ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERITIDIS VAR.ISSATSCHENKO 32/3 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРИМАНКИ ПРОТИВ МЫШЕВИДНЫХ ГРЫЗУНОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к микробиологическим средствам борьбы с вредными мышевидными грызунами.

Грызуны причиняют огромный вред на посевах, в закрытом грунте, на складах и в хранилищах, на фермах. Кроме того, грызуны служат источником и переносчиком многих инфекций человека и сельскохозяйственных животных, в том числе таких особо опасных, как: чума, туляремия, бруцеллез, холера. Вредоносность грызунов особенно ощутима в годы массового увеличения численности. Особенно интенсивно размножаются мыши и полевки в южных регионах нашей страны. Иногда численность вида может увеличиваться в 50-500 раз. Потери составляют 28% потенциального урожая. По видовому составу и численности грызуны - большая группа животных из класса млекопитающих. У нас в стране их насчитывается около 150 видов. Такие особенности грызунов - как широкое распространение, потенциальная плодовитость и многообразная вредоносность - вынуждают вести с ними постоянную борьбу.

Известен ряд химических пестицидов (родентицидов) для контроля численности мышевидных грызунов. Родентициды применяются для защиты сельскохозяйственных растений, запасов зерна, в ветеринарии и здравоохранении.

Эти препараты (Фумарин, Бромадиолон, Этилфенацин, Брометалин, Стрихнин, Фосфид цинка и др.) могут представлять серьезную опасность для теплокровных животных и человека. К возможности применения тех или иных токсикантов против мышевидных грызунов необходимо подходить с особой осторожностью (Яковлев А.А., Бабич Н.В. Родентициды. СПб, 2010, 63 с.).

К числу эффективных средств ограничения численности мышевидных грызунов относится биологический метод, основанный на применении бактериальных родентопатогенных препаратов.

В нашей стране разработаны две формы препарата с патогенными свойствами против массовых и вредоносных мышевидных грызунов (мышь-малютка, домовая мышь, курганчиковая мышь, серая полевка, водяная полевка, степная пеструшка и ряд других) (Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М., ВО. Агропромиздат, 1989, 176 с.) - зерновой и аминокостный бактороденцид, которые производятся на питательных средах гранулированной структуры (соответственно зерно и мелкие, не более 2 мм в диаметре, костные опилки). Зерновой бактороденцид в отличие от аминокостного применяется без приманочных продуктов, так как сам является хорошей приманкой и охотно поедается грызунами.

Широко известный и рекомендованный для применения в различных регионах РФ биопрепарат Бактороденцид выпускается на основе штамма экологически безопасной бактерии Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1 (Кандыбин Н.В., Дородных Ю.Л. Бактороденцид - достойная альтернатива химическим родентицидам. Журнал «Защита и карантин растений», апрель 2007 г., с.54-56; Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ (Минсельхоз России, Москва, 2008, с.81).

Штамм Salmonella enteritidis var.Issatschenko 29/1 выделен из погадок птиц, хранится с 07.02.1986 г. в коллекции ВНИИСХМ Россельхозакадемии (справка о депонировании прилагается) и выбран в качестве прототипа.

Диссоциационный индекс штамма 5%. Продуктивность штамма, определенная общепринятым методом серийных разведений, составляет 600-710 млн бактерий/мл культуральной жидкости. Вирулентность для белых мышей лабораторной популяции (ЛД₅₀) - 315500 микробных клеток - доза, вызывающая 50% гибели мышей.

Недостатком штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1 и биопрепарата на его основе является недостаточная эффективность.

Задачей заявляемого изобретения является получение более эффективного штамма на основе экологически безопасной бактерии Salmonella enteritidis var. Issatschenko в качестве средства против наиболее массовых видов вредоносных для сельского хозяйства мышевидных грызунов.

Задача решается тем, что в качестве средства для получения препарата - биологической приманки против наиболее массовых видов вредоносных для сельского хозяйства мышевидных грызунов - используют штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3.

Штамм выделен из погадок хищных птиц путем проведения многоступенчатой аналитической селекции с отбором варианта с высокими производственными показателями: высокой продуктивностью, низким диссоциационным индексом и высокой вирулентностью для мышей.

Штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 депонирован 26.08.2011 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии в группе неспоровых микроорганизмов под регистрационным номером RCAM 00149, что подтверждается справкой о депонировании от 4.10.2011 г. (справка прилагается).

Штамм обладает выраженными патогенными свойствами против массовых и вредоносных мышевидных грызунов.

Штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки

Мелкие, не образующие спор палочки (1-1,5 мкм), подвижные, отрицательно окрашиваются по Граму.

Культуральные признаки

Растет в аэробных условиях при температуре 10-45°С, оптимальная температура роста 37°С, при 60°С бактерии погибают через 2 часа, при 70°С - через 40 мин, при 80°С - через 20 мин. Оптимальный рН 7,2-7,4. На мясопептонном бульоне (МПБ) образует равномерное помутнение, на рыбном агаре (PA) - круглые, с ровными краями, прозрачные колонии 1,0-3,0 мм в диаметре. На средах Эндо и Плоскирева - круглые бесцветные, на висмут-сульфитном агаре - зеленовато-черные блестящие колонии, окрашивающие среду под колониями в черный цвет.

Биохимические признаки

Не разжижает желатину, молоко не свертывает, индола не образует, выделяет сероводород.

Отношение к углеводам: разлагает глюкозу, мальтозу, ксилозу, галактозу, арабинозу, трегалозу, дульцит, маннит, сорбит; не разлагает сахарозу, лактозу, инозит, салицин, адонит, не утилизирует глицерин в бульоне Штерна.

В гипертоническом растворе хлористого натрия клетки подвергаются плазмолизису. В физиологическом растворе (0,85%) хлористого натрия не наблюдается плазмолизиса клеток.

Бактерии чувствительны к изменению осмотического состояния окружающей среды. Обладают внутриклеточным давлением 3-6 атм.

Отношение к источникам азота

Не расщепляет мочевину, восстанавливает нитраты в нитриты, может использовать азот из аминокислот. Образует каталазу, кислую и щелочную фосфатазу, эндолипазу и эндопротеиназу.

Антибиотических веществ и пигментов не образует.

Серологические свойства

По схеме Кауфмана-Уайта относится к серологической группе Д, имеет соматические O-антигены (рецепторы 1,9,12) и жгутиковые Н-антигены (рецепторы g и m).

Хранение культуры

Культура хранится на среде Мережковского (водная суспензия 10%-ного вареного белка куриного яйца) при +4°С, пересевы проводят каждые 1,5-2 месяца; либо методом криоконсервирования в лиофильно-высушенном состоянии в запаянных ампулах.

Штамм 32/3 характеризуется широким спектром действия на мышевидных грызунов. Экспериментально было установлено, что многие виды грызунов высоковосприимчивы к бактерии этого штамма, в т.ч.: домовая мышь, курганчиковая мышь, мышь-малютка, обыкновенная полевка, общественная полевка, полевка Брандта, малоазийская кустарниковая полевка, темная полевка, стадная полевка, степная пеструшка, рыжая лесная полевка, водяная полевка, серый хомячок, обыкновенная слепушонка, а также серая крыса.

Были проведены лабораторные опыты по определению производственных показателей заявляемого штамма Salmonella enter itidis var. Issatschenko 32/3 и штамма-прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1: диссоциационного и токсического индексов, продуктивности и вирулентности.

Диссоциационный и токсический индексы штамма определяли с помощью реакции агглютинации с 0,1%-ным водным раствором трипафлавина.

Для определения диссоциационного индекса на РА высевали 10-суточную бульонную культуру на РА в чашки Петри, после суточного роста проводили агглютинацию изолированных колоний (100 шт.) и подсчитывали число колоний, агглютинирующих с раствором трипафлавина, т.е. определяли процент колоний в R-форме.

Для определения токсического индекса 1 - суточную бульонную культуру высевали на РА в чашки Петри, после суточного роста проводили агглютинацию изолированных колоний (100 штук) и подсчитывали число колоний, не агглютинирующих с раствором трипафлавина, т.е. определяли процент колоний в S-форме.

Для определения продуктивности штамм инкубировали на РБ в термостате. Через 24 часа роста при температуре 37°С определяли количество микробных клеток в 1 мл культуральной жидкости чашечным методом.

Вирулентность определяли по ЛД₅₀ для белых мышей.

Штамм выращивали на рыбном бульоне (РБ), определяли титр культуральной жидкости и готовили следующие разведения, содержащиеся в 1 мл: 50 млн, 5 млн, 500000, 50000, 5000 бактерий. В опытах использовали белых мышей весом 16-18 г, на каждый вариант опыта брали по 6 грызунов. Грызунов заражали per os (кусочек белого хлеба пропитывали 1 мл бульонной культуры соответствующего разведения). Гибель мышей учитывали в течение 14 суток.

ЛД₅₀ высчитывали по формуле Кербера (см., например, журнал «Актуальные вопросы ветеринарной медицины»,2005 г., УДК 619:616.33-002, статья С.А. Донкова (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) «Применение формул электронных таблиц MS. EXSEL для обработки данных при изучении патогенных свойств микроорганизмов»):

lg Ld₅₀=lgD_N-δ(∑L-0,5),

где D_N - величина дозы максимальная;

δ - логарифм кратности разведений;

L - отношение числа животных, погибших от введения данной дозы, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

∑L - сумма значений L, найденных для всех испытаний доз.

Результаты полученных производственных показателей штаммов бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko - заявляемого (32/3) и прототипа (29/1) представлены в таблице 1.

Таблица 1 Сравнительная оценка свойств штаммов бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko Штамм Salmonella enteritidis var. Issatschenko Диссоциационный индекс, % Токсический индекс, % Продуктивность (титр бактерий в КЖ), млн/мл Вирулентность ЛД₅₀, микробные клетки 29/1 5,0 98,0 600-710 315500 32/3 2,0 100,0 900-1000 175000

Как видно из таблицы 1, заявляемый штамм бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 более устойчив к диссоциации, т.к. его диссоциационный индекс в 2,5 раза меньше, чем у штамма 29/1, токсический индекс - выше, продуктивность - выше в 1,5 раза, а вирулентность выше, чем у штамма-прототипа, в 1,8 раза. Это позволяет сделать вывод о более высокой эффективности заявляемого штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 по сравнению с прототипом - штаммом бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1.

Пример получения препарата - биоприманки для мышевидных грызунов на основе штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3учения биопрепарата заключается в последовательном размножении бактерий сначала на жидкой среде, затем на зерновой основе.

Приготовление среды Мережковского (жидкая)

Доброкачественное куриное яйцо варят вкрутую (17 мин после закипания воды), очищают от скорлупы, отделяют белок от желтка, взвешивают белок, измельчают, переносят в стерильную колбу, добавляют воду в соотношении 1:10, доводят рН до 7,2-7,4 и стерилизуют при 1атм 5 мин. Подготовленную питательную среду разливают по пробиркам (5-6 см³ в пробирке), стерилизуют при 1 атм 20 мин и доводят рН до 7,0-7,2. Среда Мережковского используется для хранения культуры штамма при температуре при +4°С.

Приготовление рыбного бульона (РБ)

15 г готового сухого питательного бульона (гидролизат кильки 10,05 г; натрия хлорид 4,95 г) вносят в 1 л дистиллированной воды, тщательно встряхивают, кипятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 10 мл в стерильные пробирки или по 400 мл в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, стерилизуют при 1атм 20 мин. Доводят рН после стерилизации до 7,0-7,2.

Получение культуры 1-й генерации

Стерильную жидкую питательную среду (рыбный бульон) засевают культурой, хранящейся в пробирках на среде Мережковского из расчета 1 мл культуры на 250 мл бульона. Культуру штамма выращивают в термостате при 37°С в течение 24 часов. Титр культуральной жидкости (КЖ) определяют общепринятым методом серийных разведений с последующим высевом на РА. Титр КЖ 1-й генерации должен быть не меньше 200 млн кл/мл.

Получение культуры 2-й генерации

Для получения более высокого титра культуру штамма 1-й генерации пересевают еще раз на жидкий питательный бульон из расчета 1-2% от объема среды. Колбы с засеянной культурой помещают в термостат с температурой 37°С. Через 24 часа инкубации определяют титр культуральной жидкости (КЖ). Титр КЖ 2-й генерации должен быть не меньше 500 млн кл/мл.

Получение биопрепарата на зерне

Сначала готовят зерновую питательную среду. Сухое зерно (пшеница, овес, ячмень) расфасовывают по 800 г в 3-литровые стеклянные банки, 2-3 раза зерно промывают водопроводной водой, затем заливают водой и оставляют на сутки при комнатной температуре. После замачивания остатки воды сливают, а зерно еще раз промывают. Затем в банки с зерном наливают воду (10-15% к массе зерна) и для подщелачивания зерна до рН 7,5-7,6 добавляют в каждую банку по 4 мл 20%-ного раствора Na₂CO₃. Банки закрывают плотной бумагой, завязывают шпагатом, стерилизуют при 1 атм дробно по 1 часу с суточным перерывом два дня подряд. Перед и после каждой стерилизации банки тщательно встряхивают для равномерного увлажнения зерна.

Затем культурой 2-й генерации засевают стерильную зерновую питательную среду из расчета 1:2, выдерживают в термостате при 37°С в течение 2 суток, после чего препарат - биоприманка для мышевидных грызунов - готов к применению.

Таким образом, препарат - биоприманка для мышевидных грызунов, полученный на основе заявляемого штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 описанным способом, как и известный Бактороденцид зерновой на основе штамма - прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1, представляет собой родентицид и состоит из двух компонентов - действующего вещества (бактерии Salmonella enteritidis var. Issatschenko) и зерна (пшеницы, овса, ячменя). Препарат получается в форме сыпучей массы распаренного зерна, содержащего в себе (внутри и на поверхности) бактерии Исаченко.

Были проведены опыты по определению эффективности препарата - биоприманки для мышевидных грызунов, полученной описанным выше способом на основе заявляемого штамма Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 в хозяйствах Ленинградской области: в хранилищах зерна, овощей, картофеля и в пленочных теплицах с томатами. Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали известный препарат Бактороденцид на основе штамма-прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1.

Учет численности грызунов проводили с помощью ловушек до обработки и на 10-й, 20-й день после обработки. Ловушки располагаются на расстоянии друг от друга 0,5-1 м на площади заданного размера. Контролем служил участок, который находился на расстоянии 300 м от обработанных участков.

Испытуемый препарат раскладывали в хранилищах и теплице по 15-20 г вдоль стены, в углах постройки, т.е. в местах наибольшего их появления. В течение 20 дней вели учет погибших грызунов.

Техническую эффективность биопрепаратов подсчитывали по следующей формуле («Методические указания к Государственным испытаниям родентицидов в сельском хозяйстве», М., 1976 г.):

Э=100×((А-Б)/А-(а-б)/а),

где Э - эффективность, %;

А - количество грызунов на участке до обработки;

Б - количество грызунов на участке после обработки;

а - количество грызунов на контрольном участке до обработки;

б - количество грызунов на контрольном участке после обработки. Результаты испытаний препаратов представлены в таблице 2.

Таблица 2 Эффективность биопрепаратов на основе штаммов бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko Название объекта проведения опыта Площадь обрабатываемой территории (м²) Грызуны Эффективность препарата, % Штамм 32/3 Штамм 29/1 Зернохранилище 3000 Серая крыса 90,5 76,5 Овощехранилище 2000
-//- Серая крыса
Домовая мышь 91,6 97,2 74,6 78,8 Картофелехранилище 2000
-//- Серая крыса
Домовая мышь 92,1 97,2 75,8 79,0 Пленочные теплицы с томатами 1300
-//- Домовая мышь Обыкновенная полевка 97,2 95,9 79,2 75,2

Приведенные в таблице 2 данные подтверждают более высокую эффективность препарата - биоприманки на основе заявляемого штамма Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 по сравнению с препаратом на основе штамма -прототипа Salmonella enteritidis var. Issatschenko 29/1 - по отношению к серой крысе в среднем примерно на 21%, а по отношению к домовой мыши - на 23%.

Для летального эффекта мыши или полевки достаточно съесть 2 зерна, на котором был приготовлен препарат.

Патогенность бактерий Исаченко для полезных животных и человека изучалась многими учеными (Исаченко, Мережковский, Голубева, Прохоров и др.). В опытах были использованы: рогатый скот, овцы, лошади, куры, утки, цесарки, дикие хищники (хорь, ласка, горностай). Все авторы пришли к заключению, что бактерии Исаченко безопасны для полезных животных и обладают избирательной патогенностью.

Омельянец Т.Г. отмечает, что по данным эпидемиологических исследований, широкое использование Salmonella enteritidis var. Issatschenko в сельском хозяйстве для борьбы с грызунами не оказывает влияния на эпидемический процесс сальмонеллезной инфекции (Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук «Гигиенические аспекты окружающей среды в связи с применением в сельском хозяйстве микробных препаратов на основе неспорообразующих микроорганизмов», М., 1982, ВНИИ ГИТОКС).

В связи со строгой селективностью бактерий Исаченко для мышевидных грызунов, сохранность их вне организма грызунов непродолжительна.

За более чем 100-летний период применения бактерий Исаченко в нашей стране не было случаев выявления инфекции у людей и полезных животных, связанных с бактериальной дератизацией.(Министерство здравоохранения РФ научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП), г. Серпухов, 2001 г., 8 с.). Но при применении препарата необходимо работать в спецодежде, не принимать во время работы пищу, не пить, не курить, после работы обязательно мыть руки с мылом.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам борьбы с вредными мышевидными грызунами. Штамм бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM 00149, обладает выраженными патогенными свойствами против мышевидных грызунов.Эффективность биоприманки, полученной на основе штамма бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko 32/3 и зерна, в зерно-овощехранилищах и теплицах составила по отношению к серой крысе и мыши домовой более 90%. 1 табл.

Штамм бактерий Salmonella enteritidis var. Issatschenko №32/3, депонированный в коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM 00149 в качестве средства для получения биологической приманки против мышевидных грызунов.