СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОЛЧАНКИ Российский патент 2017 года по МПК A61K39/395 

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США 61/177924, поданной 13 мая 2009 г. Полное содержание этой заявки включено в данный документ посредством ссылки.

Список последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей, поданный через EPS-Web, его полное содержание включено в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 15 июня 2010, называется 16620020.txt и имеет размер 1035 байтов.

Уровень техники изобретения

Волчанка представляет собой аутоиммунное заболевание, поражающее многие части организма, такие как кровь, центральная нервная система (ЦНС), сердце, печень, суставы, почки, легкие, кожа, кишечник и сосудистая система. В тканях или органах, пораженных волчанкой, обычно наблюдается воспаление. Симптомы волчанки включают аномальные клинические анализы крови, артралгии, атеросклероз, расстройства ЦНС, инфекции, боль в суставах, недомогание, высыпания, язвы, нефрит, сердечно-сосудистые заболевания и выработку аутоантител. Проявления волчанки включают системную красную волчанку, волчаночный нефрит, кожную красную волчанку, волчанку ЦНС, сердечно-сосудистые проявления, легочные проявления, печеночные проявления, гематологические проявления, желудочно-кишечные проявления, скелетно-мышечные проявления, красную волчанку новорожденных, детскую системную красную волчанку, лекарственную красную волчанку, антифосфолипидный синдром и синдромы дефицита комплемента, являющиеся причиной проявлений волчанки. См., например, под редакцией Robert G. Lahita, Systemic Lupus Erythematosus, 4е издание, Elsevier Academic Press, 2004. В Соединенных Штатах примерно 1,5-2 миллиона человек страдает волчанкой. 90% этих пациентов с волчанкой - женщины. В настоящее время волчанку обычно лечат кортикостероидами и иммунодепрессантами. Существует насущная необходимость в усовершенствованных терапевтических методах и композициях для лечения волчанки.

Сущность изобретения

Авторы данного изобретения изобрели новые полезные способы и композиции для лечения волчанки с помощью анти-CD52 антител (например, алемтузумаб). В некоторых вариантах осуществления используют антитела, существенно истощающие лимфоциты. В других вариантах осуществления можно также использовать способы и антитела, которые существенно не истощают лимфоциты.

В одном аспекте изобретение относится к способам увеличения содержания FoxP3⁺ (например, CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺) регуляторных T-клеток у пациента с волчанкой, включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества анти-CD52 антитела. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение пациенту средства, стимулирующего указанные регуляторные T-клетки, например, рапамицина, TGF-β (активного или латентного TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5), IL-10, IL-4, IFN-α, витамина D3, дексаметазона или мофетила микофенолята. Регуляторные T-клетки могут инфильтрироваться в зону воспаления у пациента с волчанкой, например, в кровь, центральную нервную систему (ЦНС), сердце, печень, суставы, почки, легкие, кожу, кишечник или сосудистую систему.

В другом аспекте изобретение относится к способам снижения уровня белка и/или альбумина в моче у пациента с волчанкой, включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества анти-CD52 антитела.

В другом аспекте изобретение также относится к способам истощения лимфоцитов (например, B-клеток и T-клеток) у пациента с волчанкой, включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества анти-CD52 антитела.

В другом аспекте изобретение также относится к способам лечения пациента, нуждающегося в этом (например, пациента с волчанкой), включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества анти-CD52 антитела в сочетании с по меньшей мере еще одним соединением. Второе соединение, как правило, представляет собой соединение, которое используют для лечения волчанки, например, стандартный лечебный препарат или экспериментальный препарат.

Способы по данному изобретению можно использовать для лечения пациента, имеющего одно или несколько проявлений волчанки, включая, без ограничения, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, кожную красную волчанку, волчанку центральной нервной системы (ЦНС), сердечно-сосудистые проявления, легочные проявления, печеночные проявления, гематологические проявления, желудочно-кишечные проявления, скелетно-мышечные проявления, красную волчанку новорожденных, детскую системную красную волчанку, лекарственную красную волчанку, антифосфолипидный синдром и синдромы дефицита комплемента, являющиеся причиной проявлений волчанки.

В способах комбинированной терапии по данному изобретению анти-CD52 антитело и дополнительные терапевтические средства можно вводить в любом порядке, подходящем для пациента. Анти-CD52 антитело и дополнительное средство(ва) можно вводить одновременно или последовательно, либо и так, и так. Например, дополнительное средство(ва) можно вводить до или после анти-CD52 терапии. По данному изобретению также предложены наборы, подходящие для такой комбинированной терапии.

В некоторых вариантах осуществления пациент является человеком, и анти-CD52 антитело направлено против CD52 человека. В этих вариантах осуществления может оказаться предпочтительным, если анти-CD52 антитело будет человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом с Fc-областью человека.

Изобретение также относится к способам использования анти-CD52 антитела для производства лекарственного средства, полезного для методов лечения по данному изобретению.

Краткое описание фигур

На фиг.1A-1B представлено истощение лимфоцитов у мышей NZB/NZWF1, получавших моноклональное антитело IgG2a крысы против CD52 мыши. Кровь собирали от отдельных мышей в исходный момент времени до первой инъекции контрольных IgG крысы или антител крысы против CD52 мыши и через два дня, перед второй инъекцией антител. Образцы крови окрашивали и анализировали методом проточной цитометрии для получения абсолютного количества CD3⁺ T-клеток и CD19⁺ B-клеток.

На фиг.2A-2F показано, что лечение антителом крысы против CD52 мыши успешно снижает уровни белка в моче у мышей NZB/NZWF1. На фиг.2A-2E показано, что у мышей, получавших антитело против CD52 мыши, уровни белка в моче сравнимы с таковыми у мышей из группы положительного контроля, получавших циклофосфамид, тогда как у контрольных мышей, получавших IgG крысы, наблюдали уровни белка в моче, сравнимые с таковыми у контрольных мышей, получавших растворитель (PBS). На фиг.2F показано, что к концу исследования только у 38% мышей, получавших антитело против CD52 мыши, и у 20% мышей, получавших циклофосфамид, начиналась тяжелая протеинурия (>500 мг/дл/сутки), по сравнению с 67% мышей, получавших IgG крысы, и 60% мышей, получавших растворитель.

На фиг.3A-3G показано, что лечение антителом крысы против CD52 мыши успешно снижает уровни альбумина в моче у мышей NZB/NZWF1. Уровни альбумина в моче оценивали полуколичественным методом «Albustix» (фиг.3A) и количественным анализом ELISA (фиг.3B). На фиг.3A-3F показано, что уровни альбумина в моче у мышей, получавших антитело против CD52, были ниже, чем уровни, наблюдаемые у мышей, получавших растворитель (PBS) и контрольные IgG крысы. На фиг.3G показано, что к концу исследования только у 50% мышей, получавших антитело против CD52, развивалась значительная альбуминурия (>40 мг/дл/сутки) по сравнению с 80% мышей, получавших растворитель, и 89% мышей, получавших IgG крысы.

На фиг.4 показано, что лечение антителом крысы против CD52 мыши не оказывало заметного воздействия на появление аутоантител против дсДНК. Титры антител у мышей, получавших антитело против CD52 мыши, были сравнимы с титрами у мышей, получавших растворитель и IgG крысы. Только прием циклофосфамида эффективно уменьшал возрастание количества сывороточных антител к дсДНК.

На фиг.5 показано, что лечение антителом крысы против CD52 мыши в значительной степени способствовало выживанию мышей NZB/NZWF1. Сравнимые уровни выживаемости были получены с двумя дозами антитела против CD52 мыши (выживаемость 75%) относительно еженедельных инъекций циклофосфамида (80%) (значение P=0,9218, антитело против CD52 мыши относительно циклофосфамида). Выживаемость составляла только 20% у мышей, получавших контрольные IgG крысы (значение P=0,0401, антитело против CD52 мыши относительно контрольных IgG крысы) (фиг.5).

На фиг.6A-6C представлены результаты гистологического исследования собранных почек мышей. Хотя не наблюдалось статистически достоверных различий в средних показателях степени тяжести гломерулопатии, интерстициального воспаления или количества белковых цилиндров между экспериментальными группами, лечение антителом против CD52 мыши и циклофосфамидом снижало средние показатели гломерулопатии по сравнению с контрольными группами, принимавшими IgG крысы и растворитель, как показано на фиг.6A. В группе с циклофосфамидом также наблюдали меньшее интерстициальное воспаление, как показано на фиг.6B.

На фиг.7A-7C показано увеличение количества FoxP3⁺ регуляторных T-клеток, инфильтрирующих почки. Почки мышей окрашивали на присутствие CD4⁺, CD8⁺ и FoxP3⁺ клеток при помощи иммунофлуоресцентно меченных антител. Срезы почек просчитывали вслепую по шкале от 0 до 4 на относительное содержание положительных клеток. Лечение циклофосфамидом приводило к значительному уменьшению CD4⁺, CD8⁺ и FoxP3⁺ клеток, инфильтрирующих почки. Для сравнения, лечение анти-CD52 антителом не позволяло предотвратить инфильтрацию почек CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитами, однако увеличивало присутствие клеток, положительных по FoxP3, маркеру регуляторных T-клеток.

На фиг.8A-8B показано эффективное истощение лимфоцитов моноклональным антителом мыши против CD52 мыши (клон W19) у мышей NZB/NZWF1 при различных уровнях доз (1 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг). В крови (фиг.8A) наблюдали дозозависимое истощение во всех лимфоидных популяциях при дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг, приводящее к почти полному истощению всех типов клеток (CD4⁺ клеток, CD8⁺ клеток, NK клеток и B-клеток). В селезенке (фиг.8B) наблюдали аналогичное дозозависимое истощение. В частности, в селезенке наблюдали значительное истощение как CD4⁺, так и CD8⁺ T-клеток, тогда как истощение B-клеток, судя по всему, происходило в меньшей степени при всех исследуемых уровнях доз.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение основано на открытиях авторов изобретения, связанных с введением анти-CD52 антител субъекту. Авторы изобретения обнаружили, что анти-CD52 антитела увеличивают инфильтрацию FoxP3⁺ регуляторных T-клеток в местные воспаленные ткани (почки) в мышиной модели волчанки. Авторы изобретения также обнаружили, что введение анти-CD52 антител может снижать уровни белка и альбумина в моче в данной мышиной модели.

Соответственно, данное изобретение относится к способам лечения волчанки у пациента (например, пациента-человека) анти-CD52 антителами. В некоторых вариантах осуществления лечение поможет привлекать FoxP3⁺ регуляторные T-клетки в местные воспаленные ткани, такие как ЦНС, почки, сердце и печень, тем самым облегчая или предотвращая симптомы у пациентов с волчанкой. В некоторых вариантах осуществления лечение поможет снижать уровни белка и/или альбумина в моче у пациентов с волчанкой. В некоторых вариантах осуществления лечение будет истощать лимфоциты у пациентов с волчанкой. В дополнительных вариантах осуществления данного изобретения пациента также лечат средством, стимулирующим рост и/или активацию FoxP3⁺ регуляторных T-клеток, чтобы улучшать регуляцию иммунной системы пациента и облегчать симптомы аутоиммунного заболевания.

Проявления волчанки

Способы по данному изобретению можно использовать применительно к пациентам, страдающим от различных проявлений волчанки, включая, без ограничения, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, кожную красную волчанку, волчанку ЦНС, сердечно-сосудистые, легочные, печеночные, гематологические, желудочно-кишечные и скелетно-мышечные проявления; красную волчанку новорожденных, детскую системную красную волчанку, лекарственную красную волчанку, антифосфолипидный синдром и синдромы дефицита комплемента, являющиеся причиной проявлений волчанки. Способы по изобретению можно использовать для лечения пациентов, страдающих от острого приступа волчанки, или пациентов с неактивной формой волчанки.

Терапия анти-CD52 антителом

В способах по данному изобретению антитела к CD52 вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве для достижения клинического результата, что определяют путем контролирования пораженной системы органов (например, гематурии и/или протеинурии волчаночного нефрита) и/или использования индекса активности болезни, отражающего суммарный балл степени тяжести заболевания по нескольким системам органов (например, BILAG, SLAM, SLEDAI, ECLAM). См., например, Mandl et al., «Monitoring patients with systemic lupus erythematosus» в Systemic Lupus Erythematosus, 4^ое издание, pp. 619-631, под редакцией R. G. Lahita, Elsevier Academic Press, (2004). Терапевтически эффективное количество анти-CD52 антитела представляет собой количество, помогающее проходящему лечение субъекту достичь одного или нескольких желаемых клинических результатов.

CD52 представляет собой белок клеточной поверхности, экспрессируемый в больших количествах как нормальными, так и злокачественными B и T-лимфоцитами (Hale et al., J Biol regul Homeost Agents 15: 386-391 (2001); Huh et al., Blood 92: Abstract 4199 (1998); Elsner et al., Blood 88: 4684-4693 (1996); Gilleece et al., Blood 82: 807-812 (1993); Rodig et al., Clin Cancer Res 12: 7174-7179 (2006); Ginaldi et al., Leuk Res 22: 185-191 (1998)). CD52 экспрессируется на низком уровне в моноцитах, макрофагах и эозинофилах, с незначительной экспрессией на зрелых клетках - естественных киллерах (NK), нейтрофилах и гематологических стволовых клетках. Id. CD52 также продуцируется эпителиальными клетками в придатке яичка и семявыводящих протоках, и приобретается спермой при проходе через половые пути (Hale et al., 2001, выше; Domagala et al., Med Sci Monit 7: 325-331 (2001)). Точная биологическая функция CD52 остается неизвестной, однако некоторые данные свидетельствуют о том, что он может быть вовлечен в T-клеточную миграцию и ко-стимуляцию (Rowan et al., Int Immunol 7: 69-77 (1995); Masuyama et al., J Exp Med 189: 979-989 (1999); Watanabe et al., Clin Immunol 120: 247-259 (2006)).

Примером полипептидной последовательности человеческого антигена CD52 является:

MKRFLFLLLT ISLLVMVQIQ TGLSGQNDTS QTSSPSASSN ISGGIFLFFV ANAIIHLFCF S (SEQ ID NO: 1; регистрационный № NCBI NP_001794).

Зрелый человеческий антиген CD52 значительно короче, он состоит всего из 12 аминокислот (Xia et al., Eur J Immunol. 21(7): 1677-84 (1991)) и гликозилирован. Например, зрелый человеческий антиген CD52 может иметь следующую полипептидную последовательность: GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 2).

Терапия анти-CD52 антителом, охваченная данным изобретением, включает любые схемы лечения с использованием анти-CD52 антитела, в том числе антитела любого подходящего изотипа, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Полезные антитела также включают те, у которых константные/Fc-области модифицированы и связываются с Fc-рецептором на нейтрофилах и/или NK клетках с такой же или более высокой аффинностью, либо обладают иным способом улучшенными функциями антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Анти-CD52 антитела, полезные по данному изобретению, являются такими, которые связывают специфически CD52 и не связывают специфически молекулы, отличные от CD52. Специфическое связывание между анти-CD52 антителом и CD52 можно определять, например, путем измерения EC₅₀ связывания антитела с CD52⁺ клетками методом проточной цитометрии. На специфическое связывание указывает диапазон значений EC₅₀, например, 0,5-10 мкг/мл. Для клинического применения анти-CD52 антитела предпочтительно могут быть моноклональными, имеющими фармацевтически приемлемую чистоту. Антитела можно вводить любым подходящим способом, не обязательно с фармацевтически приемлемым носителем, в терапевтически эффективном количестве, например, в количестве, которое помогает пациенту достичь желаемого клинического результата.

Если подвергающийся лечению пациент является человеком, предпочтительно, чтобы анти-CD52 антитело связывалось специфически с CD52 человека. Чтобы свести к минимуму иммуногенность при повторном введении пациенту-человеку, также может оказаться предпочтительным, чтобы антитело было химеризовано (например, мышиное анти-CD52 антитело, константные домены которого заменены на таковые из человеческого антитела), гуманизировано (например, человеческое антитело, в котором области CDR заменены на таковые из антитела мыши против CD52 человека), или было полностью человеческим. Примером полезных антител является алемтузумаб (например, CAMPATH-1H^® и его варианты). Алемтузумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело IgG1, направленное против CD52 человека (hCD52), 28 кД гликозилированного гликозил-фосфатидилинозитол (GPI)-связанного белка клеточной поверхности (Hale et al., Tissue Antigens 35: 118-27 (1990); Hale et al., 2001, supra). Алемтузумаб в настоящее время одобрен в качестве терапии первого ряда против B-клеточного хронического лимфолейкоза и находится в фазе III клинических испытаний в качестве средства для лечения рассеянного склероза. Полезные антитела включают, без ограничения, те, которые конкурируют с алемтузумабом за связывание с hCD52 и/или связывают тот же или перекрывающийся эпитоп, что и алемтузумаб, или другие эпитопы на hCD52. Например, можно использовать гуманизированные антитела, описанные в международной патентной заявке PCT/US2010/034704.

Человеческие анти-hCD52 антитела могут получать специалисты в данной области, используя, например, технологию XENOMOUSE^® (Amgen, Thousand Oaks, CA). Химерные и гуманизированные анти-hCD52 антитела можно получать с помощью общепринятой технологии получения антител, например, из анти-hCD52 антитела крысы или анти-hCD52 антитела мыши.

При желании, анти-CD52 антитела, полезные по данному изобретению, могут содержать детектируемую метку, позволяющую, например, осуществлять контроль при лечении, диагностике или анализах. Подходящие детектируемые метки включают, например, радиоизотоп (например, такой как индий-111, технеций-99m или йод-131), позитронно-активные метки (например, фтор-19), парамагнитные ионы (например, гадолиний(III), марганец (II)), эпитопную метку (маркер), аффинную метку (например, биотин, авидин), спиновую метку, фермент, флуоресцентную группу или хемилюминисцентную группу. Если метки не используют, образование комплекса можно определять методами поверхностного плазмонного резонанса, ELISA, проточной цитометрии или другими подходящими методами. Анти-CD52 антитела, используемые по настоящему изобретению, можно конъюгировать с другим терапевтическим средством, таким как биологически активное соединение (например, цитокины и цитотоксические вещества). Анти-CD52 антитела, используемые по изобретению, также можно конъюгировать, посредством, например, химических реакций или генетических модификаций, с другими фрагментами (например, пегилирующими фрагментами), которые улучшают фармакокинетику, например, время полужизни антител. В некоторых вариантах осуществления анти-CD52 антитела, используемые по данному изобретению, можно связывать с подходящим цитокином путем, например, химической конъюгации или генетических модификаций (например, присоединяя кодирующую последовательность цитокина в рамке считывания к кодирующей последовательности антитела, тем самым создавая слитый белок антитело:цитокин).

Возрастающая инфильтрация FoxP3+ регуляторных T-клеток

Авторы изобретения открыли, что анти-CD52 антитела способствуют увеличению количества FoxP3⁺ регуляторных T-клеток по сравнению с другими T-клетками, включая повышенную инфильтрацию таких клеток в местные ткани, например, зоны воспаления или повреждения ткани. Регуляторные T-клетки (также известные как «Treg» или супрессорные T-клетки) представляют собой клетки, способные ингибировать пролиферацию и/или функцию других лимфоидных клеток при помощи контактно-зависимого или контактно-независимого (например, продукции цитокинов) механизмов. Описано несколько типов регуляторных T-клеток, включая γδ T-клетки, T-клетки - естественные киллеры (NKT), CD8⁺ T-клетки, CD4⁺ T-клетки и двойные отрицательные CD4^- CD8^- T-клетки. См., например, Bach et al., Immunol 3: 189-98 (2003). CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ регуляторные T-клетки называют «естественными» регуляторными T-клетками; они экспрессируют CD4, CD25 и член forkhead-семейства транскрипционный фактор FoxP3 (forkhead бокс p3).

Увеличение количества Treg может быть желательным для уменьшения симптомов излечиваемого аутоиммунного заболевания. Таким образом, можно вводить пациенту средство, стимулирующее FOXP3⁺ (например, CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺) регуляторные T-клетки. Средство может, например, активировать эти T-клетки, увеличивать популяцию этих клеток, мобилизовать и усиливать циркуляцию этих клеток и/или привлекать эти клетки к целевым зонам. Примерами таких средств являются рапамицин, активный или латентный TGF-β (например, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 и TGF-β5), IL-10, IL-4, IFN-α, витамин D3, дексаметазон и мофетила микофенолят (см., например, Barrat et al., J Exp Med 195: 603-616 (2002); Gregori et al., J Immunol 167: 1945-1953 (2001); Battaglia et al., Blood 105: 4743-4748 (2005); Battaglia et al., J Immunol 177: 8338-8347 (2010)). В некоторых вариантах осуществления изобретения увеличение количества Treg может происходить в одной или нескольких зонах воспаления (например, в крови, центральной нервной системе, сердце, печени, суставах, почках, коже, кишечнике или сосудистой системе).

Стимулирующее Treg средство можно вводить до, во время или после лечения анти-CD52 антителом. Анти-CD52 антитела, используемые по данному изобретению, предпочтительно удаляют T-эффекторные клетки и B-клетки, при этом предпочтительно сохраняя FoxP3⁺ Tregs (см., например, Hu et al., Immunology 128: 260-270 (2009)). Таким образом, терапевтическая схема, в которой используют как анти-CD52 антитело, так и стимулирующее Treg средство, будет значительно увеличивать эффективность лечения волчанки или лечения других аутоиммунных заболеваний путем восстановления равновесия в иммунной системе пациента.

Снижение уровня белка и/или альбумина в моче

У пациента с волчанкой может наблюдаться протеинурия или альбуминурия - избыток сывороточного белка или альбумина в моче. Повреждение почек при волчанке, что определяют по уровню белка или альбумина в моче, является одним из самых тяжелых нарушений и становится причиной по меньшей мере 50% смертных случаев. Способы лечения по данному изобретению (одним анти-CD52 антителом или сочетанием анти-CD52 антитела и стимулирующего Treg средства) могут снижать уровень белка и/или альбумина в моче пациента по меньшей мере на 25%, 50%, 75% или 90%, по сравнению с уровнем до лечения. В некоторых вариантах осуществления уровень белка в моче до введения анти-CD52 антитела по меньшей мере превышает или равен 500 мг/л/сутки (например, 1000 мг/л/сутки, 2000 мг/л/сутки или 3000 мг/л/сутки). После первичного лечения анти-CD52 антителом уровень белка в моче может быть снижен до менее чем 500 мг/л/сутки или менее чем 1000 мг/л/сутки.

Комбинированная терапия

В некоторых аспектах данного изобретения анти-CD52 антитело можно вводить пациенту с волчанкой совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами (например, иммунодепрессантом) в комбинированной терапии. Второе терапевтическое средство может представлять собой, например, кортикостероид, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство, модифицирующие заболевание противоревматические лекарственные средства (DMARD) (например, циклофосфамид или микофеноловую кислоту), иммунодепрессант (например, метотрексат и азатиоприн), молекулы, нацеленные на B или T-лимфоциты (например, антитело к CD20, например, ритуксимаб, также известный как Rituxan^®, анти-BLys антитело или анти-BAFF-R антитело). В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой, например, цитокин (например, IL-7), антитело против цитокинового рецептора или растворимый рецептор, которые изменяют, управляют и/или усиливают процесс восстановления, имеющий место после истощения лимфоцитов, опосредованного анти-CD52 антителом (см., например, Sportes et al., «Cytokine Therapies»: Ann. N. Y. Acad Sci 1182: 28-38 (2009)). Дополнительное терапевтическое средство(ва) можно вводить до, во время или после лечения анти-CD52 антителом.

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, которое им обычно придают рядовые специалисты в области, к которой относится изобретение. Типичные методы и материалы описаны ниже, хотя методы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, что описаны в данном документе, также можно использовать в практике или тестировании настоящего изобретения. Полное содержание всех публикаций и других литературных источников, упомянутых в данном документе, включено в данный документ посредством ссылок. В случае возникновения противоречий, настоящая спецификация, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Хотя в данном документе цитируется целый ряд документов, данное цитирование не является признанием того факта, что любой из этих документов составляет часть общедоступных сведений в данной области. Во всем тексте данной спецификации и формулы изобретения слово «включать» или такие его вариации, как «включает» или «включающий», следует понимать как обозначающие включение указанного числа или группы чисел, но не исключение любого другого числа или группы чисел. Материалы, методы и примеры являются исключительно иллюстративными и не должны быть ограничивающими.

Примеры

Следующие примеры призваны проиллюстрировать методы и материалы по настоящему изобретению. Соответствующие модификации и адаптации описанных условий и параметров, обычно встречающиеся в данной области и очевидные для специалиста в данной области, находятся в пределах сущности и объема изобретения.

Мышиная модель волчанки

Мыши NZB/NZWF1 представляют собой спонтанную модель волчанки. С возрастом у животных вырабатываются аутоантитела против различных клеточных антигенов, что, в конечном итоге, приводит к отложению иммунных комплексов в почках и развитию прогрессирующего летального заболевания почек (Peutz-Kootstra et al., J Lab Clin Med 137: 244-260 (2001)). В следующих примерах авторы изобретения использовали самок мышей NZB/NZWF1 для изучения влияния анти-CD52 антител на течение системной волчанки.

Анти-CD52 антитело

В примерах 1-6 использовали моноклональное антитело IgG2a крысы против CD52 мыши. Этот крысиный изотип не был оптимальным изотипом для эффекторной функции (например, связывания комплемента и антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности) у мышей. В примерах 7-8 использовали моноклональное антитело IgG2a мыши против CD52 мыши.

В примерах 1-6 авторы изобретения разделили мышей NZB/NZWF1 (возраст 15 недель, Jackson Labs) на четыре группы и лечили их различными тестируемыми препаратами (таблица 1). Циклофосфамид, алкилирующий агент на основе азотистого иприта, использовали в качестве положительного контроля в примерах 1-6. Циклофосфамид использовался для лечения различных видов рака и некоторых аутоиммунных заболеваний, включая волчанку.

Таблица 1 Экспериментальная группа № Тестируемые препараты Дозировка Количество животных на группу 1 PBS (контроль с растворителем) Внутрибрюшинная инъекция: 400 мкл 5 2 Нормальные IgG крысы (Sigma) Внутрибрюшинная инъекция: 400 мкл 350 мкг/мл маточного раствора (140 мкг/мышь или ~3 мг/кг) 10 3 Моноклональное антитело крысы против CD52 мыши Внутрибрюшинная инъекция: 400 мкл измеренного 350 мкг/мл* маточного раствора (140 мкг/мышь или ~3 мг/кг) 9 4 Циклофосфамид Внутрибрюшинная инъекция: 50 мг/кг в 200 мкл физиологического раствора еженедельно. Взвешивать мышей для корректировки дозы 5 * Анализ ELISA на IgG2a показал, что из общего содержания белка в маточном растворе только 184 мкг/мл состояли из IgG2a крысы, из чего следует, что эффективная доза может составлять всего лишь 1,7 мг/кг.

Временные точки в примерах 1-6 были следующими:

i) Начиная с 19-недельного возраста и затем через каждые четыре недели кровь собирали от отдельных мышей для оценки титров IgG антитела против двуспиральной ДНК (анти-дсДНК) и проводили 24-часовой сбор мочи в метаболических клетках для измерения степени протеинурии и альбуминурии;

ii) Лечение тестируемыми препаратами начинали в возрасте 31 недели, когда у животных начинали появляться значительные титры антител к дсДНК и/или повышенная протеинурия. Группе 2, получавшей нормальные IgG крысы, и группе 3, получавшей антитело крысы против CD52 мыши, делали в общей сложности по две соответствующих инъекции. Группе 4, получавшей циклофосфамид, делали еженедельные инъекции до окончания исследования;

iii) Перед первой инъекцией антител собирали кровь от группы 2 и группы 3 для исходного анализа методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) (окрашивание на CD3, CD19 положительные клетки, подсчет абсолютного числа лимфоцитов);

iv) Через два дня после первой инъекции антител группе 2 и группе 3 делали вторую инъекцию антител. Перед второй инъекцией собирали кровь от группы 2 и группы 3 для анализа методом проточной цитометрии (окрашивание на CD3, CD19 положительные клетки, подсчет абсолютных количеств). Также забирали селезенки от одной мыши из группы 2 и одной мыши из группы 3 для окрашивания методом проточной цитометрии.

На протяжении исследования любых животных в предсмертном состоянии умерщвляли и по возможности забирали одну почку. Исследование заканчивали, когда мыши достигали возраста 43 недель, и одну почку от каждого животного забирали для гистологического анализа.

Пример 1: Отсутствие истощения лимфоцитов у мышей NZB/NZWF1, получавших актитело крысы против CD52 мыши

Для определения того, приводит ли лечение моноклональным антителом крысы против CD52⁺ мыши к истощению CD52⁺ лимфоцитов, кровь собирали от отдельных мышей в исходном состоянии, до первой инъекции IgG крысы или антитела крысы против CD52 мыши, и через два дня, перед второй инъекцией антител. Образцы крови окрашивали и анализировали методом проточной цитометрии для получения абсолютных количеств CD3⁺ T-клеток и CD19⁺ B-клеток. Образцы по 50 мкл цельной крови блокировали 10% нормальной мышиной сывороткой и 0,05% азидом натрия в среде RPMI, а затем окрашивали антителами крысы против мышиных CD3-APC и антителами крысы против мышиных CD19-PE (BD Pharmingen, San Diego, CA). Лимфоциты анализировали на окрашивание с помощью системы FACSCalibur™ (Becton-Dickinson, San Diego, CA). Анализ данных проводили с помощью программы Cell Quest Pro (Becton-Dickinson). Результаты указывали на отсутствие существенного истощения B или T-лимфоцитов (фиг.1A и 1B).

Пример 2: Уровни протеинурии и альбуминурии

A. Уровни протеинурии

Уровни белка в моче отдельных мышей измеряли с помощью колориметрического анализа, разработанного для измерения концентрации суммарного белка, в соответствии с инструкциями производителя (Microprotein-PR, Sigma). Для расчета концентрации белка в исследуемых образцах использовали эталонный образец. Несмотря на отсутствие истощения лимфоцитов в момент измерения, лечение антителом крысы против CD52 мыши было успешным с точки зрения ингибирования прогрессирования заболевания почек, исходя из измеренных уровней суммарного белка в моче (фиг.2A-2E). На протяжении исследования у мышей, получавших антитело против мышиного CD52, наблюдали уровни белка в моче, сопоставимые с таковыми у мышей в группе положительного контроля, получавших циклофосфамид, тогда как у контрольных мышей, получавших IgG крысы, наблюдали уровни белка в моче, сопоставимые с таковыми у контрольных мышей, получавших растворитель (фиг.2A-2E). Только у 38% мышей, получавших антитело против CD52 мыши, и у 20% мышей, получавших циклофосфамид, возникала тяжелая протеинурия (>500 мг/дл/сутки), по сравнению с 67% мышей, получавших IgG крысы, и 60% мышей, получавших растворитель (фиг.2F).

B. Уровни альбуминурии

Уровни альбумина в моче оценивали при помощи набора для непрямого конкурентного анализа ELISA согласно инструкциям производителя (Albuwell-M, ExocelL Inc.). Концентрацию альбумина в образцах мочи выводили из стандартной кривой, полученной с известными концентрациями мышиного альбумина (фиг.3B). Также использовали полуколичественный метод «Albustix» (Roche Diagnostics) (фиг.3A), в котором мочу наносили на индикаторную фильтровальную бумагу, изменяющую цвет в зависимости от количества альбумина, присутствующего в моче, а затем присваивали соответствующий балл по шкале от 0 до 6. В соответствии с данными по уровням суммарного белка, лечение антителом против CD52 мыши также было эффективным для ингибирования развития альбуминурии у мышей NZB/NZWF1 (фиг.3A-3G). Уровни альбумина в моче у мышей, получавших анти-CD52 антитело, были ниже, чем уровни, наблюдаемые у мышей, получавших растворитель и IgG крысы. Однако подавление альбуминурии, наблюдаемое в этой группе, не было настолько велико, как в группе, получавшей циклофосфамид. Только у 50% мышей, получавших анти-CD52 антитело, развивалась значительная альбуминурия (>40 мг/дл/сутки), по сравнению с 80% у мышей, получавших растворитель, и 89% мышей, получавших IgG крысы, к концу исследования (фиг.3G).

Пример 3: Уровни антител к двуспиральной ДНК

Титры IgG антител к дсДНК в образцах сыворотки отдельных мышей измеряли методом ELISA. Мышиную дсДНК (The Jackson Laboratory, BarHarbor, ME) расщепляли нуклеазой S1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) для удаления любой осДНК, а затем использовали для нанесения в лунки 96-луночного планшета для ELISA (100 мкл/лунку 1 мкг/мл дсДНК) в течение ночи при 4°C. Планшеты предварительно обрабатывали 0,01% протамина сульфатом в воде для усиления адгезии ДНК. После покрытия лунок планшеты инкубировали с блокирующим буфером, содержащим 2,5% бычий сывороточный альбумин, в течение 1 часа при 37°C и промывали. Затем в лунки добавляли в двойном повторе по 100 мкл серийных 2-кратных разведений сыворотки и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Планшеты промывали и добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) антитела козы против IgG мыши (Pierce, Rockford, IL) для выявления антител, связанных с дсДНК (37°C в течение 1 часа). После промывания добавляли субстрат HRP, и оптическую плотность (OD) колориметрического продукта определяли при 490 нм с референсной длиной волны 650 нм на планшетном анализаторе с двойной длиной волны (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Титр антител определяли как обратную величину разведения сыворотки, приводящего к величине OD, большей или равной 0,1. Нормальную мышиную сыворотку использовали в качестве отрицательного контроля (титр ≤200, наименьшее тестируемое разведение), и объединенную сыворотку от старых мышей с волчанкой использовали в качестве положительного контроля (титр 25600). Лечение антителом крысы против CD52 мыши не оказывало заметного эффекта на развитие аутоантител против дсДНК (фиг.4). Титры антител мышей, получавших антитело против CD52 мыши, были сопоставимы с титрами мышей, получавших растворитель, и мышей, получавших IgG крысы. Только лечение циклофосфамидом эффективно уменьшало возрастание количества сывороточных антител к дсДНК (фиг.4).

Пример 4: Улучшение показателей выживаемости

Лечение антителом крысы против CD52 мыши хорошо переносилось мышами NZB/NZWF1. Сравнимые уровни выживаемости были получены при использовании двух доз антитела против CD52 мыши (выживаемость 75%) относительно еженедельных инъекций циклофосфамида (выживаемость 80%) (значение P=0,9218, антитело против CD52 мыши относительно циклофосфамида) (фиг.5). Выживаемость составляла только 20% у мышей, получавших контрольные IgG крысы (значение P=0,0401, антитело против CD52 мыши относительно контрольных IgG крысы) (фиг.5). Для сравнения, у мышей, получавших растворитель, наблюдали 60% выживаемость (фиг.5), из чего следует, что инъекция большого количества белка иммуноглобулина в контрольной группе с применением IgG крысы может усугублять болезнь, возможно из-за стресса, которому подвергаются почки, при том, что такое же количество антител против CD52 мыши давало терапевтический эффект.

Пример 5: Гистологическое исследование почек

Почки забирали в момент умерщвления животных, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, затем заливали в парафин. Делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали красителями гематоксилином и эозином (H&E), фосфовольфрамовым кислым гематоксилином (PTAH) и периодной кислотой - реактивом Шиффа (PAS). Несколько животных в группах отрицательного контроля (растворитель и IgG крысы) пришлось умертвить или были найдены мертвыми в процессе исследования. Вследствие этого, мало почек было доступно для анализа в конце исследования, что снизило статистическую достоверность.

Затем собранные почки подвергли исследованию. Не наблюдалось статистически достоверных различий в средних показателях степени тяжести гломерулопатии, интерстициального воспаления или количества белковых цилиндров между экспериментальными группами (фиг.6A-6C). Однако некоторые тенденции были очевидны. Лечение антителом против CD52 мыши и циклофосфамидом уменьшало средние показатели степени тяжести гломерулопатии по сравнению с группами, получавшими IgG крысы и растворитель (фиг.6A). Также наблюдали менее выраженное интерстициальное воспаление в группе, получавшей циклофосфамид (фиг.6B).

Пример 6: Повышенное количество FoxP3+ регуляторных T-клеток в почках

Срезы почек, полученные в примере 5, окрашивали на присутствие CD4⁺, CD8⁺ и FoxP3⁺ клеток, используя флуоресцентно меченные антитела. Для окрашивания положительных по CD4 и CD8 клеток замороженные срезы почек фиксировали ацетоном, инкубировали последовательно с блоками пероксидазы (Dako), авидина, биотина (Biocare) и белка (Dako), а затем с биотинилированными антителами крысы против CD4 мыши (клон L3T4; BD Pharmingen) или биотинилированными антителами козы против CD8 мыши (клон Ly-2; BD Pharmingen), стрептавидин-HRP и DAB (3-3'-диаминобензидин) для окрашивания в коричневый цвет положительных клеток. Для окрашивания положительных по FoxP3 клеток замороженные срезы почек фиксировали 10% нейтральным забуференным формалином и инкубировали последовательно с блоками пероксидазы и белка. Затем добавляли антитело крысы против FoxP3 мыши (eBioscience) с последующим добавлением Mach-2 HRP-конъюгированного антитела кролика против иммуноглобулинов крысы (Biocare) и DAB для окрашивания в коричневый цвет положительных клеток. Затем все срезы окрашивали также гематоксилином для визуализации клеток. Срезы оценивали вслепую по шкале баллов от 0 до 4 на относительное содержание положительных клеток. Лечение циклофосфамидом приводило к значительному уменьшению числа CD4⁺, CD8⁺ и FoxP3⁺ клеток, инфильтрирующих почки (фиг.7A-7C). Для сравнения, лечение анти-CD52 антителом не предотвращало инфильтрацию почек CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитами, но увеличивало присутствие клеток, положительных по FoxP3, маркеру регуляторных T-клеток (фиг.7A-7C).

Пример 7: Истощение лимфоцитов у мышей NZB/NZWF1, получавших моноклональное мышиное антитело против CD52 мыши

Проводили эксперимент по истощению для определения того, подвержены ли мыши с волчанкой истощению лимфоцитов в результате нацеливания на мышиный CD52 моноклонального мышиного IgG2a антитела против CD52 мыши, полученного в лаборатории авторов изобретения (клон W19). Мыши NZB/NZWF1 получали растворитель, 1 мг/кг, 5 мг/кг или 10 мг/кг моноклонального мышиного антитела против CD52 мыши. Через три дня после введения спленоциты и периферическую кровь собирали, и определяли степень истощения лимфоцитов методом проточной цитометрии. Наблюдали значительную степень истощения лимфоцитов как в крови, так и в селезенке при всех уровнях доз антитела. В крови (фиг.8A) наблюдали дозозависимое истощение во всех лимфоидных популяциях при дозах 5 и 10 мг/кг, приводящее к почти полному истощению всех типов клеток. Аналогичное дозозависимое истощение также наблюдали в селезенке (фиг.8B). Хотя в селезенке наблюдали значительное истощение как CD4⁺, так и CD8⁺ T-клеток, B-клетки, судя по всему, были истощены в меньшей степени при всех исследуемых уровнях доз.

Пример 8: Анализ эффективности антитела против CD52 мыши у самок мышей NZB/NZW

Моноклональное антитело против CD52 мыши, использованное в примере 7, дополнительно тестировали на его участие в развитии и/или прогрессировании заболевания в модели волчанки на мышах NZB/NZWF1. Сначала группы по десять мышей получали две инъекции контрольного антитела или моноклонального мышиного антитела против CD52 мыши в дозе 10 мг/кг за одну неделю до развития явных признаков заболевания в возрасте примерно 21 недели. Затем отдельные группы по десять мышей получали две инъекции контрольного антитела или моноклонального мышиного антитела против CD52 мыши в дозе 10 мг/кг через неделю в процессе протекания заболевания в возрасте примерно 32 недели. Группа положительного контроля получала циклофосфамид в дозе 50 мг/кг еженедельно, начиная примерно с возраста 21 недели. Авторы изобретения изучали следующие параметры: 1) истощение лимфоцитов, определяемое методом проточной цитометрии; 2) появление аутоантител к дсДНК, определяемое методом ELISA; 3) протеинурию и 4) гистологический анализ почек; и дополнительно определяли степень, до которой такое нацеливание на CD52 уменьшает поражение почек.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ увеличения количества FoxP3⁺ регуляторных Т-клеток у пациента с волчанкой, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества моноклонального анти-CD52 антитела. Также предложено применение моноклонального анти-CD52 антитела для изготовления лекарственного средства для увеличения количества FoxP3⁺ регуляторных Т-клеток, а также набор, включающий указанное анти-CD52 антитело и второе средство, стимулирующее FoxP3⁺ регуляторные Т-клетки. Изобретение позволяет облегчить симптомы волчанки у пациента. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 25 ил., 1 табл., 8 пр.

1. Способ увеличения количества FoxP3⁺ регуляторных Т-клеток у пациента с волчанкой, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества моноклонального анти-CD52 антитела.

2. Способ по п.1, в котором моноклональное анти-CD52 антитело лечит волчанку.

3. Способ по п.1, в котором моноклональное анти-CD52 антитело снижает уровень белка в моче, или альбумина в моче, или и того и другого у пациента.

4. Способ по п.1, дополнительно включающий введение пациенту средства, стимулирующего указанные регуляторные Т-клетки.

5. Способ по п.4, в котором средство представляет собой рапамицин, TGF-β, IL-10, IL-4, IFN-α, витамин D3, дексаметазон или мофетила микофенолят.

6. Способ по п.5, в котором TGF-β является активной или латентной формой любого из TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 и TGF-β5.

7. Способ по п.1, в котором количество указанных регуляторных Т-клеток увеличено по меньшей мере в одном участке воспаления.

8. Способ по п.7, в котором участок воспаления представляет собой кровь, центральную нервную систему (ЦНС), сердце, печень, сустав, почки, легкие, кожу, кишечник или сосудистую систему.

9. Способ по п.1, в котором моноклональное анти-CD52 антитело существенно не истощают лимфоциты.

10. Способ по п.1, в котором моноклональное анти-CD52 антитело вводят как средство монотерапии.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором пациент является человеком и моноклональное анти-CD52 антитело является гуманизированным или человеческим антителом против CD52 человека.

12. Способ по п.11, в котором моноклональное анти-CD52 антитело представляет собой алемтузумаб.

13. Применение моноклонального анти-CD52 антитела для изготовления лекарственного средства для увеличения количества FoxP3⁺ регуляторных Т-клеток у пациента с волчанкой.

14. Применение по п.13, в котором моноклональное анти-CD52 антитело лечит волчанку.

15. Применение по п.13, в котором моноклональное анти-CD52 антитело снижает уровень белка в моче, или альбумина в моче, или и того и другого у пациента.

16. Применение по п.13, в котором указанному пациенту вводят средство, стимулирующее указанные регуляторные Т-клетки.

17. Применение по п.16, в котором указанное средство представляет собой рапамицин, TGF-β, IL-10, IL-4, IFN-α, витамин D3, дексаметазон или мофетила микофенолят.

18. Применение по п.17, в котором TGF-β является активной или латентной формой любого из TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 и TGF-β5.

19. Применение по п.13, в котором увеличение количества указанных регуляторных Т-клеток происходит по меньшей мере в одной зоне воспаления.

20. Применение по п.19, в котором зона воспаления представляет собой кровь, центральную нервную систему (ЦНС), сердце, печень, сустав, почки, легкое, кожу, кишечник или сосудистую систему.

21. Применение по п.13, в котором моноклональное анти-CD52 антитело существенно не истощают лимфоциты.

22. Применение по п.13, в котором моноклональное анти-CD52 антитело вводят как средство монотерапии.

23. Применение по любому из пп.13-22, в котором пациент является человеком и моноклональное анти-CD52 антитело является гуманизированным или человеческим антителом против CD52 человека.

24. Применение по п.23, в котором моноклональное анти-CD52 антитело представляет собой алемтузумаб.

25. Набор для увеличения количества FoxP3⁺ регуляторных Т-клеток у пациента с волчанкой, включающий моноклональное анти-CD52 антитело и средство, стимулирующее FoxP3⁺ регуляторные Т-клетки.

26. Набор по п.25, в котором указанное средство представляет собой рапамицин, TGF-β, IL-10, IL-4, IFN-α, витамин D3, дексаметазон или мофетила микофенолят.

27. Набор по п.26, в котором TGF-β является активной или латентной формой любого из TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 и TGF-β5.

28. Набор по любому из пп.25-27, в котором анти-CD52 антитело является гуманизированным или человеческим антителом против CD52 человека.

29. Набор по п.28, в котором моноклональное анти-CD52 антитело представляет собой алемтузумаб.