ШТАММ FUSARIUM SAMBUCINUM - ПРОДУЦЕНТ ГРИБНОЙ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/14 C12P21/00 C12R1/77 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии и касается получения нового штамма-продуцента пищевой грибной белковой биомассы. Наиболее эффективно настоящее изобретение может быть использовано при производстве грибной белковой биомассы методом жидкофазного глубинного культивирования в пищевой и медицинской промышленности.

Уровень техники

Среди продуцентов грибной белковой биомассы, получаемой путем жидкофазного глубинного культивирования, известны штаммы родов Agaricus [Kyoungju Kirn et al. (2011). Bioproduction of mushroom mycelium of Agaricus bisporus by commercial submerged fermentation of the production of meat analogue.// J Sci Food Agric, Vol.91, pp.1561-1568], Pleurotus [Jin-Zhong Wu. Studies on submerged fermentation ofPleurotus tuber-regium (Fr.) Singer - Part 1: physical and chemical factors affecting the rate of mycelial growth and bioconversion efficiency./ Jin-Zhong Wu, Peter C.K. Cheung, Ka-Hing Wong, Nian-Lai Huang// Food chemistry. - 2003. - V.81. - pp.389-393], Panus [RU 2186851, C12P 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R 1:645, опубл. 10.08.2002], Pholiota [El-Makhzangy A. Propagation of three mushrooms genera in submerged culture of mango stone infusion./ A. El-Makhzangy// Alexandria journal of food science & technology. - 2004. - V.1. - No.2. - pp.23-29], Fusarium [US 4501765, A23J 3/00, опубл. 26.02.1985; US 4466988, A23J 1/18, опубл. 21.08.1984; Weibe, 2004. Myco-protein from Fusarium venenatum: a well-established product for human consumption.// Appi Microbiol Biotechnol, vol. 58, pp.421-427], Neurospora [US 4938972, A23L 1/00; опубл. 03.07.1990; Murray Moo-Young, Yusuf Chisti, Dagmar Vlach (1993). Fermentation of cellulosic materials to mycoprotein foods.// Biotech Adv., Vol.11, pp.469-479], штаммы порядка Мукоровых: семейства Chonaephoraceae (Blakeslea trispora, Gilbertella persicaria), Cunninghamellaceae (Absidia pseudocylindrospora), Mortierelaceae (Mortierella alpina) и Mucoraceae (Rhizopus stolonifer, Rhizopus miehei, Rhizopus pusillus, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae; Mucor heimalis, Mucor rouxii; Rhizomucor meihei), а также Phycomyces blakesleeanus [US 7045160 B1, A23J 1/18, A23J 3/20, опубл. 16.05.2006] и др.

Известны штаммы-продуценты белковой биомассы Pleurotus ostreatus ВКПМ F-697 [RU 2092548, C12N 1/14, C12P 21/00, C12N 1/14, C12R 1:645, опубл. 10.10.1997] и Pleurotus ostreatus ВКПМ F-720 [RU 2126831, C12N 1/14, С12Р 21/00, C12N 1/14, C12R 1:645, опубл. 27.02.1999], культивируемые в глубинных условиях на различных жидких средах (среда с пептоном, мелассой, соево-крахмальная, кукурузно-крахмальная, картофельно-глюкозная и минеральная среда с глюкозой). Массовая доля сырого протеина в биомассе предложенных штаммов составляет от 40 до 50% АСМ. Недостатком данных штаммов является сравнительно невысокая продуктивность по биомассе - от 0,21 до 0,37 г·л·ч^-1, а также дефицитность биомассы по таким незаменимым аминокислотам, как цистин и валин. Наличие широкого спектра нетрадиционных ароматов биомассы также может являться недостатком, поскольку возникает необходимость варьирования состава питательной среды в зависимости от дальнейшего применения биомассы.

Известны штаммы-продуценты белковой биомассы Pleurotus ostreatus 2-204 ВКПМ F-811 [RU 2189395, С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R1:645, опубл. 20.09.2002] и Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 [RU 2186851, С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R 1:645, опубл. 10.08.2002], культивируемые в глубинных условиях на различных жидких питательных средах. Недостатками данных штаммов являются достаточно невысокое содержание сырого протеина в биомассе (от 28 до 40% АСМ), а также сравнительно бедный жирнокислотный состав (относительное содержание ненасыщенных жирных кислот в биомассе составляет: олеиновой (C_18:1) - 19,5 и 23,2%; линолевой (C_18:2) - 7,1 и 13,6% соответственно; линоленовой (С_18:3) - 1,3%).

Известно использование в качестве продуцентов белковой биомассы штаммов рода Penicillium: Penicillium nonatum и Penicillium chrysogenum [US 3912825, A23J 1/00, опубл. 14.10.1975]. Глубинное культивирование штаммов осуществляют на различном сырье растительного происхождения, например фуражная пшеница, гидролизаты картофеля, мелассы, багассы и/или цитрусовых отходов. Недостатком предложенных штаммов является сравнительно невысокое содержание в биомассе сырого протеина - от 42 до 46% АСМ (общий азот по Къельдалю - от 6,81 до 7,38%, коэффициент пересчета - 6,25).

Известно использование в качестве продуцентов белковой биомассы штаммов рода Fusarium: Fusarium solani, Fusarium oxysporum и Fusarium graminearum [US 4466988, A23J 1/18, опубл. 21.08.1984]. Наиболее близким к предложенному штамму является штамм Fusarium graminearum Schwabe ATCC 20334 [US 4347, А01Н 15/00, опубл. 12.12.1978], в настоящее время идентифицированный как Fusarium venenatum ATCC PTA-2684 [Wendy T. Yoder and Lynne M. Christianson, 1998. Species-Specific Primers Resolve Members of Fusarium section Fusarium. Taxonomic Status of the edible «Quom» Fungus Reevaluated.// Fungus genetics and biology, Vol.23, pp.68-80], культивируемый в глубинных условиях на различных углеродных субстратах (глюкоза, мальтоза, тростниковая меласса, крахмалсодержащие субстраты и их гидролизаты). Максимальная скорость роста штамма-продуцента в глубинной культуре составляет 0,28 ч^-1 [Anthony P.J. Trinci, 1992. Myco-protein: A twenty-year overnight success story.// Mycol. Res. - 1992. - Volume 96(1). - pp.1-13]. Массовая доля сырого протеина в биомассе составляет от 45 до 54% (общий азот по Къельдалю - от 7,2 до 8,6%, коэффициент пересчета - 6,25). Недостатком данного штамма является относительно высокое содержание в липидной фракции биомассы пальмитиновой кислоты (13 г/кг АСМ) [Mycoprotein GRAS Notification, 2001], что ограничивает количество потребляемого продукта в рационе, поскольку пальмитиновая кислота способствует повышению в крови холестерина низкой плотности и впоследствии вызывает такие заболевания как тромбоз сосудов, атеросклероз, заболевания сердечно-сосудистой системы [Nicolosi R.J. Effects of specific fatty acids (8:0, 14:0, cis-18:1, trans-18:1) on plasma lipoproteins, early atherogenic potential, and LDL oxidative properties in the hamster. /Nicolosi R.J., Wilson T.A., Rogers E.J., Kritcheysky D// The journal of lipid research. - 1998. - Volume 39(10). - pp.1972-1980]. Относительное содержание ценных ненасыщенных жирных кислот в биомассе сравнительно невысокое и составляет: олеиновая (C_18:1) - 14%; линолевая (C_18:2) - 43%; линоленовая (C_18:3) - 9%, а общее количество ненасыщенных жирных кислот составляет 78% к общей сумме жирных кислот. Другим недостатком предложенного штамма является повышенное содержание РНК в биомассе (от 7 до 12% АСМ), что существенно снижает допустимое для потребления человеком количество биомассы (не более 2 г в сутки) и требует проведения стадии ее денуклеинизации.

Таким образом, в настоящее время не известен штамм-продуцент пищевой белковой биомассы, способный с высокой скоростью роста накапливать высокобелковую биомассу с повышенным количеством ценных ненасыщенных жирных кислот и относительно низким содержанием нуклеиновых кислот.

Раскрытие изобретения

Новый штамм Fusarium sambucinum D-104 характеризуется высокой максимальной удельной скоростью роста в условиях жидкофазного глубинного культивирования (от 0,28 до 0,32 ч^-1), значительным содержанием белковых веществ в биомассе (от 50 до 63% АСМ) и повышенным количеством ценных ненасыщенных жирных кислот (от 83 до 87% от суммы жирных кислот). Штамм обеспечивает невысокое содержание нуклеиновых кислот в биомассе (от 4 до 5% АСМ).

Штамм Fusarium sambucinum Fuck. var. ossicolum (Berk. et Curt.) D-104, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161, выделен по признаку продуктивности в процессе глубинного культивирования на крахмалосодержащих средах штамма D-002, полученного в 1981 году как штамм ВСБ-917, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-169 как Polyporus squamosus и идентифицированный впоследствии как Fusarium sambucinum Fuck. var. ossicolum (Berk. et Curt.) Bilai. Таким образом, штамм F. sambucinum D-104 (ВКПМ F-1161) является близкородственным непатогенному нетоксинообразующему штамму Fusarhim sambucinum ВСБ-917 (ВКПМ F-169), что подтверждено данными ПЦР-фингерпринта.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма. На агаризованном пивном сусле (7°Бал) колонии в начале роста серовато-белого цвета с хорошо развитым хлопьевидно-войлочным воздушным мицелием. Со временем на свету приобретают розоватый оттенок. Край колонии менее плотный, слегка прижатый. Размер колоний на агаризованном сусле при температуре 28°С через 4 суток составляет 68-70 мм. Воздушный мицелий хорошо развит, серовато-белого цвета, затем розовеющий. При старении приобретает светлую розовато-коричневую окраску, затем охряные оттенки до светло коричневых. Спородохии и пионотты не образует. Субстратный мицелий не окрашен. Реверзум неизмененный. Пигментов в среду не выделяет, экссудата не образует.

Штамм растет на глюкозопептонном агаре, глюкозоаммонийном агаре, мясопептонном агаре, среде Сабуро. На мясопептонном агаре мицелий субстратный, воздушный мицелий слабый, прижатый, край колонии прижатый. На диагностических средах (рис, ломтики картофеля) пурпурные, лиловые, малиновые оттенки отсутствуют. На рисе образует мицелий лососевого цвета, который при старении приобретает охряные оттенки до темно-коричневых, рис окрашивает в коричневые тона. На ломтиках картофеля образует розоватый, при старении оливково-охряный до темно-коричневого мицелий.

На агаризованном сусле гифы воздушного мицелия гиалиновые, диаметром 2,5-5,0 мкм. В растущей зоне колонии гифы в ранней возрастной фазе, ровные, длинные, с гомогенной или мелкозернистой цитоплазмой, с незначительным количеством вакуолей, с отчетливо видными клеточными перегородками. Ветвление под острым углом. Кончики гиф закруглены. В стареющей части колонии гифы в поздней возрастной фазе, инкрустированы каплями масла, затем с дифференциацией цитоплазмы в виде крупных структур (вакуоли, липидные включения). В поздних фазах гифы разного диаметра, различающегося в 2-4 и более раза (от 2,5-3,5 мкм до 12 мкм). Встречаются вздутия на гифах и хламидоспоры. Хламидоспоры апикальные и интеркалярные в клубочках, узлах и цепочках, охряно-коричневые, округлой формы, гладкие, 8-12 мкм.

Конидиальное спороношение в виде макроконидий и микроконидий на воздушном мицелии, иногда в глубинной культуре. Макроконидии гиалиновые веретеновидные и серповидные (слегка изогнутые), чаще с 3-5 перегородками, без перетяжек. Размеры 30-50×5 мкм. Серповидные споры с выраженной ножкой, верхняя клетка постепенно равномерно сужена, слегка согнута, удлинена. Микроконидии одноклеточные или с 1-3 перегородками, удлиненные или веретеновидные. Склероции не образует.

В условиях глубинного культивирования на питательной среде с мелассой гифы в экспоненциальной фазе роста молодые, длинные, с гомогенной цитоплазмой и отчетливо видными клеточными перегородками. При невысокой скорости перемешивания мицелий представлен свободными гифами и агломератами гиф. Окончания гиф закругленные, копьеобразные или вздутые. Затем появляется дифференциация цитоплазмы (липидные включения, вакуоли), которая с возрастом культуры усиливается. Появляются крупные вакуоли. В стареющей культуре гифы извитые, неровные, дифференциация клеточного содержимого сильно выражена, появляются утолщения гиф и признаки накопления метаболитов в культуральной среде, метаболитные бляшки на гифах, инкрустация метаболитами. При длительном хранении происходит образование хламидоспор в цепочках. Окончания гиф истончены. В поле зрения присутствуют пустые клетки.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Активно растет в диапазоне температур от 22 до 34°С, в интервале рН 3,5-7,0. Оптимальная температура выращивания (27±1)°С. Утилизирует глюкозу, фруктозу, сахарозу, ксилозу, лактозу, галактозу, мальтозу, раффинозу, а также маннит, ксилит, этанол, глицерин. Крахмал гидролизует. Для азотного питания использует пептон, мочевину, соли аммония, нитраты. Для роста не нуждается в аминокислотах. Обладает высокой скоростью роста в глубинной культуре на средах с продуктами переработки различных видов зерна (пшеница, рожь, тритикале), картофеля, сахарной свеклы и тростника, соками корнеплодов и зеленой части топинамбура, турнепса, столовой свеклы и других видов, а также их гидролизатами.

Применимость данного штамма поясняется примерами.

Пример 1

Культуру штамма Fusarium sambucinwn D-104 хранили на скошенном агаризованном сусле в пробирках при температуре +4°С с периодическими пересевами через каждые 6 месяцев. Выращивание посевного материала проводили в асептических условиях при температуре от 26 до 28°С в качалочных колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава: сахароза - 30,0 г/л, кукурузный экстракт - 10,0 г/л, NH₄NO₃ - 3,0 г/л, KH₂PO₄ - 1,0 г/л, MgSO₄·H₂O - 0,1 г/л, ZnSO₄·H₂O - 0,01 г/л, вода водопроводная - остальное, рН 5,8, путем пересева культуры с твердой питательной среды (косяк) из расчета 1 косяк на 1 качалочную колбу - первый пассаж. Продолжительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 96 ч, второй - 48 ч, третий и последующие - 24 ч.

Глубинное культивирование осуществляли в периодическом режиме в ферментационном аппарате 30 л с рабочим объемом 20 л при температуре от 26 до 28°С, начальном значении рН 5,8, избыточном давлении 0,4 атм, аэрации воздухом в стерильных условиях 1,0 л/л/мин с механическим перемешиванием 400 об/мин мешалкой турбинного типа на питательной среде вышеуказанного состава. Среду инокулировали мицелиальной взвесью (второй и последующие у пассажи) в количестве 10% по объему.

Скорость роста культуры штамма-продуцента составила 0,28 ч^-1.

Химический состав биомассы, % к АСМ:

Общий белок - 56,5;

Липиды - 7,8;

Нуклеиновые кислоты - 4,1.

Содержание ненасыщенных жирных кислот составило 83,5% от суммы ЖК.

Пример 2

Выращивание посевного материала проводили в асептических условиях при температуре от 26 до 28°С в качалочных колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава: меласса свекловичная - 40,0 г/л (2% по РВ), аммоний азотнокислый - 3,0 г/л, фосфат калия однозамещенный - 1,2 г/л, вода водопроводная - остальное, рН 5,8, путем пересева культуры с твердой питательной среды (косяк) из расчета 1 косяк на 1 качалочную колбу - первый пассаж. Продолжительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 96 ч, второй - 48 ч, третий и последующие - 24 ч.

Глубинное культивирование осуществляли в периодическом режиме в ферментационном аппарате 30 л с рабочим объемом 20 л при температуре от 26 до 28°С, при начальном значении рН 5,8 (избыточном давлении 0,4 атм, аэрации воздухом в стерильных условиях 1,0 л/л/мин с механическим перемешиванием 400 об/мин мешалкой турбинного типа) на питательной среде следующего состава: меласса свекловичная - 40,0 г/л (2% по РВ); NH₄NO₃ - 3,0 г/л, KH₂PO₄ - 1,2 г/л, пропинол Б-400 - 0,4 г/л. Среду инокулировали мицелиальной взвесью (второй и последующие пассажи) в количестве 10% по объему.

Скорость роста культуры штамма-продуцента составила 0,28 ч^-1.

Химический состав биомассы, % к АСМ:

Общий белок - 60,5;

Липиды - 6,9;

Нуклеиновые кислоты - 4,5.

Содержание ненасыщенных жирных кислот составило 84,7% от суммы ЖК.

Пример 3

Выращивание посевного материала проводили в асептических условиях при температуре от 26 до 28°С в качалочных колбах объемом 250 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава: крахмал пшеничный - 30 г/л, NH₄NO₃ - 4,5 г/л, KH₂PO₄ - 1,8 г/л, кукурузный экстракт сгущенный - 10 г/л, вода водопроводная - остальное, рН 5,8, путем пересева культуры с твердой питательной среды (косяк) из расчета 1 косяк на 1 качалочную колбу - первый пассаж. Продолжительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 96 ч, второй - 48 ч, третий и последующие - 24 ч.

Глубинное культивирование осуществляли в периодическом режиме в ферментационном аппарате 30 л с рабочим объемом 20 л при температуре от 26 до 28°С, в режиме рН-статирования при значении 4,0 (избыточном давлении 0,4 атм, аэрации воздухом в стерильных условиях 1,0 л/л/мин с механическим перемешиванием 400 об/мин мешалкой турбинного типа) на питательной среде следующего состава: крахмал пшеничный - 30,0 г/л; нитрат аммония - 4,5 г/л; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,8 г/л; кукурузный экстракт сгущенный - 10,0 г/л, пропинол Б-400 - 0,4 г/л. Крахмал подвергали предварительному гидролизу ферментным препаратом амилосубтилин в расчете 0,024% к объему питательной среды (4,8 г/л). Среду инокулировали мицелиальной взвесью (второй и последующие пассажи) в количестве 10% по объему.

Скорость роста культуры штамма-продуцента составила 0,32 ч^-1.

Химический состав биомассы, % к АСМ:

Общий белок - 63,0;

Липиды - 6,2;

Нуклеиновые кислоты - 5,0.

Содержание ненасыщенных жирных кислот составило 87,0% от суммы ЖК.

Аминокислотный состав биомассы штамма-продуцента близок к идеальному белку ФАО/ВОЗ (Таблица 1). Наблюдается небольшое лимитирование по серосодержащим аминокислотам (метионин, цистин), при этом биомасса штамма обогащена лизином, что позволяет сочетать ее с дефицитными по этой аминокислоте зерновыми компонентами с получением сбалансированного по аминокислотному составу продукта.

Таблица 1 Незаменимые аминокислоты Содержание аминокислоты в идеальном белке ФАО/ВОЗ, в % от суммы аминокислот Содержание аминокислоты в биомассе штамма F.sambucinum, в % от суммы аминокислот Лейцин 7,0 7,0 Изолейцин 4,0 4,0 Лизин 5,5 8,0 Метионин+цистин 3,5 3,0 Фенилаланин+тирозин 6,0 8,0 Триптофан 1,0 1,0 Треонин 4,0 6,0

Валин 5,0 6,0

Липидная фракция мицелия штамма Fusarium sambucinum D-104 содержит значительное количество фосфолипидов (до 33% от суммы липидов), что свидетельствует о ее пищевой полноценности. Общее количество полиненасыщенных жирных кислот составляет от 83 до 87% от общей суммы жирных кислот в биомассе, что превышает данный показатель у штамма-аналога (содержание полиненасыщенных жирных кислот у штамма Fusarium graminearum Schwabe ATCC 20334 составляет 78% к общей сумме жирных кислот). Состав ненасыщенных жирных кислот приближает липидный комплекс биомассы к наиболее ценным растительным маслам, в частности к соевому маслу и маслу зародышей пшеницы (Таблица 2).

Таблица 2   Липидная фракция соевого масла, % от суммы ЖК Липидная фракция масла зародышей пшеницы, % от суммы ЖК Липидная фракция биомассы штамма F.Sambucinum, % от суммы ЖК Пальмитолеиновая - - 0,8-1,1 Олеиновая 24,0 21,0 21,0-23,0 Линолевая 52,0 52,0 51,0-52,0 Линоленовая 9,0 10,0 8,0-9,0 Арахидоновая - - 1,5-1,7 Изоарахидоновая - - 0,8-1,0

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Fusarium sambucinum, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161. Данный штамм является продуцентом белковой пищевой биомассы. Изобретение позволяет с высокой скоростью роста в условиях жидкофазного глубинного культивирования накапливать высокобелковую биомассу с повышенным количеством ценных ненасыщенных жирных кислот, полноценных по составу. 2 табл., 3 пр.

Штамм Fusarium sambucinum ВКПМ F-1161 продуцент белковой пищевой биомассы.