СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИСБИОЗА У ПТИЦЫ Российский патент 2014 года по МПК G01N1/00 

Изобретение относится к диагностике состояния желудочно-кишечного тракта птицы и может быть использовано для определения ранних дисбиозных состояний по составу равновесной газовой фазы над пробами помета.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является диагностика заболевания микробиологическими методами: посевом на функционально-диагностические питательные среды [Антонов Б.И. Лабораторные исследования в ветеренарии. М.: Агропромиздат. - 1986, 352 с.].

Недостатками способа являются длительность (72 и более часа), субъективность, необходимость использования нескольких дифференциально-диагностических сред, невозможность диагностики заболевания на начальной стадии развития и высокая себестоимость анализов.

Оценку наличия дисбиозных состояний кишечника птицы проводят по изменению концентрации легколетучих газов-маркеров (органических кислот, серусодержащих соединений, аминов различной природы, спиртов, сложных эфиров, свободной влаги) в равновесной газовой фазе над пометом, регистрируемых устройством типа «электронный нос». Принципиальное значение имеет соотношение содержания отдельных классов указанных соединений в равновесной газовой фазе.

Техническая задача изобретения заключается в разработке способа определения дисбиоза у птицы, позволяющего диагностировать дисбиоз на ранней стадии, интенсифицировать процесс, снизить себестоимость анализа, повысить точность, надежность, воспроизводимость полученных данных.

Для решения технической задачи изобретения предложен способ определения дисбиоза у птицы, характеризующийся тем, что он предусматривает использование детектирующего устройства типа «электронный нос» на основе массива из 8 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, электроды которых модифицируют покрытиями, чувствительными к азотсодержащим органическим соединениям, алифатическим кислотам, сложным эфирам, аминам ароматическим и алифатическим, аминокислотам, аммиаку, серусодержащим соединениям, воде, для чего на электроды наносят пленки из ацетоновых растворов поливинилпирролидона, тритона Х-100 (ТХ-100), полиэтиленликоль фталата и бромкрезолового синего, метилового оранжевого на подложку, сформированную из хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок, из толуольных растворов дициклогексана-18-краун-6, полиэтиленгликоль сукцината, полидиэтиленгликоль сукцината с общей массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг, пьезосенсоры помещают в ячейку детектирования, подготовленное детектирующее устройство подключают к компьютеру и включают программу, регистрирующую сигналы пьезосенсоров в режиме реального времени, сигналы массива пьезосенсоров, при обследовании птицы с помощью детектирующего устройства типа «электронный нос» на наличие у них дисбиоза кишечника сначала определяют суммарное содержание газов-маркеров заболевания, для чего среднюю пробу помета птицы массой 5,00 г помешают в стерильную стеклянную емкость с мягкой мембраной, термостатируют при температуре 25°С в течение 20 минут, отбирают индивидуальным шприцем 5 см³ равновесной газовой фазы и вводят в ячейку детектирования, с помощью программы регистрируют максимальные сигналы массива пьезосенсоров, после чего включают компрессор на 1-2 минуты для очистки ячейки детектирования и пьезосенсоров, затем рассчитывают условный показатель дисбиоза как соотношение максимальных сигналов сенсоров с пленками поливинилпирролидона (ПВП) к полидиэтиленгликоль сукцината (ПДЭГС) $$(ПД=\Delta F_{ПВП}^{\max }/\Delta F_{ПДЭГС}^{\max }),$$ отражающих соотношение содержания свободной воды к аминам в равновесной газовой фазе над пробой, если показатель дисбиоза меньше 1,10±0,05, делают вывод о наличии дисбиозного состояния птицы, при этом максимальные сигналы других сенсоров в массиве, связанных с содержанием других газов-маркеров, таких как сложные эфиры, алифатические и аминокислоты, серусодержащие соединения, должны быть меньше в равновесной газовой фазе, чем сигналы сенсоров, детектирующих воду, с покрытием поливинилпирролидон, и амины, с покрытием полидиэтиленгликоль сукцинат, при этом содержание отдельных классов соединений (ω) рассчитывают методом нормировки $$\omega =\frac{\Delta F_i}{{\displaystyle \sum _i\Delta F_i}}\times 100\%.$$

Технический результат изобретения заключается в диагностике дисбиоза на ранней стадии, интенсификации процесса диагностики, повышении точности, надежности, воспроизводимости полученных данных по сравнению с известными методиками.

Способ определения дисбиоза у птицы осуществляется следующим образом.

Для определения дисбиоза у птицы используют детектирующее устройство типа «электронный нос» на основе массива из 8 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, электроды которых модифицируют чувствительными покрытиями к азотсодержащим органическим соединениям, алифатическим кислотам, сложным эфирам, аминам ароматическим и алифатическим, аминокислотам, аммиаку, серусодержащим соединениям, воде, для чего на электроды наносят пленки из ацетоновых растворов поливинилпирролидона, тритона Х-100, полиэтиленликоль фталата и бромкрезолового синего, метилового оранжевого на подложки, сформированные из хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок; из толуольных растворов дициклогексана-18-краун-6, полиэтиленгликоль сукцината полидиэтиленгликоль сукцината с общей массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг, обеспечивающие высокую чувствительность, низкий предел обнаружения. Избыток растворителя удаляют в сушильном шкафу в течение 15-20 мин при температуре 40°С.

Пьезосенсоры помещают в массив, закрывают ячейку детектирования, подключают к компьютеру, включают программу, регистрирующую сигналы пьезосенсоров (изменение частоты колебаний пьезосенсора, ΔF, Гц) в режиме реального времени, что позволяет проследить ход сорбции газов, полноту регенерации системы, готовность к следующему измерению. На ее основании в программе затем регистрируются максимальные сигналы всех сенсоров массива. Стерильным шприцем отбирают 5 см³ равновесной газовой фазы над пробой помета, вкалывают в ячейку детектирования и фиксируют в течение 1 мин сигналы пьезосенсоров. Включают компрессор для очистки ячейки детектирования и пьезосенсоров на 1-2 мин.

С помощью программы рассчитывают условный показатель дисбиоза (ПД) как соотношение максимальных сигналов сенсоров с пленками ПВП к ПДЭГС $$(ПД=\Delta F_{ПВП}^{\max }/\Delta F_{ПДЭГС}^{\max }),$$ соответствующих соотношению содержания свободной воды и аминов в равновесной газовой фазе над пробой помета, если показатель дисбиоза меньше 1,10±0,05, делают вывод о наличии дисбиозного состояния кишечника птицы, при этом максимальные сигналы других сенсоров в массиве, следовательно, содержание других газов-маркеров дисбиоза (спиртов, сложных эфиров, алифатических и аминокислот, серусодержащих соединений), должно быть меньше в равновесной газовой фазе, чем содержание воды и аминов, т.е. сигналы сенсоров с пленками ПВП и ПДЭГС.

Продолжительность анализа с учетом подготовки системы составляет 30 мин, время единичного измерения 1-2 мин; число измерений без обновления массива сенсоров >300. Правильность диагностики по заявляемому способу подтверждается стандартными методами диагностирования дисбиоза у птиц, в отношении наиболее важных представителей нормофлоры (табл.1).

Способ определения дисбиоза у птицы поясняется следующим примером.

Пример 1 (прототип). Продемонстрируем способ на примере анализа проб помета контрольной и опытной группы кур с дисбиозом.

Для оценки наличия дисбиоза у кур используют детектирующее устройство типа «электронный нос» на основе массива из 8 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, электроды которых модифицируют чувствительными покрытиями к азотсодержащим органическим соединениям, алифатическим кислотам, спиртам, сложным эфирам, аминам ароматическим и алифатическим, аминокислотам, аммиаку, серусодержащим соединениям, воде, для чего на электроды наносят пленки из ацетоновых растворов поливинилпирролидона, тритона Х-100, полиэтиленликоль фталата и бромкрезолового синего, метилового оранжевого на сформированные из хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок подложки; из толуольных растворов дициклогексана-18-краун-6, полиэтиленгликоль сукцината полидиэтиленгликоль сукцината с общей массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг, обеспечивающие высокую чувствительность, низкий предел обнаружения. Избыток растворителя удаляют в сушильном шкафу в течение 15-20 мин при температуре 40°С.

Пьезосенсоры помещают в массив, закрывают ячейку детектирования, подключают к компьютеру, включают программу, регистрирующую сигналы пьезосенсоров (изменение частоты колебаний пьезосенсора, ΔF, Гц) в режиме реального времени, что позволяет проследить ход сорбции газов, полноту регенерации системы, готовность к следующему измерению. На ее основании в программе затем регистрируются максимальные сигналы всех сенсоров массива.

Стерильным шприцем отбирают 5 см³ равновесной газовой фазы над пробой помета, вкалывают в ячейку детектирования и фиксируют в течение 1 мин сигналы пьезосенсоров. С помощью программы сохраняют результаты измерения в базу данных. Включают компрессор для очистки ячейки детектирования и пьезосенсоров на 1-2 мин.

Рассчитывают долю газов-маркеров в равновесной газовой фазе над пробами помета методом нормировки сигналов сенсоров:

- Алифатические кислоты и аминокислоты: $$\omega =\frac{\Delta F_{МО/УНТ}}{{\displaystyle \sum _i\Delta F_i}}\times 100\%.$$

- Сложные эфиры: $$\omega =\frac{\Delta F_{ПЭГФ}}{{\displaystyle \sum _i\Delta F_i}}\times 100\%.$$

- Свободная вода: $$\omega =\frac{\Delta F_{ПВП}}{{\displaystyle \sum _i\Delta F_i}}\times 100\%.$$

- Алифатические амины: $$\omega =\frac{\Delta F_{ПДЭГС}}{{\displaystyle \sum _i\Delta F_i}}\times 100\%.$$

- Серусодержащие соединения: $$\omega =\frac{\Delta F_{ТХ-100}}{{\displaystyle \sum _i\Delta F_i}}\times 100\%.$$

Рассчитывают условный показатель дисбиоза (ПД) как соотношение максимальных сигналов сенсоров с пленками ПВП к ПДЭГС $$(ПД=\Delta F_{ПВП}^{\max }/\Delta F_{ПДЭГС}^{\max }),$$ соответствующих соотношению содержания свободной воды и аминов в равновесной газовой фазе над пробой помета, если показатель дисбиоза меньше 1,10±0,05, делают вывод о дисбиозе у кур, при этом максимальные сигналы других сенсоров в массиве, следовательно, содержание других газов-маркеров дисбиоза (сложных эфиров, алифатических и аминокислот, серусодержащих соединений), должно быть меньше в равновесной газовой фазе, чем содержание воды и аминов, т.е. меньше сигналов сенсоров с пленками ПВП и ПДЭГС.

Так, в пробах помета кур контрольной группы не фиксируется наличие дисбиоза, показатель дисбиоза больше 1,10±0,05, при этом содержание других газов-маркеров дисбиоза оставалось стабильным (табл.1, 2).

В пробах помета кур опытной группы установлено наличие дисбиоза, при этом содержание газов-маркеров дисбиоза уменьшалось и показатель дисбиоза увеличивался (табл.1, 2).

Продолжительность анализа с учетом подготовки системы составляет 30 мин, время единичного измерения 1-2 мин; анализа 1 пробы при подготовленном приборе 30 мин; число измерений без обновления массива сенсоров >300. Возможно определение дисбиоза у кур, правильность диагностики по заявляемому способу подтверждается стандартными методами. Результаты анализа по заявляемому способу и сопоставление их со стандартными методами представлено в табл. 3.

Способ осуществим.

Как следует из табл.1, 2, 3, предлагаемый способ эффективен для определения дисбиоза у кур на ранней стадии, интенсификации процесса, повышении точности, надежности, воспроизводимости полученных данных по сравнению с известными методиками и позволяет существенно снизить себестоимость анализа по сравнению с известными методиками.

Изменение массы покрытия на электродах пьезосенсора, природы сорбентов, алгоритмов обработки аналитической информации ухудшает метрологические характеристики способа, способствует возрастанию доли ошибочных выводов.

Предлагаемый способ определения дисбиоза у птиц позволяет

- упростить, повысить точность и надежность способа определения дисбиоза у птицы;

- диагностировать дисбиоз на ранней стадии,

- детектировать различные классы органических веществ в равновесной газовой фазе над пробами помета;

- повысить информативность диагностики по условному показателю дисбиоза - соотношению содержания свободной воды и аминов, за счет специальной обработки данных.

- снизить себестоимость анализа.

Таблица 1 Группы Количественное выражение микроорганизмов в пробах, lgKOE/г E.coli Lactobacillus spp. Bifidobacterium spp. Контрольная 7 9 8 Опытная 10 3 микроорганизмы не обнаружены

Изобретение относится к диагностике состояния желудочно-кишечного тракта птицы и может быть использовано для определения дисбиоза по составу равновесной газовой фазы над пробами помета. Способ определения дисбиоза у птицы характеризуется тем, что он предусматривает использование детектирующего устройства типа «электронный нос» на основе массива из 8 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, электроды которых модифицируют покрытиями, чувствительными к азотсодержащим органическим соединениям, алифатическим кислотам, сложным эфирам, аминам ароматическим и алифатическим, аминокислотам, аммиаку, серусодержащим соединениям, воде. При обследовании птицы с помощью детектирующего устройства типа «электронный нос» на наличие у них дисбиоза кишечника сначала определяют суммарное содержание газов-маркеров заболевания, для чего среднюю пробу помета птицы массой 5,00 г помешают в стерильную стеклянную емкость с мягкой мембраной, термостатируют при температуре 25^оС в течение 20 минут, отбирают индивидуальным шприцем 5 см³ равновесной газовой фазы и вводят в ячейку детектирования, с помощью программы регистрируют максимальные сигналы массива пьезосенсоров. После чего включают компрессор на 1 - 2 минуты для очистки ячейки детектирования и пьезосенсоров. Затем рассчитывают условный показатель дисбиоза как соотношение максимальных сигналов сенсоров с пленками поливинилпирролидона (ПВП) к полидиэтиленгликоль сукцината (ПДЭГС), отражающих соотношение содержания свободной воды к аминам в равновесной газовой фазе над пробой, если показатель дисбиоза меньше 1,10±0,05, делают вывод о наличии дисбиозного состояния птицы, при этом максимальные сигналы других сенсоров в массиве, связанных с содержанием других газов-маркеров, таких как сложные эфиры, алифатические и аминокислоты, серусодержащие соединения, должны быть меньше в равновесной газовой фазе, чем сигналы сенсоров, детектирующих воду, с покрытием поливинилпирролидон, и амины, с покрытием полидиэтиленгликоль сукцинат, при этом содержание отдельных классов соединений (ω) рассчитывают методом нормировки .

Техническим результатом является повышение точности и надежности, повышение информативности диагностики по условному показателю дисбиоза - соотношению содержания свободной воды и аминов, а также детектирование различных классов органических веществ в равновесной газовой фазе над пробами помета упрощено. 3 табл.

1.
Способ определения дисбиоза у птицы, характеризующийся тем, что он предусматривает использование детектирующего устройства типа «электронный нос» на основе массива из 8 пьезосенсоров с базовой частотой колебаний 10-15 МГц, электроды которых модифицируют покрытиями, чувствительными к азотсодержащим органическим соединениям, алифатическим кислотам, сложным эфирам, аминам ароматическим и алифатическим, аминокислотам, аммиаку, серусодержащим соединениям, воде, для чего на электроды наносят пленки из ацетоновых растворов поливинилпирролидона, тритона Х-100 (ТХ-100), полиэтиленликоль фталата и бромкрезолового синего, метилового оранжевого на подложку, сформированную из хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок, из толуольных растворов дициклогексана-18-краун-6, полиэтиленгликоль сукцината, полидиэтиленгликоль сукцината с общей массой покрытия после удаления растворителя 4-10 мкг, пьезосенсоры помещают в ячейку детектирования, подготовленное детектирующее устройство подключают к компьютеру и включают программу, регистрирующую сигналы пьезосенсоров в режиме реального времени, сигналы массива пьезосенсоров, при обследовании птицы с помощью детектирующего устройства типа «электронный нос» на наличие у них дисбиоза кишечника сначала определяют суммарное содержание газов-маркеров заболевания, для чего среднюю пробу помета птицы массой 5,00 г, помешают в стерильную стеклянную емкость с мягкой мембраной, термостатируют при температуре 25 ^оС в течение 20 минут, отбирают индивидуальным шприцем 5 см³ равновесной газовой фазы и вводят в ячейку детектирования, с помощью программы регистрируют максимальные сигналы массива пьезосенсоров, после чего включают компрессор на 1 - 2 минуты для очистки ячейки детектирования и пьезосенсоров, затем рассчитывают условный показатель дисбиоза как соотношение максимальных сигналов сенсоров с пленками поливинилпирролидона (ПВП) к полидиэтиленгликоль сукцината (ПДЭГС) (ПД=∆ $$F_{ПВП}^{\max }$$ /∆ $$F_{ПДЭГС}^{\max }$$ ), отражающих соотношение содержания свободной воды к аминам в равновесной газовой фазе над пробой, если показатель дисбиоза меньше 1,10±0,05 делают вывод о наличии дисбиозного состояния птицы, при этом максимальные сигналы других сенсоров в массиве, связанных с содержанием других газов-маркеров, таких как сложные эфиры, алифатические и аминокислоты, серусодержащие соединения, должны быть меньше в равновесной газовой фазе, чем сигналы сенсоров, детектирующих воду, с покрытием поливинилпирролидон, и амины, с покрытием полидиэтиленглиоль сукцинат, при этом содержание отдельных классов соединений (ω) рассчитывают методом нормировки