного отдельным экспериментальным тератогеном;

В - средняя величина показателя «%ДНК-комет»*, измеренная за 2 временную точку, характеризующая окончание эскалации генотоксического эффекта, индуцированного отдельным экспериментальным тератогеном;

h - разница между двумя временными точками определяющая временной интервал продолжительности гентоксического действия экспериментальных тератогенов.

*За среднюю величину показателя «%ДНК-комет» принимают среднее значение «%ДНК в хвосте кометы» рассчитанное на образец (эмбрион или плацента).

Таким образом, за основание трапеции было принято среднее значение «%ДНК-комет» за промежуток времени (с учетом временного интервала экспонирования экспериментальным тератогенам), а за высоту - разница между двумя точками временного интервала, в которые были зарегистрированы максимальные уровни поврежденности ДНК.

Формула площади трапеции (1) была модифицирована таким образом, что в модификации базовой формулы площади трапеции за основание было принято среднее значение «%ДНК-комет», рассчитанное за промежуток времени отдельно взятой генотоксической активности экспериментального тератогена, а за высоту - разница между двумя точками временного интервала, в которые были зарегистрированы максимальные уровни «%ДНК-комет». За среднюю величину «%ДНК-комет», для временных точек t1 и t2 было принято среднее значение «%ДНК-комет», рассчитанное для клеточной совокупности в каждом отдельном образце эмбрионов и плацент:

Для экспериментальной модели циколфосфомид-индуцированного тератогенеза уровень генотоксического поражения плацент и эмбрионов рассчитывался по модифицированной формуле:

А - средняя величина % ДНК-комет измеренная через 20 часов после обработки беременных крыс циклофосфамидом;

В - средняя величина «% ДНК-комет» измеренная через 24 часа после обработки беременных крыс циклофосфамидом (см. Материалы и методы);

h - разница между двумя временными точками, то есть 24-20=4 часа.

Для экспериментальных моделей тератогенеза, индуцированного гемической гипоксией и пренатальной алкоголизацией уровень генотоксического поражения плацент и эмбрионов рассчитывался по модифицированной формуле:

А - средняя величина показателя «% ДНК-комет» измеренная через 3 часа после обработки беременных крыс нитритом натрия или этиловым раствором;

В - средняя величина показателя «% ДНК-комет» измеренная через 6 часов после обработки беременных крыс нитритом натрия или этиловым раствором (см. Материалы и методы);

h - разница между двумя временными точками, то есть 6-3=3 часа.

Таким образом, по результатам выше описанных данных был разработан новый способ оценки генотоксичности средовых факторов и ЛС, позволяющий оценивать суммарную величину генотоксического поражения клеток эмбрионов и плацент за весь период тератогенного действия, основанный на дифференцировании степени повреждения ДНК и временной зависимости ("ДНК-комет - время экспозиции") и адаптации методов доказательной медицины к генотоксикологической оценке разрабатываемых ЛС.

Этап прогнозирования эмбриотоксического риска взаимосвязанного с генотоксическим действием экспериментальных тератогенов и антигенотоксических и антитератогенных эффектов фабоматизола осуществлялось на базе корреляции Спирмена, алгоритмов множественной регрессии и нейронных сетей в пакете IBM SPSS (фиг. 2).

Полученные данные подтверждают применимость представленного подхода для системного исследования генотоксических идукторов тератогенеза и поиска ЛС для фармакологической коррекции ВПР.

Визуальным отображением описанных взаимосвязей явились диаграммы (фиг. 2), построенные на базе алгоритма нейронных сетей.

В рамках научной гипотезы сопряженности тератогенных процессов были проанализированы причинно-следственные взаимосвязи и представлены объективные доказательства зависимости формирования мальформаций (таб. 3, 4) и отдаленных последствий функциональных нарушений (таб. 5, 6) от степени генотоксических поражений, инициированных на молекулярно-клеточном и тканевом уровне плацент и эмбрионов, наблюдаемых у экспериментальных моделей тератогенеза в период новорожденности и постнатального развития.

Подбор данных для биостатистического моделирования сопряженности молекулярно-генетических сдвигов в эмбриональных тканях на этапе органогенеза с частотой формирования морфогенетических вариантов развития к моменту новорожденности внутриутробно экспонированных крыс проводился на базе данных экспериментального моделирования тератогенеза.

Сопряженность между генотоксическими показателями степени поражения плацент и эмбрионов и, формированием анатомических аномалий развития была подтверждена с помощью парной ранговой корреляции Спирмена (таб. 3,4. Фиг. 2.).

Было показано, что генотоксические сдвиги в тканях плацент и эмбрионов взаимосвязаны с формированием мальформаций у крыс. Установление корреляционных связей между показателями метаболического дисбаланса и формированием морфологических аномалий подтверждает сопряженность процессов в многоуровневой биологической системе и значимость индуцированных гормональных сдвигов в нарушении механизмов эмбриогенеза.

Таким образом, представленные результаты подтверждают адекватность и применимость математической модели прогноза риска возникновения анатомических и функциональных нарушений у крыс, подвергнутых в период внутриутробного развития действию генотоксикантов для прогнозирования антитератогенной активности фабомотизола. Одновременно, полученные результаты явились дополнительным подтверждением доказательства альтернативной гипотезы (H1) о корреляционно зависимых изменениях между показателями генотоксических эффектов молекулярно-клеточного уровня (независимые переменные X) и врожденными морфогенетическими вариантами у крыс (зависимая переменная У).

При нормальном течение эмбриогенеза контрольных крыс в тканях плацент и эмбрионов имеется характерное соотношение частот клеток с различной степенью фрагментации ДНК. Эти данные дают основание рассматривать указанное соотношение частот ДНК в качестве маркерного показателя «глобальной оценки» молекулярно-генетического уровня эмбриогенеза.

На базе изученных закономерности распределения частот клеток с различной степенью фрагментации ДНК у контрольных животных была проведена оценка генотоксических сдвигов на экспериментальных моделях тератогенеза с учетом чувствительных периодов эмбриогенеза крыс и временных интервалов, в течение которых экспериментальные тератогены повреждают максимальное число клеток в тканях плацент и эмбрионов.

Разработана модель зависимости «% ДНК-комет - время» (AUC_t2-t1) и «апоптотические кометы - время» (AUC_t2-t1), которая предназначена для анализа совокупной величины генотоксических эффектов за весь период воздействия действия генотоксического фактора в тканях плацент и эмбрионов. Способ рекомендуется применять как при решении отдельных медико-биологических задач по оценке генотоксичности ЛС и средовых факторов различной природы, так и на этапе доклинической разработки ЛП в рамках комплексной оценки ключевых факторов риска для оценки соотношения польза / риск при планировании клинических исследований с целью дальнейшего медицинского применения в целевых популяциях пациентов.

Разработан методологический подход на базе математических моделей доказательной медицины с элементами прогнозирования безопасности и эффективности ЛС, позволяющий оценить совокупный генотоксический риск на этапе доклинических исследований ЛС. Полученные результаты позволяют определять на доклиническом этапе разработки основные факторы риска, обусловленные генотокосическими эффектами ЛС и прогнозировать их безопасность при применении в человеческой популяции.

Изобретение относится к области биологии и медицины. Описан способ оценки суммарной величины генотоксических эффектов потенциального генотоксиканта. Способ включает исследование методом щелочной версии ДНК-комет. Исследование проводят с регистрацией показателей ДНК-повреждений в двух временных точках экспозиции генотоксикантом, в образцах эмбрионов и/или плаценты 10 крыс, по 5 крыс в каждой временной точке t1 и t2, определяют параметр % ДНК-комет в отдельных клетках образцов эмбрионов и плацент. Далее определяют распределение и соотношение клеток с разной степенью поврежденности ДНК в масштабе клеточно-тканевого уровня эмбрионов и плацент в каждой временной точке экспозиции t1 и t2. Клетки, в которых показатель % ДНК в хвосте кометы до 10%, принимают за норму с физиологически допустимым уровнем ДНК-раскручивания и/или спонтанно-обусловленных разрывов. Клетки с % ДНК в хвосте кометы 10-50% устанавливают как показатель генотоксического эффекта. Клетки с % ДНК в хвосте кометы более 50% считают апоптотическими. Далее определяют суммарный показатель AUC_t2-t1, описывающий зависимость %ДНК-комет – время. Если определяют суммарную величину генотоксических эффектов, считают среднее значение показателя % ДНК в хвосте кометы до 50%, измеренного в отдельных образцах через t1 и t2 часов после обработки генотоксикантом, далее определяют параметр AUC_t2-t1 по формуле площади трапеций в модификации, далее, по выборке всех эмбрионов и/или плацент от 10 крыс. Если определяют суммарный показатель апоптотического поражения, описывающего зависимость апоптотические кометы - время, то считают показатель апоптотические кометы, измеренный в отдельных образцах через t1 и t2 часов после обработки генотоксикантом. Далее определяют среднее значение показателя по выборке эмбрионов и плацент от 10 крыс, при этом определяют параметр AUC_t2-t1 по алгоритму, аналогично описанному для зависимости % ДНК-комет - время. Также описано применение способа по п. 1 в биологических и медицинских исследованиях. Изобретение может применяться в экспериментальной фармакологии и целевых программах доклинических исследований для прогноза генотоксического риска врожденных пороков развития и безопасности медицинского применения лекарственных средств. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл.

1. Способ оценки суммарной величины генотоксических эффектов потенциального генотоксиканта, который включает исследование методом щелочной версии ДНК-комет, отличающийся тем, что исследование проводят с регистрацией показателей ДНК-повреждений в двух временных точках экспозиции генотоксикантом, в образцах эмбрионов и/или плаценты 10 крыс, по 5 крыс в каждой временной точке t1 и t2, определяют параметр %ДНК-комет в отдельных клетках образцов эмбрионов и плацент, далее определяют распределение и соотношение клеток с разной степенью поврежденности ДНК в масштабе клеточно-тканевого уровня эмбрионов и плацент в каждой временной точке экспозиции t1 и t2, при этом клетки, в которых показатель % ДНК в хвосте кометы до 10%, принимают за норму с физиологически допустимым уровнем ДНК-раскручивания и/или спонтанно-обусловленных разрывов, клетки с % ДНК в хвосте кометы 10-50% устанавливают как показатель генотоксического эффекта, клетки с % ДНК в хвосте кометы более 50% считают апоптотическими, далее определяют суммарный показатель AUC_t2-t1, описывающий зависимость % ДНК-комет - время, при этом:

- если определяют суммарную величину генотоксических эффектов, считают среднее значение показателя % ДНК в хвосте кометы до 50%, измеренного в отдельных образцах через t1 и t2 часов после обработки генотоксикантом, далее определяют параметр AUC_t2-t1 по формуле площади трапеций в модификации, далее по выборке всех эмбрионов и/или плацент от 10 крыс,

- если определяют суммарный показатель апоптотического поражения, описывающего зависимость апоптотические кометы - время, то считают показатель апоптотические кометы, измеренный в отдельных образцах через t1 и t2 часов после обработки генотоксикантом, далее определяют среднее значение показателя по выборке эмбрионов и плацент от 10 крыс, при этом определяют параметр AUC_t2-t1 по алгоритму, аналогично описанному для зависимости %ДНК-комет - время.

2. Применение способа по п. 1 в биологических и медицинских исследованиях.