СПОСОБ И СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОДУКЦИИ ИЛИ УСИЛЕНИЯ ЭЛИМИНАЦИИ БЕЛКА Р24 Российский патент 2014 года по МПК A61K39/395 A61P31/14 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для ингибирования продукции или усиления элиминации белка Р24.

Из уровня техники известен белок P24, обнаруженный в организме человека (Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM. Is a positive western blot proof of HIV infection? Biotechnology (N Y). 1993 Jun; 11(6):696-707).

Известно также предложение по использованию анти-СD4 молекул, конъюгированных с антихемокиновыми рецепторами, для лечения ВИЧ-1 (WO 01/43779 А2, A61K 47/48, 2001). Однако экспериментальные данные о терапевтической эффективности такого препарата в указанном источнике отсутствуют.

Изобретение направлено на создание препарата для ингибирования продукции или усиления элиминации белка P24 на основе антител к CD4.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе ингибирования продукции или усиления элиминации белка Р24 согласно изобретению используют активированную потенцированную форму антител к CD4 рецептору (к антигену - CD4).

При этом активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

Активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору могут получать путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного - исходного - раствора антител к CD4 рецептору с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

Кроме того, решение поставленной задачи обеспечивается тем, что средство для ингибирования продукции или усиления элиминации белка Р24 согласно изобретению содержит активированную потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

При этом активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору используют в виде активированного потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

Причем активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору могут получать путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного - исходного - раствора антител к CD4 рецептору с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

Экспериментально показано, что использование активированной-потенцированной формы антител к CD4 рецептору обеспечивает эффективное ингибирование продукции или усиление элиминации белка Р24.

Заявленное средство приготовляют, преимущественно, следующим образом.

Для приготовления активированной-потенцированной формы заявленного средства используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы./ Под ред. Г.Фримеля. М.: «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридомных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом - антигеном или конъюгированным антигеном: CD4 рецептором. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной-потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Предпочтительным для приготовления заявленного средства является использование поликлональных антител к CD4, которые в качестве матричного (исходного) раствора с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл используют для последующего приготовления активированной-потенцированной формы.

Предпочтительной для приготовления каждого компонента является использование смеси трех водно-спиртовых разведении первичного матричного раствора антител, разведенных соответственно в 100¹², 100³⁰ и 100⁵⁰ раз, что эквивалентно сотенным разведениям С12, С30 и С50, приготовленных по гомеопатической технологии.

Предпочтительным для приготовления заявленного средства является использование поликлональных антител к CD4 рецептору, которые могут быть получены иммунизацией кроликов следующим образом.

Поликлональные антитела к CD4 рецептору получают, используя в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и цельную молекулу или один полипептидный фрагмент CD4 рецептора, выбранный, например, из следующих аминокислотных последовательностей:

412-458:

IGLGIFFCV RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI

26-60:

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGD

105-119:

A DSRRSLWDQG NFPL

115-139:

G NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQ

26-458:

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA LEAKTGKLHQ EVNLWMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPTW STPVQPMALI VLGGVAGLLL FIGLGIFFCV RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенные инъекции для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Можно добавлять к антисыворотке 20% NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранить до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°). Выделение из антисыворотки антител к CD4 рецептору возможно следующим образом:

1) 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С;

2) выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3) после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4) фракцию антител определяют измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Очистку антител производят методом аффинной хроматографии на колонке с антигеном путем связывания антител к CD4 рецептору с антигеном (CD4 рецептором), прикрепленным к нерастворимому матриксу колонки, с последующим элюированием антител концентрированными растворами соли.

Полученный таким образом буферный раствор поликлональных антител к CD4 рецептору с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (исходного) раствора для последующего приготовления активированной-потенцированной формы антител.

Активированную-потенцированную форму готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения D), или в 99 частях (для сотенного разведения С), или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием (потенцированием, или "динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В.Швабе. "Гомеопатические лекарственные средства". М., 1967 г., с.14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов с концентрацией 2,5 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-е сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-й части исходного матричного раствора антител к CD4 рецептору с концентрацией 2,5 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный разведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведении С30 и С50.

При использовании в качестве активированной-потенцированной формы антител к CD4 рецептору смеси различных, преимущественно сотенных, разведений каждое разведение состава смеси (например, С12, С30, С50) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до разведения на 3 разведения меньше, чем конечное (соответственно, до получения С9, С27, С47), и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). Далее полученную смесь последовательно дважды разводят в соотношении 1 к 100, потенцируя полученный раствор после каждого разведения. При этом получают активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору в сверхмалой дозе, полученной разведением матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных разведении С12, С30, С50.

Возможно использование каждого компонента в виде смеси других различных, разведений, например, десятичных и/или сотенных (D20, С30, С100 или С12, С30, С200 и т.д.), приготовленных по гомеопатической технологии, эффективность которых определяют экспериментально.

Пример

Для проведения экспериментальных исследований были использованы антитела, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой.

Эффективность ингибирования продукции или усиления элиминации белка P24 определяли в мононуклеарных клетках периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI.

Мононуклеары периферической крови человека были выделены из крови здоровых серонегативных доноров при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Клетки активировали в течение 3 дней с использованием 1 мкг/мл фитогеммаглютина Р и 5 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека.

Для оценки эффективности ингибирования продукции или усиления элиминации белка P24 заявленное средство: активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору в сверхмалой дозе, полученной разведением матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных разведении С12, С30, С50 (далее СМД AT к CD4), вносили в лунку, содержащую 100 мкл активированных мононуклеаров периферической крови человека, за 24 часа или через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI в дозе 100 TCID50 (50 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-LAI). Перед внесением в лунку СМД AT к CD4 (12,5 мкл) смешивали со средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 50 мкл.

Супернатанты культуры клеток были собраны на 7 день после заражения. Эффективность ингибирования продукции или усиления элиминации белка P24 определяли методом ИФА (Retrotek Elisa kit).

Определено, что СМД AT к CD4 снижает содержание белка P24 в супернатанте на 86±10% при внесении в лунку за 24 часа до и на 51±3% при внесении в лунку через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI соответственно.

Примечание: TCID50 - доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии и вирусологии, и касается ингибирования продукции или усиления элиминации белка Р24. Для этого используют активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору. Введение этого средства в опытах «ин витро» обеспечивает значительное снижение содержания белка Р24 после заражения клеток штаммом ВИЧ-ILAI. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ ингибирования продукции или усиления элиминации белка Р24, характеризующийся тем, что используют активированную-потенцированную форму антител к CD4.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что активированную-потенцированную форму антител к CD4 используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

3. Способ по п.1 или 2, характеризующийся тем, что активированную-потенцированную форму антител к CD4 получают путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного - исходного - раствора антител к CD4 рецептору с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

4. Средство для ингибирования продукции или усиления элиминации белка Р24, характеризующееся тем, что содержит активированную-потенцированную форму антител к CD4.

5. Средство по п.4, характеризующееся тем, что активированную-потенцированную форму антител к CD4 используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

6. Средство по п.4 или 5, характеризующееся тем, что активированную-потенцированную форму антител к CD4 получают путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного - исходного - раствора антител к CD4 рецептору с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.