ГЛИКОПЕПТИД ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ГЛИЦИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНОМ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АНТИ-ВИЧ-1 АКТИВНОСТЬ Российский патент 2008 года по МПК C07K9/00 C07J63/00 A61K38/14 A61P31/18 

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к гликопептиду глицирризиновой кислоты (ГК) с глицил-L-фенилаланином: 3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин)]}-(3β,20β)-11-оксо-олеан-12-ен-30-овой кислоте формулы (Iб), проявляющему анти-ВИЧ-1 активность.

(1a)R=Gly-L-Phe-OBzl

(1б)R=Gly-L-Phe-OH

Bzl=C₆H₅CH₂

Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

В настоящее время во всем мире интенсивно ведутся исследования по поиску средств для борьбы с ВИЧ-инфекцией. Выявлены ряд соединений нуклеозидной структуры, ингибирующих репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ): рибавирин, азидотимидин (зидовудин), 2,3-дидезоксинуклеозиды и др. [E.De Clerq. New selective antiviral agents active against the AIDS virus. // Trends Pharmacol. Sci, 1987, v.8, N 9, p.339-345; E.De Clerq. Toward improved anti-HIV chemotherapy: therapeutic strategies for interferon with HIV infections. // J.Med.Chem., 1995, v.38, N 14, p.2491-2517].

Основной проблемой при монотерапии аналогами нуклеозидов является развитие резистетности к этим препаратам. Лечение ВИЧ-инфекции азидотимидином (АЗТ) приводит к появлению мутантных форм вируса [E.De Clerq. Toward improved anti-HIV chemotherapy: therapeutic strategies for interferon with HIV infections. // J.Med.Chem., 1995, v.38, N 14, p.2491-2517]. Новым подходом является комбинированная терапия с помощью противовирусных средств нового поколения, с новым механизмом действия, среди которых особого внимания заслуживают природные соединения, получаемые из доступного растительного сырья, и их модифицированные аналоги.

В 1987-88 гг. группой японских ученых была обнаружена способность глицирризиновой кислоты (ГК) - основного биоактивного компонента экстракта корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и уральской (Gl. uralensis) ингибировать ВИЧ in vitro и in vivo [M. Ito, H.Nakashima, M.Baba, R.Pauwels, E. De Clerq, Sh. Shigeta, and N.Yamamoto. Inhibitory effect of glycyrrhizin on the in vitro infectivity and cytopathic activity of the human immunodeficiency virus [HIV (HTLV-III/LAV]. // Antiviral Res., 1987, v.7, p.127-137; M.Ito, A.Sato, K.Hirabayashi, F.Tanabe, Sh.Shigeta, M.Baba, E.De Clerq, H.Nakashima, and N.Yamamoto. Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV). // Antiviral Res., 1988, v.10, p.289-298]. ГК была успешно использована в условиях клиники для лечения больных СПИДом [A.J.Vlietinck, T.De Bruyne, S.Apers and L.A.Pieters. Plant-Derived Leading Compounds for Chemotherapy of Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection. // Planta Medica, 1998, v.64, p.97-109; Г.А.Толстиков, Л.А.Балтина, Э.Э.Шульц, А.Г.Покровский. Глицирризиновая кислота. // Биоорган, химия, 1997, т.23, №9, с.691-709].

Основным недостатком ГК является его малая эффективность как ингибитора обратной транскриптазы ВИЧ [О.А.Плясунова. Скрининг и изучение препаратов-ингибиторов вируса иммунодефицита человека. Дисс. канд. биол. наук в форме научного доклада. Кольцове, 1992. 55 с.] и высокие дозы препарата, которые вызывают подавление репродукции ВИЧ [О.А.Плясунова, И.Н.Егоричева, Н.В.Федюк, А.Г.Покровский, Л.А.Балтина, Ю.И.Муринов, Г.А.Толстиков. Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты. // Вопросы вирусол., 1992, №5-6, с.235-238].

Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение, заключается в поиске новых соединений в ряду производных ГК, обладающих анти-ВИЧ активностью.

В завленном техническом решении синтезировано новое соединение - гликопептид ГК с глицил-L-фенилаланином: 3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин)]}-(3β,20β)-11-оксо-олеан-12-ен-30-овая кислота формулы (Iб), проявляющий анти-ВИЧ активность.

Синтез гликопептида (Iб) проводили методом активированных эфиров с помощью N-гидроксибензотриазола (HOBt) - N,N′-дициклогексилкарбодиимида (DCC) путем конденсации ГК с бензиловым эфиром глицил-L-фенилаланина (Gly-L-Phe-OBzl) в виде гидрохлорида (аминокомпонент) (АК) в присутствии триэтиламина (Et₃N) при мольном соотношении ГК/HOBt/DCC/AK, равном 1:3:2,5:3 ммоль. Полученный бензиловый эфир коньюгата ГК (Ia) переосаждали из метанола эфиром и без дальнейшей очистки деблокировали гидрогенолизом в 75% СН₃СООН в присутствии 10% Pd/C, затем хроматографировали на колонке с силикагелем. Выход целевого гликопептида (Iб) составил 44%.

Об образовании CONH-связи между NH₂-группой АК и СООН-группами диглюкуронидной цепи ГК судили по дополнительным сигналам в области слабого поля (172,6 и 174,6 м.д.), соответствующим С=O группам и сигналам α-СН аминокислот в области 55 м.д.

Биологические свойства данного соединения были изучены в лаборатории ретровирусов Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектора".

Противовирусную активность препарата изучали на традиционной модели первично инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4. В работе использовали штамм ВИЧ-1/ЭВК. В качестве препаратов сравнения использовали ГК в концентрации 100 мкг/мл и один из известных противовирусных препаратов - ингибиторов репликации ВИЧ-1 - азидотимидин (АЗТ) (зидовудин) [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Пособие для врачей. Изд. 14-е. Т.2. Москва: "Новая Волна", 2000. С.330], облегчающий течение заболевания СПИДом, в концентрации 0,05 мкг/мл. Механизм действия АЗТ связан с подавлением фермента - обратной транскриптазы (ревертазы) ВИЧ-1, обеспечивающей считывание вирусной ДНК в пораженной клетке с РНК, содержащейся в вирионе (транспортной форме вируса). Однако со временем ВИЧ-1 становится устойчивым к действию ингибиторов обратной транскриптазы, поэтому в последнее время АЗТ и его аналоги стали применять в сочетании с противовирусными, эффективными при ВИЧ-инфекции препаратами другого механизма действия - ингибиторами протеаз. Кроме того, АЗТ является более токсичным препаратом, чем ГК [О.А.Плясунова, И.Н.Егоричева, Н.В.Федюк, А.Г.Покровский, Л.А.Балтина, Ю.И.Муринов, Г.А.Толстиков. Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты. // Вопросы вирусол., 1992, №5-6, с.235-238].

Цитотоксичность исследуемого соединения оценивали на культуре перевиваемых Т-лимфоцитов человека (линия МТ-4). Препарат растворяли в ДМСО и в соответствующих разведениях вносили в лунки 96-луночных планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток.

По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. Строили дозозависимую кривую и определяли концентрацию препарата, вызывающего гибель 50% клеток - CD₅₀ (токсическая доза).

Для оценки анти-ВИЧ-1 активности соединения клетки МТ-4 (концентрация 2×10⁶ клеток/мл) инфицировали штаммом ВИЧ-1/ЭВК с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. После адсорбции вируса в течение 1 часа при 37°С инфицированные и контрольные клетки (без вируса) разводили ростовой культуральной средой до посевной концентрации 5×10⁵ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночных культуральных планшетов. Затем в соответствующие лунки вносили растворы исследуемого соединения (по три лунки на каждое разведение). Конечная концентрация исследуемых препаратов в клеточной суспензии составляла от 0,1 до 100 мкг/мл.

Ингибирующий эффект соединения оценивали на 4-е сутки культивирования измерением количества вирусного антигена - вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом. Кроме того, определяли долю жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим путем подсчета в камере Горяева. На основе полученных экспериментальных данных строили дозозависимые кривые и определяли количественные характеристики ингибирования: ID₅₀ - концентрацию соединения, на 50% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 50% защиту клеток от гибели вследствие инфекции; ID₉₀ - концентрацию соединения, на 90% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 90% защиту клеток от гибели вследствие инфекции; IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы CD₅₀ к его эффективной дозе ID₅₀. Результаты проведенных исследований приведены в таблицах 1-3.

Установлено, что для гликопептида (Iб) 50%-я цитотоксическая доза (CD₅₀) (вызывающая 50% гибель клеток) составила 250 мкг/мл (табл.1). В диапазоне концентраций до 10 мкг/мл данное соединение не является токсичным для клеток (табл.1). Кроме того, гликопептид (Iб) является почти в 70 раз менее токсичным веществом, чем АЗТ (CD₅₀=3,5 мкМ) [О.А.Плясунова, И.Н.Егоричева, Н.В.Федюк, А.Г.Покровский, Л.А.Балтина, Ю.И.Муринов, Г.А.Толстиков. Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты. // Вопросы вирусол., 1992, №5-6, с.235-238] и проявляет выраженную анти-ВИЧ-1 активность, с высокой эффективностью ингибируя накопление вирусспецифического белка р24. Количественные характеристики ингибирования р24 соединением (Iб) приведены в табл.2. 50% ингибирующая доза (ID₅₀) соединения (Iб) составила 0,73 мкг/мл, что в 170 раз ниже, чем у ГК - референс-вещества, IS соединения (1б) составил 342,5, что в ˜30 раз выше, чем у ГК. 90%-ное подавление репродукции вируса наблюдается при концентрации гликопептида (Iб) 0,80 мкг/мл (ID₉₀=0,80 мгк/мл), что почти в 1190 раз ниже, чем для ГК (табл.2). В концентрации 10 мкг/мл анти-ВИЧ-1 активность (ингибирование р24) препарата (Iб) аналогична активности АЗТ в дозе 0,05 мкг/мл (табл.3).

Таблица 1Цитотоксичность препарата в клетках МТ-4Шифр препаратаКонцентрация препарата, мкг/млДоля жизнеспособных клеток, %CD₅₀, мкг/млIб2000н/с  1000н/с  50019,05±1,19250 10068,42±2,13  1096,00±2,85  1н/с МТ-4-97,83±0,96-н/с - не считали

Таблица 2Анти-ВИЧ-1 активность препарата в культуре клеток МТ-4Шифр препаратаCD₅₀, мкг/млID₅₀, мкг/млID₉₀, мкг/млISIб2500,730,80342,5ГК195012595010,32

Таблица 3Анти-ВИЧ-1 активность соединения в культуре клеток МТ-4ПрепаратКонцентрация препарата, мкг/млДоля жизнеспособных клеток, %р24Накопление, нг/млИнгибирование, %Iб1017,65±3,74195,93±8,5195,10±2,13125,04±2,311845,73±251,3453,84±4,070,125,52±2,852461,90±189,4538,43±2,950,0126,13±4,202994,51±207,5225,11±2,83 0,00125,73±2,653640,67±256,148,95±2,95АЗТ0,0597,50±1,34102,76±3,8797,43±1,44МТ-4-96,43±1,12--МТ-4 (ВИЧ-1)-25,93±2,863998,54±101,32-МТ-4 (ВИЧ-1) начальная 95,08±0,87226,58±23,49 ГК-82,52±4,24270,09±14,5878,86±7,09

Таким образом, впервые выявлена высокая анти-ВИЧ-1 активность гликопептида (Iб) в культуре клеток. Предлагаемое соединение с высокой эффективностью ингибирует накопление вирусспецифического белка р24 ВИЧ-1 и обладает в 30 раз более высоким индексом селективности по сравнению с ГК (IS=342,5). Гликопептид (Iб) проявляет 50% ингибирующее действие (ID₅₀=0,73) в 170 раз меньшей дозе, чем ГК. Кроме того, соединение (Iб) является менее токсичным веществом, чем АЗТ (известный анти-ВИЧ препарат), его цитотоксическая доза CD₅₀ составляет 250 мкг/мл. По ингибированию вирусспецифического белка р24 ВИЧ-1 препарат (Iб) в концентрации 10 мкг/мл не уступает активности АЗТ в концентрации 0,05 мкг/мл.

Сущность технического решения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез 3-O-{2-O-[N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин]-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин}-(3β,20β)-11-окео-18β-олеан-12-ен-30-овая кислота (Iб)

1. Гидрохлорид бензилового эфира глицил-L-фенилаланина

К суспензии 5 г дипептида Gly-L-Phe-OH (Reanal) в 100 мл сухого бензилового спирта прибавляли 15 мл свежеперегнанного SOCl₂ и нагревали при 100°С 3 ч. После охлаждения смеси до комнатной температуры прибавляли 200 мл эфира и оставляли в холодильнике до образования осадка. Осадок отфильтровали, высушили и переосадили из метанола эфиром.

Выход 66%. ИК-спектр, ν, см^-1: 1730 (COOR); 1640, 1590 (NH₃ ⁺); 1540 (CONH); 1520 (Ph). Найдено, %: N 7,92. C₁₈H₂₀N₂O₃·HCl. Вычислено, %: N 8,03.

2. Синтез гликопептида (Iб)

К раствору 0,82 г (1 ммоль) ГК в 20 мл диоксана при 0-+5°С прибавляли 0,40 г (3 ммоль) N-гидроксибензотразола и 0,55 г (2,5 ммоль) DCC. Смесь перемешивали при этой температуре 1 ч, при 20-22°С - 3 ч и оставляли на ночь в холодильнике. Отфильтровывали осадок дициклогексилмочевины и к фильтрату при охлаждении в бане со льдом прибавляли 3,0 ммоль гидрохлорида Gly-L-Phe-OBzl и 0,7 мл Et₃N. Реакционную смесь выдерживали с периодическим перемешиванием 24 ч при 20-22°С, разбавляли холодной водой, осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили. Продукты переосаждали из метанола эфиром и получали сырой защищенный гликопептид (Ia) (1,0 г). ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (ОН, NH), 1740 (COOBzl); 1660 (С=O); 1540 (CONH); 1510 (Ph).

2. Защищенный гликопептид (1a) (0,7 ммоль) растворяли в 20 мл 75% СН₃СООН и гидрировали в присутствии 10% Pd/C в течение 48 ч. Катализатор отфильтровывали и растворитель упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью хлороформ-метанол-вода, 100:10:1, 50:10:1, 30:10:1 (v/v). Гомогенные по ТСХ фракции объединяли и упаривали.

Выход 44%. R_f 0,45 (А), [α]_D ²⁰+54±2° (с 0,01; МеОН). ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (ОН, NH); 1720 (COOH); 1660 (C=O); 1540 (CONH); 1500 (Ph). УФ-спектр, λ_max (МеОН): 245 нм (lg ε 4,0). Найдено, %: N 4,8. C₆₂H₈₆O₂₀N₄. Вычислено, %: С 4,6. Mr=1207,33. Спектр ЯМР ¹³С (CD₃OD, δ, м.д.): 40,4 (C1); 27,4 (C2); 90,7 (С3); 40,8 (С4); 56,5 (С5); 18,4 (С6); 33,8 (С7); 46,8 (С8); 63,2 (С9); 38,1 (С10); 202,5 (С11); 129,2 (С12); 171,4 (С13); 44,6 (С14); 27,6; 27,5 (С15; С16); 32,9 (С17); 49,9 (С18); 42,5 (С19); 44,9 (С20); 32,0 (С21); 38,7 (С22); 28,2 (С23); 17,1; 16,6 (С25; С24); 19,4 (С26); 23,9 (С27); 29,1 (С28); 29,6 (С29); 179,3 (С30); 105,2 (С1'); 106,1 (C1"); 84,1 (C2'); 73,0 (C2"); 75,8 (С3'); 73,5 (С3"); 72,3 (С4'); 72,4 (С4"); 77,3 (С5'); 77,7 (С5"); 169,8 (С6'); 170,1 (С6"); Дополнительные сигналы (Gly-Phe): 174,6; 172,6 (COOH); 55,1; 55,0 (α-CH); 37,9; 37,6; 37,0; 36,2 (СН₂); 138,1; 130,5; 130,4; 129,5; 127,9 (Ph);

Пример 2. Изучение анти-ВИЧ-1 активности

Противовирусную активность препарата изучали на традиционной модели первично инфицированных ВИЧ (ВИЧ-1) перевиваемых Т-лимфоцитов человека (линия клеток МТ-4). В работе использовали штамм ВИЧ-1/ЭВК. В качестве эталонного препарата сравнения использовали известный ингибитор вирусной обратной транскриптазы - азидотимидин (АЗТ) и ГК - природный гликозид корней солодки голой.

Цитотоксичность исследуемого соединения оценивали на культуре клеток МТ-4. Препарат растворяли в ДМСО и в соответствующих разведениях вносили в лунки 96-луночного культурального планшета (по три лунки на каждое разведение) при рассеве клеток. Посевная концентрация клеток составляла 0,5×10⁶ клеток/мл. Конечная концентрация препарата в клеточной суспензии составляла от 1 мкг/мл до 2 мг/мл. Клетки культивировали в 96-луночных культуральных планшетах фирмы «Costar» (США) на ростовой питательной среде (среда RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина) при 37°С и 5% CO₂ в течение 4 суток.

По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трилановым синим. Строили дозозависимую кривую и определяли концентрацию соединения, вызывающую гибель 50% клеток - CD₅₀.

Для оценки анти-ВИЧ-1 активности соединения (Iб) клетки МТ-4 (концентрация 2×10⁶ клеток/мл) инфицировали штаммом ВИЧ-1/ЭВК с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. После адсорбции вируса в течение 1 часа при 37°С инфицированные и контрольные (без вируса) клетки разводили ростовой питательной средой до посевной концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночного культурального планшета. Затем в соответствующие лунки вносили растворы исследуемых соединений (по три лунки на каждое разведение) и далее культивировали, как описано выше. Конечная концентрация исследуемого соединения в клеточной суспензии составляла от 0,001 мкг/мл до 10 мкг/мл. В качестве эталонного препарата сравнения использовали АЗТ в концентрации 0,05 мкг/мл.

Ингибирующий эффект соединения оценивали на 4-ые сутки культивирования измерением количества вирусного антигена р24 иммуноферментным методом. Кроме того, определяли долю жизнеспособных клеток методом исключения трипановым синим. На основе полученных экспериментальных данных строили дозозависимые кривые и определяли количественные характеристики ингибирования: ID₅₀-концентрацию соединения, на 50% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 50% защиту клеток от гибели вследствие инфекции, ID₉₀-концентрацию соединения, на 90% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 90% защиту клеток от гибели вследствие инфекции, IS - индекс селективности или терапевтический индекс - отношение токсичной дозы препарата CD₅₀ к его эффективной дозе ID₅₀.

Таким образом, установлено, что для исследуемого соединения цитотоксическая доза CD₅₀ составляет 250 мкг/мл (табл.1). Соединение (Iб) является менее токсичным веществом, чем АЗТ (препарат сравнения).

Предлагаемое соединение (Iб) проявляет выраженную анти-ВИЧ-1 активность, с высокой эффективностью ингибируя накопление вирусспецифического белка р24 (табл.2, 3). Количественные характеристики ингибирования приведены в табл.2. ID₅₀=0,73 мкг/мл (в 170 раз ниже, чем у ГК), IS исследуемого соединения составляет 342,5, что в ˜30 раз выше, чем у ГК.

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно к гликопептиду глицирризиновой кислоты (ГК) с глицил-L-фенилаланином: 3-O-{2-O-[N-(β-O-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин-N-(β-D-глюкопиранозилуроноил)-глицил-L-фенилаланин)]}-(3β,20β)-11-оксо-олеан-12-ен-30-овая кислота, обладающий анти-ВИЧ-1 акивностью. Установлено, что данное соединение является менее токсичным веществом (CD₅₀=250 мкг/мл), чем известный анти-ВИЧ препарат азидотимидин (АЗТ) (CO₅₀=3,5 мкМ) и проявляет выраженную анти-ВИЧ-1 активность, с высокой эффективностью ингибируя накопление вирусспецифического белка р24 (ID₅₀=0,73 мкг/мл), что в 170 раз ниже, чем у ГК. Данное соединение превосходит ГК по индексу селективности (IS=342,5) более чем в 30 раз в культуре клеток МТ-4, инфицированных штаммом ВИЧ-1/ЭВК. 90%-ное подавление репродукции вируса наблюдается при концентрации гликопептида 0,80 мкг/мл (ID₉₀=0,80 мгк/мл). В концентрации 10 мкг/мл анти-ВИЧ-1 активность (ингибирование р24) предлагаемого соединения аналогична активности АЗТ в дозе 0,05 мкг/мл. 3 табл.

Гликопептид глицирризиновой кислоты с глицил-L-фенилаланином общей формулы (Iб),

проявляющий анти-ВИЧ-1 активность.