СПОСОБЫ, УСТРОЙСТВА И НАБОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ИЛИ МОНИТОРИНГА ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 G01N33/532 G01N33/577 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам, устройствам и наборам для детекции или мониторинга острого повреждения почек и конкретно к таким способам и наборам, которые основаны на измерении липокалина, белка, связанного желатиназой нейтрофилов (NGAL), также известного как липокалин нейтрофилов человека (HNL).

Предпосылки изобретения

Острое повреждение почек (AKI) представляет собой тяжелое состояние, которое может развиться как постоперационное осложнение, например, как осложнение после операции на сердце или трансплантации почек, как побочный эффект после введения диагностических средств in vivo, например, рентгеноконтрастных средств или нефротоксических терапевтических средств и т.п. и/или в результате других медицинских состояний, например, диабета, септицемии, геморрагического шока и тому подобное. Например, острое повреждение почек может возникать у 30% всех пациентов, после оперативного вмешательства на сердце, и связано с высоким уровнем смертности, более сложным курсом лечения, у пациентов, получающих диализ, со снижением качества жизни и высоким риском возникновения инфекционных осложнений. Несмотря на то, что известно, что терапия на ранних стадиях развития острой почечной недостаточности снижает уровень смертности и/или сокращает период курса лечения, на ранних стадиях часто трудно определить наличие острой почечной недостаточности.

В клинической практике, используемой в настоящее время, стандартный диагноз AKI получил название RIFLE (появление, повреждение, недостаточность, утрата функции, конечная стадия заболевания), который основан или на повышенном уровне креатинина в сыворотке крови, или на снижении диуреза. Креатинин в сыворотке крови представляет собой достоверный маркер состояния общей функции почек, но при острых нарушениях функции почек уровень креатинина является недостоверным и изменение его уровня запаздывает.

К счастью, обнаружено несколько перспективных биомаркеров, в том числе HNL/NGAL (в описании обозначен как NGAL), молекула повреждения почек-1, цистатин C и IL-18.

Особое внимание сосредоточено на использовании белка NGAL как маркера острого повреждения почек. NGAL представляет собой гликопротеин и первоначально был обнаружен как специфический компонент гранул нейтрофилов и является членом липокалинового семейства белков. Показано, что белок существует и как в виде мономера с массой 25 кДа, и как связанный дисульфидной связью гомодимер с массой 45 кДа, а также может быть ковалентно связан с желатиназой нейтрофилов (также известной как матриксная металлопротеиназа 9, MMP-9) через межмолекулярный дисульфидный мостик и существовать в виде гетеродимерной формы с массой 135 кДа. NGAL впервые описан как HNL, в качестве специфического маркера активности нейтрофилов in vivo и in vitro Xu et al, Journal of Immunological Methods, 171:245-252 (1994) и для использования в качестве диагностического маркера воспаления Venge, патент США 6136526, который включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Позже Devarajan et al, патентные публикации США № 2004/0219603 A1 и 2005/0272101 A1 описали использование NGAL в качестве биомаркера повреждения клеток почечных канальцев и других заболеваний и повреждений почек. Недавно для диагностики ранней почечной недостаточности BioBorto Diagnostics, Gentofte, Denmark предложили “NGAL ELISA Kit”, а также моноклональные антитела мыши против NGAL человека и моноклональные антитела мыши против NGAL крысы. Дополнительно Dent et al, Critical Care, 11(6):R127 (2007) описали устройство Triage® NGAL от Biosite Inc., San Diego, CA, использующее специфичное против NGAL моноклональное антитело, конъюгированное с флуоресцентной наночастицей, для использования при измерении NGAL в качестве биомаркера острого повреждения почек.

Однако необходимо дальнейшее совершенствование детекции и/или мониторинга острого поражения почек.

Сущность изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к способам, устройствам и наборам для детекции острого повреждения почек и для мониторинга эффективности способов лечения острого повреждения почек.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу определения острого повреждения почек у индивидуума, где способ включает (a) приведение в контакт образца жидкости организма индивидуума с устройством для анализа, где устройство включает антитело к связанному с желатиназой нейтрофилов липокалину (NGAL) и детектируемую метку, для возможности образования комплекса между белком NGAL в образце и антитела к NGAL и (b) определение количества комплекса, образованного между белком NGAL и антителом против NGAL в устройстве для анализа, с использованием детектируемой метки, где антитело к NGAL в устройстве обладает способностью связывания более чем двух эпитопов белка NGAL и где количество образованного комплекса отражает степень острого повреждения почек.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу детекции острого повреждения почек у индивидуума, где способ включает (a) приведение в контакт образца жидкости тела с поликлональным антителом к связанному с желатиназой нейтрофилов липокалину (NGAL) и (b) определение количества комплекса, образованного между NGAL образца и поликлональным антителом к NGAL, с использованием детектируемой метки, где количество комплекса отражает степень острого повреждения почек.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу мониторинга эффективности лечения острого повреждения почек, где способ включает стадии (a) приведения в контакт первого образца жидкости организма с первым устройством для анализа, включающим антитело к связанному с желатиназой нейтрофилов липокалину (NGAL) и детектируемую метку, для образования комплекса между белком NGAL первого образца с антителом к NGAL, (b) определение количества комплекса, образованного белком NGAL первого образца и антителом к NGAL в первом устройстве для анализа, с использованием детектируемой метки, где антитело к NGAL в устройстве обладает способностью к связыванию более двух эпитопов белка NGAL, (c) приведение в контакт второго образца жидкости организма индивидуума, где образец получен после начала лечения, со вторым устройством для анализа, включающим антитело к NGAL и детектируемую метку, для образования комплекса между белком NGAL второго образца с антителом к NGAL, (d) определение количества второго комплекса, образованного между NGAL второго образца и антителом к NGAL во втором устройстве для анализа, с использованием детектируемой метки, где антитело к NGAL в устройстве имеет способность связывания более чем двух эпитопов белка NGAL, и (e) сравнение количества первого комплекса с количеством второго комплекса, где снижение количества второго комплекса, по сравнению с количеством первого комплекса, показывает, что лечение является эффективным.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способу контролирования эффективности лечения острого повреждения почек, где способ включает стадии: (a) приведение в контакт образца первой жидкости организма индивидуума, где образец получен до начала лечения, с поликлональным антителом к связанному с желатиназой нейтрофилов липокалину (NGAL), (b) определение количества первого комплекса, образованного между белком NGAL первого образца и поликлональным антителом к NGAL с использованием детектируемой метки, (c) приведение в контакт второго образца жидкости организма индивидуума, где образец получен после начала лечения, с поликлональным антителом к NGAL, (d) определение количества второго комплекса, образованного между NGAL из второго образца и поликлональным антителом к NGAL, с использованием детектируемой метки и (e) сравнение количества первого комплекса, образованного между NGAL из первого образца и поликлональным антителом к NGAL, с количеством второго комплекса, образованного между NGAL из второго образца и поликлональным антителом к NGAL, где снижение количества второго комплекса, по сравнению с количеством первого комплекса, показывает, что проводимое лечение является эффективным.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения изобретение относится к набору для определения острого повреждения почек у индивидуума. В одном из вариантов осуществления набор содержит устройство для анализа, включающее антитело к связанному с желатиназой нейтрофилов липокалину (NGAL) и детектируемую метку, приспособленную для использования при определении количества комплекса, образованного между NGAL в образце жидкости организма и антителом к NGAL, где антитело к NGAL в устройстве обладает способностью связывания более чем двух эпитопов белка NGAL

В другом варианте осуществления набор содержит первое поликлональное антитело к связанному с желатиназой нейтрофилов липокалину (NGAL), приспособленное к взаимодействию с образцом жидкости организма, второе антитело к NGAL, приспособленное для применения при определении количества комплекса, образованного между белком NGAL в образце жидкости организма и первым поликлональным антителом к NGAL, и детектируемую метку, приспособленную для применения при определении количества комплекса, образованного между NGAL в образце жидкости организма и первым поликлональным антителом к NGAL.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к устройству для анализа для определения острого повреждения почек у индивидуума, где устройство содержит поликлональное антитело к NGAL, иммобилизованное на субстрате, и приспособленное для взаимодействия с образцом жидкости организма и детектируемую метку, приспособленную для связывания с комплексом белка NGAL и иммобилизованного поликлонального антитела к NGAL.

Как и способы, устройства и наборы по изобретению используют антитело к NGAL, обладающее способностью связывания более чем двух эпитопов белка NGAL, поразительно, что способы и наборы демонстрируют повышенную чувствительность к NGAL в качестве биомаркера и таким образом демонстрируют повышенную чувствительность при определении острого повреждения почек. Повышенная чувствительность может обеспечить более раннее определение такого повреждения и таким образом может позволить получить более ранний ответ на лечение.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способам определения в образце индивидуума белка нейтрофильного происхождения липокалина, связанного с желатиназой (NGAL). В более конкретном варианте осуществления способы можно использовать для того, чтобы отличить NGAL почечного происхождения и NGAL нейтрофилов. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения такие способы включают (a) определение относительных количеств мономерных, димерных и гетеродимерных форм белка NGAL в образце и (b) сравнение полученных в результате определения количеств, где преобладающее количество мономерных и/или гетеродимерных белков NGAL, по сравнению с димерным белком NGAL, показывает, что белок NGAL происходит из почек индивидуума, в то время как равное или преобладающее количество димерных белков NGAL, по сравнению с мономерным или гетеродимерным белком NGAL, демонстрирует, что белок NGAL происходит из нейтрофилов индивидуума. Определение или выяснение источника происхождения белка NGAL будет способствовать диагностике состояния и позволит, в частности, проводить более качественное, направленное лечение.

Эти и другие преимущества и усовершенствования будут более понятны с учетом следующего подробного описания.

Краткое описание чертежей

Подробное описание будет более полно понято в свете чертежей, в которых:

на фиг.1 показаны уровни креатинина в плазме до и после операции, как описано в примере 1. Верхние уровни нормы для мужчин и женщин соответственно составляют 100 мкмоль/л и 90 мкмоль/л. Уровни до операции значимо выше по сравнению с нормальными уровнями как для мужчин, так и для женщин (p<0,001).

На фиг.2A и 2B представлены уровни NGAL в моче до и после операции, измеренные с использованием анализа RIA, в котором используют поликлональное антитело и анализ, в котором используют два моноклональных антитела, соответственно, как описано в примере 1. Уровни у здоровых субъектов также представлены. Горизонтальной линией показан верхний 97,5 процентиль для здоровых контролей. В основном различия между уровнями до и после операции определяли анализом ANOVA и представлены на фигурах. Для обоих анализов уровни после операции являлись значимо отличающимися от уровней до операции во всех трех моментах времени (p<0,001).

На фиг.3A-3C показана коробчатая диаграмма зависимости между уровнями NGAL в моче через 2 часа после операции и временем экстракорпоральной циркуляции (время ECC), где уровни измерены анализом RIA, в котором используют поликлональное антитело, анализом ELISA, использующим поликлональные и моноклональные антитела, и анализом, в котором используют два моноклональных антитела, соответственно, как описано в примере 1. Показано статистическое расхождение и кратное увеличение медиан.

На фиг.4A и 4B представлена зависимость между урвнями NGAL в моче и GFR (цистатина C в плазме), которые измеряли с использованием анализа RIA, в котором использовали поликлональное антитело и анализ, в котором используют два моноклональных антитела, соответственно, как описано в примере 1. Представлены результаты линейного регрессионного анализа.

На фиг.5 представлена зависимость между количественным измерением белка NGAL в моче с использованием RIA, в котором используют поликлональное антитело к NGAL, и анализа, в котором используют два моноклональных антитела, как описано в примере 1. Линейный регрессионный анализ: r²=0,86, p<0,0001, n=331. На вставке представлена зависимость между двумя анализами в нижнем пределе концентрации.

На фиг.6 представлены результаты анализа Вестерн-блоттинг, как описано в примере 2, различных молекулярных форм NGAL в моче образецов U1 и U2, полученных от двух пациентов, подвергшихся оперативному вмешательству на сердце.

На фиг.7 представлены результаты измерений NGAL во фракциях мочи после гель-фильтрации на Superdex™-75, с использованием анализов на основе различных антител, как описано в примере 2. Основные молекулярные формы NGAL в пике 1 и в пике 2 являются димерными и мономерными соответственно. На вставке представлены результаты амплификации пика 1.

На фиг.8 представлена зависимость от времени процесса синтеза NGAL клетками HK-2, культивированными в кондиционированной среде, определенного в указанные периоды времени, как описано в пример 2. Значения представлены как среднее ± SD, получены в результате анализов с дублированием, из трех независимых экспериментов. Метки * и ** соответствуют p<0,05 и p<0,01 соответственно.

На фиг.9A и 9B показаны уровни NGAL, секретируемого клетками HK-2, выросшими или в полной среде, или полной среде, обогащенной стимулирующими средствами (фиг.9A), или выросшими в бессывороточной среде для кератиноцитов (K-SFM) или в K-SFM, обогащенной стимулирующими средствами (фиг.9B). Значения представлены как среднее ± SD, получены в результате анализов с дублированием, из трех независимых экспериментов. Метки *, ** и *** соответствуют p<0,05, p<0,01 и p<0,001 соответственно.

На фиг.10 на нижней панели представлено определение NGAL, который секретирован клетками HK-2, которые культивировали в кондиционированной среде анализом Вестерн-блоттинг, а на верхней панели представлена экспрессия мРНК NGAL клетками HK-2, собранными в указанные моменты времени после добавления свежей среды (C) или среды, обогащенной 1 нг/мл IL-β (S).

Различные аспекты, признаки и варианты осуществления изобретения будут более полно поняты в свете подробного описания.

Подробное описание

Первоначально NGAL выделили из нейтрофилов человека и в предшествующих работах показано, что измерение количества NGAL в крови является превосходным способом для распознавания острой инфекции, вызванной бактериями и вирусами. Позже исследовали прямую зависимость между экскрецией NGAL, например, в образцах жидкости организма, таких как моча, и острым повреждением почек. Удивительно, что сравнение результатов измерения NGAL посредством анализа моноклональное антитело-моноклональное антитело и анализами, использующими поликлональное антитело, показало значительные различия в клинической эффективности этих анализов. Результаты доказывают, что выбор антител для проведения анализов имеет решающее значение и конкретно применение антител, которые способны вступать в реакцию более чем с двумя эпитопами белка NGAL, обеспечивают способы анализа с повышенной чувствительностью, подтверждая, что в этих способах анализа идентифицируют различные варианты NGAL, экскретируемые в разных условиях. Настоящие способы, устройства и наборы используют, таким образом, антитело к NGAL, которое обладает способностью взаимодействовать более чем с двумя эпитопами белка NGAL. В связи с этим такое антитело к NGAL может включать одно или более поликлональных антител к NGAL и/или комбинацию одного или нескольких поликлональных антител к NGAL с одним или несколькими моноклональными антителами к NGAL, как дополнительно более подробно описано ниже. Дополнительно, антитело против NGAL или антитела можно использовать для захвата белка NGAL и/или можно использовать с детектируемой меткой.

Способы определения острого повреждения почек у индивидуума можно использовать у любого человека и конкретно у индивидуума, у которого может существовать риск развития острого повреждения почек. Такие индивидуумы включают, но ими не ограничиваются, индивидуумов в постоперационном периоде, после операции на сердце или трансплантации почек, которым вводили диагностические средства in vivo, например, рентгеноконтрастные средства или нефротоксические терапевтические средства и т.п., и/или индивидуумы с диабетом, септицемией, геморрагическим шоком или т.п. В конкретном варианте осуществления индивидуум представляет собой пациента, который перенес операцию на сердце и образец от пациента получают в пределах трех часов после оперативного вмешательство на сердце. В другом варианте осуществления способ определения повторяют на соответствующих образцах, полученных через определенные периоды времени после оперативного вмешательства на сердце, например через 2 часа и 5 часов после хирургического вмешательства, через 2 часа и 12 часов после хирургического вмешательства, через 2 часа, 12 часов и 24 часа после хирургического вмешательства или т.п.

Для определения в способах используют образец жидкости организма. В более конкретном варианте осуществления образец включает мочу, кровь, сыворотку или плазму или их очищенный компонент. В более конкретном варианте осуществления образец представляет собой мочу.

В одном из вариантов осуществления способ включает (a) приведение в контакт образца жидкости организма индивидуума с устройством для анализа, включающим антитело к NGAL и детектируемую метку, что обеспечивает образование комплекса белка NGAL в образце с антителом к NGAL, и (b) определение количества комплекса, образованного между белком NGAL из образца и антителом к NGAL в устройстве для анализа, использующем детектируемую метку, где антитело к NGAL в устройстве обладает способностью связывания более чем с двумя эпитопами белка NGAL и где количество образованного комплекса отражает степень острого повреждения почек. Как указано выше, антитело к NGAL, обладающее способностью к связыванию более чем двух эпитопов белка NGAL, можно обеспечить посредством одного или нескольких различных антител к NGAL.

Качественное или количественное определение образованного комплекса, который является показателем острого повреждения почек, можно осуществлять калибровкой с конкретным устройством или способом. В конкретном варианте осуществления, когда измерение выполняют радиоиммунологическим анализом (RIA), количество белка NGAL, которое является показателем острого повреждения почек, составляет 60 нг/мл или более. В другом варианте осуществления, когда измерение выполняют твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), количество белка NGAL, которое является показателем острого повреждения почек, составляет 100 нг/мл или более.

В одном из вариантов осуществления в способах используют поликлональное антитело против NGAL, например, как описано в статье Xu et al, Journal of Immunological Methods, 171:245-252 (1994), включенной в настоящий документ в качестве ссылки. Например, как описано в статье Xu et al, поликлональные антитела к NGAL (HNL) индуцируют в кроликах посредством большого количества внутрикожных инъекций очищенного белка, общим количеством 72 мкг, гомогенизированного в полном и неполном адъюванте Фрейнда. Специфичность антител можно оценивать двойной иммунодиффузией (Devereux et al., Nucleic Acid Research, 12(l):387-394 (1984)) в агарозе и тестировать против экстрактов нейтрофильных гранул и следующих очищенных белков: катепсина G, эластазы, миелопероксидазы, лизоцима, лактоферрина, катионного белка эозинофилов (ECP) и белка X эозинофилов (EPX/EDN). Можно, разумеется, использовать другие антитела к NGAL.

В одном из вариантов осуществления способы по изобретению включают (a) приведение в контакт образца жидкости организма индивидуума с поликлональным антителом к NGAL и (b) определение количества комплекса, образованного между NGAL из образца и поликлональным антителом к NGAL, с использованием детектируемой метки, где количество комплекса отражает степень острого повреждения почек. В конкретном варианте осуществления, например, антитело к NGAL включает поликлональное антитело и количество комплекса, образованного между белком NGAL в образце и антителом к NGAL, определяют общепринятыми способами радиоиммунологического анализа. Такие способы хорошо известны в данной области и включают, желательно, использование способов двойного радиоиммунологического анализа, где можно использовать два поликлональных антитела или где можно использовать одно поликлональное антитело и одно моноклональное антитело. В другом варианте осуществления количества комплекса, образованного между белком NGAL в образце и антителом к NGAL, определяют твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), где в ELISA используют, по меньшей мере, одно поликлональное антитело к NGAL. Способы ELISA также являются хорошо известными в данной области. В конкретных вариантах осуществления, использующих способ ELISA, устройство для анализа включает поликлональное антитело к NGAL и моноклональное антитело к NGAL, где одно из антител к NGAL связывается с субстратом, а другое антитело к NGAL связывается с детектируемой меткой. В более конкретном варианте осуществления поликлональное антитело против NGAL связывают, т.е. иммобилизуют на субстрате. В дополнительном варианте осуществления поликлональное антитело к NGAL связывается с субстратом, а моноклональное антитело к NGAL связывается с детектируемой меткой. Альтернативно в ELISA можно использовать устройство для анализа, включающее два различных поликлональных антитела против NGAL, одно из таких антител к NGAL связывается с субстратом, а другое связывается с детектируемой меткой. Можно использовать другие известные в данной области способы анализа, где, например, по меньшей мере одно поликлональное антитело к NGAL иммобилизуют на субстрате, и в более конкретных вариантах осуществления детектируемая метка связана с другим антителом к NGAL, которое может представлять собой как моноклональное антитело к NGAL, так и второе поликлональное антитело к NGAL.

Таким образом, изобретение также относится к устройствам и наборам для таких способов. В одном из вариантов осуществления устройство для анализа по изобретению включает поликлональное антитело к NGAL, иммобилизованное на субстрате и приспособленное для взаимодействия с образцом жидкости тела, а детектируемая метка приспособлена для связывания с комплексом белка NGAL и иммобилизованным поликлональным антителом к NGAL. Детектируемая метка может, в конкретных вариантах осуществления, существовать в комплексе с антителом к NGAL или моноклональным, или поликлональным для связывания белка NGAL, который образует комплекс с иммобилизованным поликлональным антителом к NGAL. Устройство для анализа может быть предусмотрено как устройство или набор для “диагностики на месте”, что облегчает его использование медицинским персоналом.

Как будет понятно, изобретение можно дополнительно использовать для контроля лечения острого повреждения почек посредством анализа большого количества образцов индивидуума до и после или во время осуществления схемы лечения. Такие способы, как правило, включают приведение в контакт первого образца жидкости организма индивидуума с первым устройством для анализа, как описано, и определение количества комплекса, образованного между белком NGAL из первого образца и антителом к NGAL в первом устройстве для анализа, приведение в контакт второго образца жидкости организма индивидуума, где образец получен после начала лечения, со вторым устройством для анализа, как описано, и определение количества второго комплекса, образованного между NGAL из второго образца и антителом к NGAL во втором устройстве для анализа, и сравнение количества первого комплекса с количеством второго комплекса. Снижение количества второго комплекса по сравнению с количеством первого комплекса показывает, что лечение является эффективным.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способам определения источника происхождения липокалина, белка, связанного с желатиназой нейтрофилов (NGAL) в образце индивидуума. Такие способы являются особенно эффективными для проведения различия между белком NGAL почек и белком NGAL нейтрофилов. В одном из вариантов осуществления способы включают (a) определение относительных количеств мономерных, димерных и гетеродимерных форм белка NGAL в образце и (b) сравнение полученных в результате определения количеств, где преобладающее количество мономерных и/или гетеродимерных белков NGAL, по сравнению с димерным белком NGAL, показывает, что белок NGAL происходит из почек индивидуума, в то время как равное или преобладающее количество димерных форм белка NGAL, по сравнению с мономерной или гетеродимерной формой белка NGAL, показывает, что NGAL происходит из нейтрофилов индивидуума. Показано, что белок NGAL почечного происхождения по существу не содержит димерную форму белка NGAL, например, как показано с помощью анализа Вестерн-блоттинг. В конкретном варианте осуществления образец содержит мочу. В другом конкретном варианте осуществления соответствующие количества белка NGAL в образце определяют приведением в контакт образца с устройством для анализа, включающим моноклональное антитело к NGAL. В другом варианте осуществления соответствующие количества белка NGAL в образце определяют посредством взаимодействия образца с устройством для анализа, включающим поликлональное антитело к NGAL. Можно использовать любое устройство для анализа и способы, такие как описано выше, Вестерн-блоттинг или другие общепринятые способы и/или устройства.

Как показано в примере 2 ниже, поликлональные и моноклональные антитела распознают (т.е. образуют комплекс с ними) мономерные, димерные и гетеродимерные формы белка NGAL. Однако для белка NGAL почечного происхождения в результате взаимодействия по существу не обнаруживаются димерные формы белка NGAL, в то время как димерные формы NGAL являются преобладающими в результатах, полученных для белка NGAL из нейтрофилов. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что различные виды белка NGAL экспонируют различные эпитопы, которые затем связываются, различными способами, например, моноклональными антителами. Таким образом, сравнение, как описано, может позволить отличить белок NGAL почечного происхождения от белка NGAL нейтрофильного происхождения.

Различные аспекты изобретения проиллюстрированы в следующих примерах.

ПРИМЕР 1

Этот пример описывает исследование определения NGAL с использованием антитела к NGAL, обладающего способностью связывания более чем с двумя эпитопами белка NGAL, и сопоставление полученных данных с определением NGAL, использующим только два моноклональных антитела.

Пациенты и образцы

В исследование включали всего 59 взрослых пациентов, которые подверглись оперативному вмешательству на сердце в Uppsala University Hospital. Возраст пациентов варьировал в диапазоне 27-85, в среднем 63 и в число пациентов включали 42 мужчин и 17 женщин. Оперативное вмешательство на сердце включало 23 операции аортокоронарного шунтирования, 15 операций протезирования аортального клапана, 4 операции по восстановлению функции митрального клапана, 3 комбинированные операции, 8 операций имплантаций вспомогательных устройств в левый желудочек и 6 других операций.

Образцы мочи и крови собирали до операции и в различные моменты времени (2, 24, 48 и 72 часа) после оперативного вмешательства на сердце. Образцы мочи сразу же центрифугировали при 3,000 об./мин при 4°C в течение 15 мин. Плазму с ЭДТА получали посредством центрифугирования крови при 3,000 об./мин при 4°C в течение 15 мин. Все образцы супернатантов сразу же разделяли на аликвоты и хранили при -20°C. Дополнительно другие образцы мочи в количестве 101 собирали от здоровых служащих и студентов, и они служили в качестве нормальных контролей.

Анализы уровней NGAL в моче

Уровни NGAL измеряли тремя различными анализами. В первом способе анализа использовали RIA, основанный на поликлональных антителах, согласно, как правило, способам Xu et al, выше. Во втором способе анализа использовали ELISA, основанную на моноклональных-поликлональных антителах. В третьем способе анализа использовали анализ, основанный на моноклональных-моноклональных антителах. Таким образом, первые два способа представлены по изобретению, тогда как третий способ использовали с целью сравнения.

Более конкретно, выполняли радиоиммунологический анализ (RIA) на основе поликлонального антитела, как описано ранее Xu et al, с некоторыми изменениями. 50 мкл раствора каждого образца или стандарта (от 2 мкг/л до 128 мкг/л) последовательно смешали с 50 мкл NGAL, меченого I¹²⁵ и 50 мкл специфических антител, надлежащим образом разведенных в буфере для анализа RIA. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов. Далее добавляли 500 мкл суспензии сорбированных на целлюлозе вторичных твердофазных антител (AA-SAC1, IDS LTD, England) и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. Комплексы антитела к NGAL, связанные сорбированным на целлюлозе антителом к IgG кролика, отделяли и осаждали центрифугированием при 3400 об./мин в течение 15 минут. После декантирования измеряли радиоактивность. Коэффициенты вариации (CV) анализа и серии анализов составили менее чем 6% и 10% соответственно. Результаты, полученные при измерении концентрации NGAL в моче посредством устройства для анализа RIA, обозначили как NGAL RIA.

В этом исследовании разработали устройство ELISA, основанное на поликлональных и моноклональных антителах. В кратком изложении, планшеты для микротитрования (Nunc Maxsorp, Agogent, Denmark) покрывали моноклональными антителами к NGAL (100 мкл/лунку, 1 мкг/мл), разведенными в карбонатном-бикарбонатном буфере (0,05M Na₂CO₃-NaHCO₃, pH 9,6, Invitrogen Corporation, UK) при 4°C. Дополнительные участки связывания блокировали в карбонатном-бикарбонатном буфере, содержащем 2% бычий сывороточный альбумин (200 мкг/лунку, Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany) при 37°C в течение 1 часа. 100 мкл стандартных образцов (от 0,1 нг/мл до 6,4 нг/мл) или разведенных образцов, разведенных в растворе для анализа (PBS, содержащий 0,2% бычий сывороточный альбумин, 0,1% Tween-20, 0,05% CTAB и 0,02% NaN₃), добавляли с дублированием и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем на лунку добавляли 100 мкл разведенных поликлональных антител кролика к NGAL и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа с последующим добавлением 100 мкл разведенных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (GE Healthcare, UK) и инкубировали при комнатной температуре еще в течение часа. Ферментативную реакцию на планшетах визуализировали раствором 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (100 мкл/лунку, Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany) при комнатной температуре в течение 20 мин и останавливали добавлением 1M H₂SO₄ из расчета 100 мкл/лунку. Планшеты промывали четыре раза в буфере для промывки (PBS, содержащий 0,05% Tween-20) между всеми стадиями, используя Microplate Washer (Anthos fluido, Salzburg, Austria). Оптическую плотность измеряли при 450 нм с поправкой на показания при 540 нм в контрольных лунках посредством микроспектрофотометра для чтения планшетов (SPECTRAmax 250, GMI, Inc., USA). Среднее значение CV анализа составило 2,8% (диапазон от 0,5 до 4,7%), а CV для серии анализов составило 6,3 (диапазон от 2,1 до 10,4%). Средняя степень извлечения составила 99% (диапазон от 93 до 105%). Результаты, полученные измерением концентрации NGAL в моче способом ELISA, обозначают как NGAL ELISA.

Анализ NGAL двойным моноклональным анализом проводили согласно инструкции производителя. Коэффициенты вариации анализа и серии анализов (CV%) составила менее чем 6%. Результаты измерения концентрации NGAL в моче, измеренные этим устройством, обозначают как NGAL моно-моно.

Уровни креатинина в моче измеряли на приборе Architect общепринятым способом в департаменте клинической химии в больнице университета Uppsala и использовали для корректировки уровней NGAL в моче при вариациях в разведениях мочи. Таким образом, уровни NGAL в моче представляли как NGAL в мкг/ммоль креатинина. Все измерения выполняли с дублированием и исследователи в лаборатории до конца исследования не знали об источниках происхождения образцов и клинических исходах.

Вестерн-блоттинг NGAL в моче

Вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее Towbin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4 (1979). В кратком изложении, 20 мкл образца мочи помещали в гель Nu-PAGE® с 4-12% Bis-Tris (Invitrogen Corporation, USA). После SDS-PAGE, белки переносили на мембрану PVDF, используя буфер для переноса Nu-PAGE® (Invitrogen Corporation, USA) при 25В в течение 1 часа. Дополнительные участки связывания на мембране PVDF блокировали раствором для блокирования (GE Healthcare, UK) в течение 1 часа. Блоты инкубировали с моноклональными антителами мыши к NGAL в течение 1 часа с последующей инкубацией в течение 45 мин со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (GE Healthcare, UK). Иммуноблоты детектировали, используя усиленную хемилюминесценцию по инструкциям производителя (Amersham ECL™ Western-Blotting System, GE Healthcare, UK).

Дополнительные анализы

Уровни креатинина и цистатина-C в плазме измеряли, используя общепринятые способы, в департаменте клинической химии больницы университета в Uppsala.

Статистический анализ

Непараметрические тесты Манна-Уитни и Вилкоксона для непарных и парных сравнений, линейный регрессионный анализ, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) проводили Medcalc 9,5 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium) и STATISTICA 8,0 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA). Статистическая значимость составляла p<0,05.

Результаты

Уровни креатинина в плазме до оперативного вмешательства и вплоть до 78 часов после оперативного вмешательства представлены на фиг.1, и не показано различий между результатами в представленные периоды времени. Клинический исход показал, что у трех субъектов наблюдались признаки острого повреждения почек с уровнями креатинина в плазме после оперативного вмешательства >50%.

Уровни NGAL в моче

Уровни NGAL в моче, полученные у здоровых субъектов и у пациентов, которые подверглись оперативному вмешательству на сердце, измеряли, используя три описанных способа. Результаты определения, полученные с использованием способов RIA и моно-моно, представлены соответственно на фиг.2A и 2B. Уровни до оперативного вмешательства были сравнимы с уровнями нормальных контролей. Через два часа после операции уровни значимо повысились (p<0,0001), приблизительно половина пациентов имеет показания выше верхней границы нормальных контролей. Значения медиан, в случае измерения способом RIA, представляли собой увеличение в 18,7 и 15,6 и 11,4 раза в случае измерения способом ELISA и способом моно-моно соответственно. Через 24 часа величины уровней опять снизились, но их значение все еще было выше, чем величины уровней до оперативного вмешательства. Величины уровней оставались значимо более высокими в течение всего послеоперационного периода времени (p<0,0001). В 72 часа кратность увеличения составила соответственно 6,8, 8,5 и 5,9 для способов RIA, ELISA и моно-моно. Аналогичную картину наблюдали для всех трех способов в течение всего времени.

Взаимосвязь со временем искусственного кровообращения (ECC)

Обнаружили значимую положительную корреляцию между временем ECC и величинами уровней NGAL, полученных через 2 часа после операции при измерении в моче посредством анализа RIA (r²=0,30, p<0,0001) и анализа ELISA (r²=0,16, p=0,006). Однако для анализа моно-моно такой корреляции не обнаружили. При разделении на подгруппы по времени ECC, составляющем более или менее чем 90 мин, результаты RIA увеличивались в 12,6 раза в образцах, полученных через 2 часа после операции (p=0,006). Результаты ELISA повышались в 6,5 раза (p=0,027) и результаты анализа моно-моно в 5,2 раза (p=0,07), как показано на фиг.3A-3C.

Отношение между уровнями NGAL в моче и функцией почек

В плазме в качестве показателей функции почек измеряли уровни креатинина и цистатина-С. Как показано выше, величины уровня креатинина оставались неизменными у большинства субъектов, только три субъекта после операции имели признаки острого повреждения почек, характеризующиеся увеличением уровня >50%. Величины уровней цистатина-С использовали для расчета уровня клубочковой фильтрации (GFR). В одномерном анализе GFR был связан с NGAL (RIA) (r²=0,28, p<0,001) и NGAL (моно-моно) (r²=0,25, p<0,001), как показано на фиг.4A и 4B. Также анализировали соотношение между уровнем NGAL в моче и уровнем креатинина в плазме. Субъектов разделяли на две группы согласно процентному увеличению креатинина в плазме в течение 72 часов послеоперационного периода по сравнению с базовой линией (<120% или >119%). Величины уровней NGAL (RIA) через 2 часа после оперативного вмешательства были значимо выше в группе, в которой повысились уровни креатинина >119% (p=0,03), в отличие от величин уровней NGAL (моно-моно), которые не были значимо увеличены (результаты не представлены).

Корреляция между тремя способами анализа NGAL

Общая корреляция между NGAL (RIA) и NGAL (моно-моно) представлена на фиг.5 (r²=0,86, p<0,0001, n=331). Корреляции в различные моменты времени представлены в таблице 1, и показаны очень хорошие величины корреляции с r², располагающимся в пределах между 0,952-0,996, но за исключением результатов, полученных через 2 часа после операции. В этот момент времени r² составил 0,680 и являлся значительно более низким, чем остальные (p<0,0001). Отношение между NGAL (RIA) и NGAL (моно-моно) в группе здоровых по внешнему виду субъектов составило r²=0,887 и также значимо отличалось от результатов, полученных через 2 часа (p=0,001). Регрессионный анализ по Пассингу и Баблоку всех 331 результатов привело к уравнению HNL (RIA)=0,6553+0,5358×NGAL (моно-моно) со значимым отклонением от прямой (p<0,01), которое также имело место в случае сравнения способов анализа NGAL (моно-моно) и NGAL (ELISA), NGAL (ELISA)=0,0370+0,1135×NGAL (моно-моно). Однако сравнение способов анализа NGAL (RIA) и NGAL (ELISA) привело к уравнению NGAL (ELISA)=-0,002192+0,2002×NGAL (RIA) без отклонения от прямой.

Молекулярные формы NGAL в моче

Преобладающие формы NGAL, обнаруженные в моче до и после оперативного вмешательства на сердце, обладали относительными молекулярными массами 25 (мономер), 45 (гомодимер) и 90-130 кДа (комплексы с MMP-9), соответственно. Представленность этих различных форм варьировала до и после оперативного вмешательства. Исследовали соотношение между гомодимерами и мономерами, основываясь на сканировании вестерн-блоттинга. Показано, что относительное количество гомодимеров увеличивалось вплоть до 24 часов после операции (p=0,02), после чего соотношение имело тенденцию к снижению.

Обсуждение

Результаты, представленные в настоящем документе, показали, что выбор антител в способе анализа NGAL является основополагающим для идентификации различных вариантов NGAL, экскретируемых в мочу при различных условиях. Конкретно, способы анализа, использующие антитело к NGAL, обладающее способностью вступать в реакцию более чем с двумя эпитопами белка NGAL, обеспечивают повышенную чувствительность.

Это исследование включало взрослых пациентов, подвергшихся оперативному вмешательству на сердце. Острое повреждение почек представляет собой одно из наиболее серьезных послеоперационных осложнений, которые могут поражать таких пациентов. В этом исследовании средние величины уровня креатинина в плазме сохранялись неизменными, только у трех субъектов имелось увеличение >50% в качестве признака острого повреждения почек. Несмотря на это, увеличение в 10-100 раз в уровне NGAL в моче обнаружили приблизительно у половины пациентов, только через 2 часа после окончания операции. Кроме того, уровни NGAL оставались неизменными в течение всего периода наблюдения. В целом, величины уровней NGAL показали слабую, но значимую взаимосвязь с функцией почек, что показало измерение уровней цистатина C или креатинина в плазме, что поддерживает предположение о том, что NGAL является более ранним и более чувствительным маркером нарушения функции почек. Более того, у двух из трех пациентов с повышенным уровнем креатинина >50% наблюдали существенно повышенные уровни NGAL через 2 часа после операции. Из этого исследования очевидно, что существенное увеличение уровня NGAL происходило в раннем периоде после операции у половины пациентов, но что это увеличение было только промежуточным, а затем следует постепенное увеличение в последующие сутки для всех пациентов. Таким образом, не желая быть ограниченными теорией, эти результаты могут отражать различные механизмы процессов, включенных в экскрецию в мочу NGAL. Ранняя фаза может отражать экскрецию преформированного NGAL из различных источников, таких как эпителий почек и популяции нейтрофилов, тогда как более поздняя экскреция может отражать синтез в почках de novo. Результаты различий в степени, в которой представлены в моче много различных по величине молекул NGAL в различные периоды времени, также предполагают вовлеченность различных механизмов процесса.

Сравнение трех различных способов анализа показало значимые различия. В целом, способы анализа значимо коррелировали, за некоторым явным исключением. Эти исключения оказались наиболее представлены в образцах, полученных через 2 часа после операции, как подтверждение того факта, что три анализа в этих условиях измеряют различные молекулярные варианты NGAL. Эти различия дополнительно являются примером того факта, что результаты анализа RIA и ELISA, в которых используют поликлональные антитела, по сравнению с анализом моно-моно, показали тесную взаимосвязь с клиническими параметрами, такими как протяженность времени экстракорпорального кровообращения и функция почек. Эти результаты, таким образом, показали, что идентификация всех форм NGAL в моче является важной для клинической характеристики анализа. RIA представляет собой анализ, основанный на поликлональных антителах, которые вероятно направлены ко всем эпитопам на молекуле, тогда как анализ, основанный на моноклональных-моноклональных антителах, направлен только на намеченные эпитопы, некоторые из которых могут или не могут быть замаскированы образованием комплексов или другими молекулярными взаимодействиями. Анализ ELISA, основанный на поликлональных-моноклональных антителах, продемонстрировал параметры, в некоторой степени промежуточные между этими двумя крайними случаями, что можно объяснять тем фактом, что этот вариант анализа позволяет распознавать больше эпитопов, чем двойной моноклональный анализ, но меньше, чем анализ, полностью основанный на поликлональных антителах. В сущности, описанные результаты подтверждают, что NGAL является полезным ранним биомаркером послеоперационного повреждения почек, когда его измеряют в моче и вновь демонстрируют, что конфигурация антитела в анализе имеет влияние на клиническую характеристику анализа, поскольку некоторые формы NGAL могут не обнаруживаться анализами, в которых используют антитела с ограниченной специфичностью.

ПРИМЕР 2

В этом примере описывают исследование определения NGAL в отношении мономерной, димерной и гетеродимерной форм при определении источника происхождения белка NGAL.

Образцы мочи и разделение гель-фильтрацией

В целом, 33 образца мочи собрали перед началом операции и в моменты времени 2 ч и 24 ч после оперативного вмешательства на сердце. Образцы мочи сразу после получения центрифугировали при 3,000 об./мин в течение 15 мин при 4°C и хранили разделенными на аликвоты при -20°C. Гель-фильтрацию одного образца мочи, взятого через 2 ч после операции, проводили на заполненных колонках Superdex™ 75 HR 10/30, используя систему FPLC (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden). Фракции по 250 л собирали и хранили при -20°C. Буфер для элюции представлял собой PBS. NGAL во фракциях определяли, используя RIA и ELISA, как описано ниже.

Чувствительность ELISA при количественном определении NGAL

Использовали шесть ELISA, основанные на различных антителах, для количественного определения NGAL, а именно 1) Mab697-поликлональные (моноклональная-поликлональная ELISA, как описано в примере 1), 2) Mab764-Mab765, 3) Mab764-поликлональные, 4) поликлональные-Mab765, 5) поликлональные-поликлональные и Mab-697-Mab765. Основные протоколы для этих пяти ELISA являлись такими же, как описано в примере 1, за исключением специфических антител, используемых в анализе. В кратком изложении, 96-луночные планшеты для микротитрования (Nunc Maxsorp, Agogent, Danmark) покрывали поликлональными антителами кролика или моноклональными антителами мыши (Mab697 и Mab764) к NGAL% человека. (Diagnostics Development, Uppsala, Sweden). Образцы и стандарты (в диапазоне 0,039-5 мкг/л) (100 мкл/лунку) инкубировали в течение 60 мин (образцы мочи и фракции после гель-фильтрации) или 90 мин (супернатанты культуры клеток) при комнатной температуре (RT). Затем 100 мкл/лунку разведенных биотинилированных поликлональных антител кролика или моноклональное антитело мыши (Mab765) к NGAL человек добавляли и инкубировали при RT в течение 60 мин с последующим добавлением 100 мкл/лунку разведенного стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (GE Healthcare, United Kingdom) (30 мин при RT). Плашки промывали четыре раза в буфере для промывки (PBS, содержащий 0,05% Tween-20), используя Microplate Washer (Anthos fluido, Salzburg, Austria) между всеми стадиями. Ферментативную реакцию визуализировали посредством раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (100 мкл/лунку) (Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany) в качестве субстрата при RT в течение 15 мин и реакцию останавливали добавлением 1 M H₂SO₄ (100 мкл/лунку). Оптическую плотность наблюдали при 450 нм на спектрофотометре (SPECTRAmax 250, GMI, Inc., USA).

RIA, основанный на поликлональных антителах для количественного определения NGAL

RIA проводили, как описано выше. В кратком изложении, 50 мкл или образца или 125 контролей (2 мкг/л-128 мкг/л) смешивали с 50 мкл NGAL, меченого I¹²⁵ и 50 мкл специфичных антител. Смесь инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре. Далее 500 мкл суспензии сорбированного на целлюлозе вторичного антитела (AA-SAC1, IDSLTD, United Kingdom) добавляли и инкубировали в течение 1 ч при 4°C. Комплексы NGAL-антитела, связанные с сорбированными на целлюлозе антителами к IgG кролика, осаждали посредством центрифугирования. После декантации измеряли радиоактивность.

Культура HK-2 и экспрессия белка NGAL

HK-2 (почки человека 2, CRL-2190) взяты из американской коллекции типовых культур (ATCC). Это клеточная линия эпителия проксимальных канальцев почек, полученная из почек без патологии. Клетки подвергали иммортализации посредством трансдукции с генами E6/E7 вируса папилломы человека 16 (HPV-16). Клетки культивировали или в полной среде для выращивания (бессывороточной среде для кератиноцитов (K-SFM), обогащенной 0,05 мг/мл экстракта гипофиза быка (BPE) и 5 нг/мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (EGF) (Invitrogen-Gibco®, United Kingdom)), или в неполной среде для выращивания при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO₂. Дополнительно клетки культивировали со специфическими стимулирующими средствами, включающими цитокины (IL-1β или TNF-α) (Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany) и LPS (Invitrogen-Giboco®, United Kingdom). 0,5×10⁵ клеток и 1 мл полной среды для выращивания на лунку высеивали в 24-луночные планшеты (FALCON®, USA). После 48 ч субкультивирования полную среду для выращивания удаляли и монослой (приблизительно 90% слияния) дважды промывали PBS (Invitrogen-Giboco®, United Kingdom). Клетки культивировали в кондиционированной среде в течение периода времени 72 ч. Супернатанты среды собирали для количественного определения NGAL в 2 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч соответственно.

Оценка экспрессии гена NGAL ОТ-ПЦР

Культивированные обычным способом и индуцированные 1 нг/мл IL-1β клетки HK-2 собирали в 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч и 24 ч для выделения суммарной РНК. РНК выделяли, используя набор RNeasy® Mini (QIAGEN, United Kingdom) по протоколу производителя. Одноцепочечную кДНК синтезировали, используя обратную транскриптазу SuperScript III (Invitrogen, United Kingdom), с 200 нг суммарной РНК. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли, используя ДНК полимеразу Taq (Invitrogen, United Kingdom) в DNA Engine PCR machine (PTC-200) (Bio-Rad, USA). Последовательности специфичных олигонуклеотидных праймеров для NGAL (5'-TCACCTCCGTCCTGTTTAGC-3' и 5'-CGAAGTCAGCTCCTTGGTTC-3') и β-актина (5'-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3' и 5'-GTGTTGAAGGTCTCAAACATGAT-3') выбирали согласно литературным данным и синтезировали посредством Thermo SCIENTIFIC (Germany). Начальное условие денатурации представляло собой прогрев при 94°C в течение 2 мин. Амплификацию посредством ПЦР проводили, используя стадию денатурации в течение 30 сек при 94°C, с последующей стадией отжига в течение 30 сек при 60°C (для NGAL) или 59°C (для β-актина) и стадией удлинения в течение 30 сек при 72°C. В целом для обоих генов реакцию проводили в течение 30 циклов с последующим финальным удлинением в течение 10 мин при 72°C. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле и определяли окрашиванием с бромистым этидием. Предполагаемый размер продуктов ПЦР (242 п.о. и 119 п.о. для NGAL и β-актина соответственно) верифицировали по отношению к лестнице ДНК шагом 50 п.о. (DirectLoad™ DNA Marker) (Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany).

Вестерн-блоттинг

Продукты высвобождения нейтрофильных гранул получали, как описано. Собирали супернатанты HK-2 в кондиционированной среде в момент времени 72 ч и добавляли 0,1 мМ PMSF (Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany) и таблетки, содержащие набор ингибиторов протеаз Complete™ (Roche, Mannheim, Germany). Супернатанты концентрировали, используя устройства с фильтрующей центрифугой Amicon® Ultra-4 (10,000 MW) (Millipore, USA). SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг проводили по инструкциям производителя. В кратком изложении, 25 мкл или мочи или концентрированных супернатантов кондиционированной среды или продуктов высвобождения нейтрофильных гранул наносили на гель с 4-12% Bis-Tris Nu-PAGE® (Invitrogen, USA) в условиях, не способствующих восстановлению. Белки переносили на мембрану PVDF Hybone-P (GE Healthcare, United Kingdom), используя буфер для переноса Nu-PAGE® (Invitrogen, USA) при 25V в течение 1 часа. Дополнительные участки связывания на мембране PVDF блокировали раствором для блокирования (GE Healthcare, United Kingdom) в течение 1 ч. Блоты инкубировали в течение ночи при RT или с поликлональными антителами кролика, или моноклональными антителами мыши (Mab 697, Mab 699, Mab 763, Mab 764 или Mab 765) или смесью моноклональных антител к NGAL человека с последующей инкубацией в течение 1 ч со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой (GE Healthcare, United Kingdom). Иммуноблоты определяли, используя усиленную хемилюминесценцию по инструкциям производителя (Amersham ECL™ Western Blotting System, GE Healthcare, United Kingdom).

Статистический анализ

Критерий Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) проводили посредством STATISTICA 8,0 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA) и Medcalc 9,5 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium). Значения представлены как среднее ± SD и медианы с межквартильным размахом. p<0,05 считали как значимую.

Результаты

Определение молекулярных форм NGAL в моче анализом Вестерн-блоттинг

Один вид поликлональных антител кролика и пять видов моноклональных антител мыши к NGAL использовали для идентификации молекулярных форм NGAL, представленных в моче, которую получали от пациента, подвергшегося оперативному вмешательству на сердце. В экспериментах на Biacore проверены пять моноклональных антител на способность вступать в реакцию с различными эпитопами. Как показано на фиг.6 для двух типичных образцов мочи (U1 и U2), обнаружены значимые различия между характеристиками антител. Три основные полосы систематически идентифицировали посредством поликлональных антител и идентифицировали как мономерные и димерные формы NGAL и образующие комплексы, гетеродимерные формы NGAL. Эти три формы также определяли посредством Mab764 и 765. Однако с каждым антителом дополнительно наблюдали дополнительные полосы. Однако кажется, что поликлональное антитело обладает более сильной аффинностью к димеру и более низкой аффинностью к гетеродимеру, чем два моноклональных антитела. Mab764 и 765 обладали очень схожими характеристиками по определению всех трех молекулярных форм. Mab764 и Mab765 к NGAL имели аффинность, от высокой до низкой, с мономерными, гетеродимерными и димерными формами соответственно. Также показано, что Mab763, 699 и 697 имели высокую аффинность к гетеродимерным формам, тогда как аффинность к димерным и мономерным формам была слабой. Однако способность поликлональных антител и Mab765 и 697 к определению мономерных и димерных форм в супернатантах стимулированных нейтрофильных гранулоцитов оказалась очень схожей.

Характеристики RIA и пяти способов анализа ELISA для измерения NGAL в моче

Рабочие характеристики RIA и пяти способов анализа ELISA представлены в таблице 1.

Таблица 1
Измерения HNL/NGAL в образцах мочи, полученных от пациентов, подвергшихся оперативному вмешательству на сердце, посредством различных способов анализа Анализ До операции, мкг/л Через 2 ч после операции, мкг/л Через 24 ч после операции Кратное увеличение (до операции/2 ч после операции) Критерий Стьюдента, значение p ANOVA
значение p RIA 7,19
(2,9-20,3) 248,20
(109-316,1) 26,96
(16,3-50,71) 34,5 0,000011 0,0000020 ELISA 1
(Mab697-поликлональное) 0,94
(0,15-3,13) 28,82
(23,32-37,96) 4,75
(2,59-9,89) 30,7 0,00035 0,00027 ELISA 2
(Mab764-Mab765) 6,22
(1,16-12,8) 192,80
(78,2-287) 15,50
(9,55-40,7) 31,0 0,000055 0,00002 ELISA 3
(Mab764-поликлональное) 3,08
(1,08-10,81) 239,10
(61,6-296,40) 19,80
(6,25-55,35) 77,6 0,000053 0,00015 ELISA 4
(поликлональное-Mab765) 2,26
(0,79-7,84) 164,10
(45,9-207,1) 13,05
(5,89-40,2) 72,6 0,00010 0,000094 ELISA 5
(Поликлональное-поликлональное) 2,96
(1,13-13,68) 220,00
(58,4-249,9) 19,00
(7,5-58,15) 74,3 0,000024 0,000079

ELISA 6
(Mab697-Mab765) 1,27
(0,32-3,46) 30,00
(6,4-30) 3,46
(2,07-10,35) 23,6 0,00099 0,00012 Значения представлены как медианы и межквартильный размах. Критерий Стьюдента выполняли между группами до операции и группами через 2 ч после операции и ANOVA выполняли среди группы до операции и группами через 2 ч и 24 ч после операции.

Измеряли уровни NGAL в моче в образцах, полученных до операции, и в образцах, полученных через 2 ч и 24 ч после операции, и значение уровней медиан для NGAL, полученные посредством анализов, представлены в таблице 1. Уровни медиан NGAL, полученные в образцах, взятых до операции и через 2 ч после операции, измеренные способом RIA, являлись самыми высокими среди семи способов анализа. С другой стороны, величины уровней, полученные ELISA, основанной на Mab697 (ELISA 1 и ELISA 6), являлись значимо более низкими по сравнению с другими анализами. В таблице 1 представлено различие в уровнях NGAL до операции и через 2 ч после операции, а также различия, в целом, в течение 24-часового периода. Для всех способов анализа показаны высокозначимые различия до операции и после операции. Кратные увеличения значений уровня медиан до операции относительно 2 ч после операции являлись самыми высокими и >70 в случае измерения способом ELISA 3 (Mab764-поликлональные), ELISA 5 (поликлональные-поликлональные) или ELISA 4 (поликлональные-Mab765) и в 23-34 раза в случае измерения RIA, ELISA 2 (Mab764-Mab765), ELISA 1 (Mab 697-поликлональные) или ELISA 6 (Mab697-Mab765).

Измерения NGAL различными способами анализа после гель-фильтрации образцов мочи

На основе результатов анализа Вестерн-блоттинг следующие две серии экспериментов предпринимались для исследования характеристик способов анализа при определении различных форм NGAL. Проводили гель-фильтрацию одного образца мочи, полученного через 2 ч после операции на колонке SuperdexTM 75 HR. Уровни NGAL во фракциях измерили RIA и пятью способами ELISA и представили на фиг.7. Посредством пяти способов ELISA получили два пика, соответствующие элюирующим объемам мономерных и димерных форм соответственно, и только один пик способом RIA. Последнее является следствием, вероятно, недостаточной чувствительности способа RIA. Наиболее значимые уровни NGAL в пике 2 получали способом RIA и наиболее низкие уровни способом ELISA 1 (ELISA, основанная на Mab697-поликлональные). Всеми способами анализа ELISA, за исключением ELISA 1, определили схожие уровни в пике 1, т.е. димерного NGAL (фиг.2, вставка). Анализом ELISA 1 измерили более высокие уровни димерного NGAL.

NGAL активируется в клетках HK-2, в случае если клетки растут в стрессовых условиях

Клетки HK-2 культивировали в течение различных периодов времени в бессывороточной среде для кератиноцитов (K-SFM), K-SFM обогащали, или 0,05 мг/мл экстракта гипофиза белка (BPE), или 5 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (EGF), или в полной среде для выращивания, рекомендованной ATCC (K-SFM, обогащенная 0,05 мг/мл BPE и 5 нг/мл EGF) с последующим культивированием в течение 48 ч в стандартных условиях. Уровни NGAL в супернатантах культуры определяли в различные моменты времени (2 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч) в течение 72 ч периода посредством ELISA 4. После 12-72 ч культивирования уровни NGAL в супернатантах культуры с K-SFM были значительно выше, чем в трех других средах для культивирования (фиг.8). Самые низкие уровни обнаружили в клетках, которые росли в полной среде для выращивания. Результаты также предполагают наиболее высокие уровни NGAL в супернатантах клеток, которые росли в K-SFM, обогащенной BPE, по сравнению с клетками, которые росли в K-SFM, обогащенной rEGF. В целом, эти результаты демонстрируют активацию продукции NGAL в стрессовых условиях, при которых клетки лишены необходимых факторов роста.

NGAL активируется в клетках HK-2 посредством IL-β, LPS и TNF-α

Клетки HK-2 выращивали в полной среде для выращивания в течение 48 ч, после чего клетки дополнительно растили в течение различных периодов времени в присутствии полной среды для выращивания, обогащенной или IL-β (1 нг/мл, человеческий), LPS (125 нг/мл, Klebsiella pneumonia), или TNF-α (20 нг/мл, человеческий). Как показано на фиг.9A, IL-β индуцировал наиболее значимые повышения уровней NGAL в супернатанте (увеличение от 8,9 до 41,9 раза). Также инкубирование с TNF-α и LPS индуцировало некоторое повышение уровней NGAL в супернатантах (в 2,2 и 1,6 раза соответственно), но менее значимое, чем в случае IL-β (p<0,001). Клетки HK-2 также культивировали в K-SFM, обогащенной IL-β, TNF-α или LPS. Значимое повышение NGAL было показано с IL-β (увеличение от 1,3 до 12,8 раза), но не с TNF-α или LPS (фиг.9B). Однако по сравнению с клетками, выросшими в полной среде для выращивания, это повышение являлось статистически менее значимым (p<0,001).

Молекулярные формы NGAL, продуцируемые клетками HK-2

Молекулярные формы NGAL, секретируемые клетками HK-2, определяли анализом Вестерн-блоттинг, используя смешанные моноклональные антитела (Mab697, Mab764 и Mab765) в качестве детектирующих антител. Результаты, представленные на фиг.10 (нижняя панель), показывают, что основной формой NGAL, которая секретируется клетками HK-2, выросшими или в полной среде для культивирования, или в стрессовых условиях в среде K-SFM, или в среде, обогащенной цитокинами (IL-β или TNF-α) или LPS, является мономерная форма. Также после стимуляции IL-β наблюдается гетеродимерная форма NGAL, тогда как димерная форма отсутствует в отличие от результатов, полученных в супернатантах нейтрофилов человека (фиг.6). На фиг.10 представлены уровни мРНК NGAL для клеток HK-2 после инкубации с IL-β. Результаты показали повышенную экспрессию, что свидетельствует об активном синтезе NGAL клетками HK-2.

Обсуждение

Первоначально NGAL выделили из нейтрофилов человека, и авторами ранее было показано, что измерение NGAL в крови является превосходным способом для распознавания наличия острых инфекционных заболеваний, вызванных бактериями или вирусами. Дальнейшие исследования показали, что NGAL, при некоторых условиях, может также экспрессироваться в других клетках, таких как клетки почек, печени и клетки эпителиальной ткани, и что измерение NGAL в моче и плазме может служить в качестве биомаркера острого повреждения почек. В примере 1 показано, что конфигурация антитела при анализе NGAL имеет влияние на клиническую характеристику анализа. Некоторые формы NGAL обнаружили в моче пациентов с AKI. Этот пример дополнительно показывает, что мономерные формы и в некоторой степени гетеродимерные формы являются преобладающими формами, которые продуцируются канальцевыми эпителиальными клетками, тогда как димерная форма, по-видимому, является уникальной для нейтрофилов (см. фиг.6). Нейтрофилы также продуцируют мономерную форму. Одним интересным результатом настоящего исследования является различие в распознавании этих различных форм используемыми антителами, учитывая, что мономерные и демерные формы, происходящие из нейтрофилов, идентифицируются всеми моноклональными антителами, а также поликлональными антителами. Эти данные расходятся с тем фактом, что Mab697 почти полностью не способен распознавать эти формы в моче. Также Mab765 показал сильную реакционную способность по отношению к этим формам в супернатантах нейтрофилов, но только слабую способность к распознаванию димерных форм в моче. Не желая быть связанными теорией, предполагают наличие различий в эпитопах, которые экспонируются различными формами NGAL, и, таким образом, причиной являются различия в молекулярных структурах.

Значительное различие в определении количества NGAL в моче посредством используемых способов анализа также свидетельствует о наличии различных молекулярных форм NGAL в моче и различий в распознавании эпитопов антителами. Очень отличались не только уровни до операции, несмотря на одно и то же калибровочное устройство, используемое в анализах, но также относительное изменение уровней после операции. Очевидно, что кратные увеличения составляли самое большое значение при измерении посредством ELISA, где использовались или только поликлональные антитела, или поликлональные антитела в сочетании или с Mab764, или с Mab765. Эти два вида mab представляли собой антитела, которые также распознавали наибольшее количество форм в моче при анализе Вестерн-блоттинг. Однако комбинация этих двух mab обладала меньшими способностями к распознаванию, что означает, что дополнительные молекулярные формы связываются поликлональными антителами. Из экспериментов с гель-фильтрацией можно предположить, что различия в распознавании различных форм в первую очередь связаны с различиями в распознавании мономерной формы NGAL, т.к складывается впечатление, что только один способ анализа позволяет распознать, иным способом, димерную форму. Различия не могут быть объяснены аналитическими характеристиками способов анализа в целом, т.к. все способы анализа показали одинаковую чувствительность, погрешность, степень извлечения и т.д.

Основываясь на фракционной экскреции NGAL у человека (CNGAL/CCr), in situ гибридизация у мышей и том факте, что NGAL представляет собой белок острой фазы, в предыдущих сообщениях описано, что аккумулирование NGAL в моче может происходить за счет местного синтеза в почках, который включает основную фракцию NGAL в моче и синтеза в отдаленных органах и иммунных клетках. Подобные выводы, однако, являются не очень убедительными за счет некоторой неопределенности, связанной с процессом прохождения NGAL через почки, в отношении уровня клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции и разбавления мочой, а также и того факта, что in situ гибридизацию проводили у мышей и что такие способы слабо отражают способность клеток к продукции белка. Наши результаты, однако действительно поддерживают представление о том, что канальцевые эпителиальные клетки человека обладают способностью продуцировать NGAL, т.к. экспрессию мРНК и продукцию белка индуцировали при некоторых условиях, относящихся к нахождению почек в стрессовых условиях или в условиях воспаления, такие, как наблюдают в течение периода экстракорпорального кровообращения. Мы обнаружили, что цитокин IL-1R будет самым мощным действенным стимулом, который совместим с действием других, с использованием эпителиальной клеточной линии легких. Высокие уровни секреторных белков нейтрофилов и цитокинов, таких как IL-β и TNF-α, наблюдали в течение и после оперативного вмешательства на сердце во многих предыдущих исследованиях. Результаты изобретения, таким образом, демонстрируют, что NGAL присутствует в моче во множестве различных форм и что являются полезными способы анализа для количественного определения NGAL в моче, которые учитывают это разнообразие. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к анализу, который предпочтительно идентифицирует NGAL, происходящий из клеток канальцевого эпителия, т.к. молекулярная структура NGAL производит впечатление слабо отличающейся от структуры NGAL, происходящего из нейтрофилов. Такие способы анализа являются, таким образом, более специфичными и чувствительными при определении AKI и представляют большую пользу для пациентов с риском развития нарушенной функции почек.

Способы, устройства и наборы по настоящему изобретению описаны на основании конкретных вариантов осуществления, и в разделе примеров продемонстрированы конкретные аспекты изобретения. Однако следует понимать, что дополнительные варианты осуществления, аспекты, вариации и модификации изобретения может осуществлять специалист в данной области без отклонения объема изобретения, определенного формулой изобретения.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа определения в образце индивидуума белка нейтрофильного происхождения липокалина, связанного с желатиназой (NGAL), для определения острого повреждения почек у индивидуума, где преобладающее количество мономерной и/или гетеродимерной форм белка NGAL, по сравнению с димерной формой белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из почек индивидуума и что у индивидуума наблюдается острое повреждение почек, тогда как равное или преобладающее количество димерной формы белка NGAL, по сравнению с мономерной или гетеродимерной формой белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из нейтрофилов индивидуума и что указанный индивидуум не имеет острого повреждения почек; набора для определения в образце относительных количеств мономерной, димерной и гетеродимерной форм NGAL; применения набора в указанном способе. Группа изобретений обеспечивает установление более точного диагноза и таким образом способствует лучшему направленному лечению. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 пр., 10 ил., 1 табл.

1. Способ определения в образце индивидуума белка нейтрофильного происхождения липокалина, связанного с желатиназой (NGAL), включающий стадии:
(a) определение относительных количеств мономерных, димерных и гетеродимерных форм связанного с желатиназой нейтрофилов белка липокалина NGAL в образце, полученном из организма индивидуума, и
(b) сравнение полученных в результате определения количеств, где преобладающее количество мономерной и/или гетеродимерной формы белка NGAL, по сравнению с димерной формой белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из почек индивидуума, тогда как равное или преобладающее количество димерной формы белка NGAL, по сравнению с мономерными или гетеродимерными формами белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из нейтрофилов индивидуума.

2. Способ по п.1 для определения острого повреждения почек у указанного индивидуума, где преобладающее количество мономерной и/или гетеродимерной форм белка NGAL, по сравнению с димерной формой белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из почек индивидуума и что у индивидуума наблюдается острое повреждение почек, тогда как равное или преобладающее количество димерной формы белка NGAL, по сравнению с мономерной или гетеродимерной формой белка NGAL, указывает, что белок NGAL происходит из нейтрофилов индивидуума и что указанный индивидуум не имеет острого повреждения почек.

3. Способ по п.1 или 2, где относительные количества белка NGAL в образце определяют посредством приведения образца в контакт с антителом к NGAL.

4. Способ по п.3, где антитело к NGAL включает поликлональное и/или моноклональное антитело к NGAL.

5. Способ по п.4, где антитело к NGAL включает два поликлональных антитела к NGAL.

6. Способ по п.4, где антитело к NGAL включает два различных моноклональных антитела к NGAL.

7. Способ по любому из пп.4-6, где стадия определения относительных количеств мономерной, димерной и гетеродимерной форм белка NGAL включает (i) приведение образца из жидкости организма индивидуума в контакт с антителом к NGAL и детектируемой меткой для обеспечения образования комплекса белка NGAL в образце с антителом к NGAL и (ii) определение относительных количеств комплексов, образованных между мономерными, димерными и гетеродимерными формами белка NGAL из образца и антителом, с использованием детектируемой метки.

8. Способ по п.3, где стадия определения относительных количеств мономерной, димерной и гетеродимерной форм белка NGAL включает (i) приведение образца из жидкости организма индивидуума в контакт с антителом к NGAL и детектируемой меткой для обеспечения образования комплекса белка NGAL в образце с антителом к NGAL и (ii) определение относительных количеств комплексов, образованных между мономерными, димерными и гетеродимерными формами белка NGAL из образца и антителом, с использованием детектируемой метки.

9. Способ по п.7, где количество комплекса, образованного между белком NGAL в образце и антителом к NGAL, определяют твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA).

10. Способ по любому из пп.1, 2, 4-6, 8 и 9 для контролирования лечения острого повреждения почек, где указанный способ включает анализ множества образцов из организма индивидуума, полученных до и после или в течение курса лечения.

11. Способ по п.3 для контроля лечения острого повреждения почек, где указанный способ включает анализ множества образцов из организма индивидуума, полученных до и после или в течение курса лечения.

12. Способ по п.7 для контроля лечения острого повреждения почек, где указанный способ включает анализ множества образцов из организма индивидуума, полученных до и после или в течение курса лечения.

13. Способ по любому из пп.1, 2, 4-6, 8, 9, 11 и 12, где образец представляет собой мочу.

14. Набор для определения в образце относительных количеств мономерной, димерной и гетеродимерной форм связанного с желатиназой нейтрофилов белка липокалина (NGAL), где набор включает первое антитело к NGAL, адаптированное для образования комплекса с белком NGAL в образце жидкости организма, второе антитело к белку NGAL, адаптированное для использования при определении количества комплекса, образованного между белком NGAL в образце жидкости организма и первым антителом к NGAL, и детектируемую метку, адаптированную для использования при определении количества комплекса, образованного между NGAL в образце жидкости организма и первым антителом к NGAL.

15. Набор по п.14, где первое и второе антитела к NGAL включают два различных моноклональных антитела к NGAL; моноклональное антитело к NGAL и поликлональное антитело к NGAL; или два поликлональных антитела к NGAL.

16. Набор по п.14 или 15, где одно из указанных первых или вторых антител к NGAL адаптируют для образования комплекса с указанной мономерной, димерной или гетеродимерной формами NGAL, а другое указанное первое или второе антитело к NGAL адаптируют для образования комплекса только с указанной гетеродимерной формой NGAL.

17. Применение набора по любому из пп.14-16 в способе по любому из пп.1-13.