СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА Rhodococcus rhodochrous МЗЗ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО НИТРИЛГИДРАТАЗУ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12N1/38 

Описание патента на изобретение RU2340667C2

Настоящее изобретение относится к биотехнологическому способу культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33, продуцирующего нитрилгидратазу, и к среде культивирования, используемой в этом способе, для повышения выхода биомассы, проявляющей высокую нитрилгидратазную активность.

Развитие промышленных биотехнологических способов производства химических веществ приводит к большой заинтересованности в микроорганизмах со специальными ферментами, которые могут использоваться для выбранных биокаталитических реакций. Примером этого является способ биотехнологического производства, связанный с синтезом амидов, способ, который основан на способности некоторых микроорганизмов синтезировать нитрилгидратазу, фермент, который катализирует превращение нитритов органических кислот в соответствующие амиды. В этом отношении бактериальные штаммы, которые могут трансформировать акрилонитрил в акриламид, представляют исключительный интерес.

Способ культивирования соответствующих микроорганизмов играет важную роль в производстве каталитически активной биомассы или биокатализатора. Обычно два дополнительных приема применимы для повышения выхода ферментативной активности на единицу объема культурального бульона (общая активность в Ед/мл):

1. активация синтеза фермента (бактериальной) клеткой или, другими словами, повышение удельной ферментативной активности (Ед/мг сухой биомассы)

2. повышение выхода активных клеток (активной биомассы) на единицу объема культурального бульона.

В Британском Патенте 2087926 А и в цитированной в нем литературе описан, наряду с другими, способ культивирования штамма Corynebacterium N-774 (регистрационный номер FERM 4446 в Fermentation Research Institute). Штамм, который проявляет нитрилгидратазную активность, культивируется в питательной среде с минеральными веществами, содержащей водорастворимые соединения железа в концентрациях, как минимум 0,2 мг/л вместе с 1 мас.% казеинового гидролизата (казаминовые кислоты). Недостатками этого способа являются высокая стоимость казеиновых гидролизатов и полученная низкая нитрилгидратазная активность:

Специфическая активность = 53,3 Ед/мг, сухая биомасса = 5,66 мг/мл, общая активность = 301,7 Ед/мл.

Известно, что нитрилы и амиды органических кислот, в особенности пропионовой и изомасляной кислот, вызывают индукцию нитрилгидратазной активности. В этом отношении можно сделать вывод на основании данных Патента США № 4555487, что добавление таких веществ, которые известны в качестве фермент-индуцирующих агентов или индукторов, к культуральной среде штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM BP-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188), делает возможным получение биомассы (5,36 г/л сухой биомассы) с удельной активностью 62,65 Ед/мг и общей активностью 335,8 Ед/мл.

Недостатки, присущие этому способу, связаны с использованием дорогостоящих индукторов и полученной низкой нитрилгидратазной активностью клеток.

Культуральная среда, описанная в ЕР 0115781 для инкубации штамма Pseudomonas chlororaphis В 23 (FERM BP-187) и штамма Pseudomonas sp. PS 1 (FERM BP-188), содержит не только индукторы, описанные, например, в патенте США № 4555487, но также одну или более α-аминокислот в качестве повышающих ферментативную активность агентов. Например, α-аминокислоты, такие как дицистеин, цистеин, аланин, валин, метионин и др., используются в концентрациях в диапазоне от 0,1 до 10,0 г/л. Тем не менее, удельная активность биомассы, полученной этим путем, не превышала 105,7 Ед/мг и общая активность не превышала 428,1 Ед/мл.

Более высокая нитрилгидратазная активность была достигнута при инкубации штамма Rhodococcus rhodochrous М33, как это описано в Патенте Германии 4480132. Эта публикация свидетельствует о том, что при культивировании штамма в синтетической питательной среде, содержащей глюкозу (концентрация 5 г/л), вполне возможно получить клетки, проявляющие удельную активность вплоть до 200 Ед/мг и общую активность вплоть до 360 Ед/мл. Важным преимуществом предложенного способа является простота питательной среды, которая не содержит каких-либо дорогих компонентов. Впрочем, повышение концентрации глюкозы до 20 г/л приводило к повышению общей активности до значения, не превышающего 1368 Ед/мл.

Способ, отвечающий промышленным требованиям, описан в Европейском Патенте 0362829 для культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478). В питательной среде, которая содержит недорогой индуктор (мочевина (концентрация 15 г/л) и соединения двухвалентного кобальта), предложенный способ культивирования делает возможным получить клетки, проявляющие удельную активность 578 Ед/мг. Для повышения выхода клеток (выхода биомассы) в питательную среду добавляются пептон и дрожжевой экстракт. Тем не менее, достигнутая общая активность не превышает 2480 Ед/мл, потому что выход биомассы всего лишь 4,3 г/л. Масштабирование процесса культивирования до производственных условий повышало выход клеток до 28 г/л, что сопровождалось снижением удельной нитрилгидратазной активности до 76 Ед/мг и уменьшением общей активности до 2100 Ед/мл (Yamada H., Kobayashi M., "Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide", Biosci. Biotech. Biochem., 60(9), 1391-1400, 1996).

В литературе описан другой способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33 (Kim B-Y., Kim J-C., Lee H-H., Hyun H-H., "Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rhodochrous М33", Biotechnol. Bioprocess Eng., 6: 11-17, 2001). Этод способ включает в себя ферментацию с подпиткой, с ограничением глюкозы в 5-литровом ферментере на полностью синтетической культуральной среде, состоящей из KH2PO4, K2HPO4, FeSO4x7H2O, EDTA-2Na, MgSO4x7H2O, NaCl, CoCl2x6H2O, мочевины и глюкозы. Путем постоянного регулирования подачи раствора глюкозы концентрации 40% и трех периодических добавок CoCl2x6H2O (0,01 г/л) к раствору глюкозы были достигнуты выход клеток 24 г/л и удельная нитрилгидратазная активность 120 Ед/мг. Тем не менее, общая активность, достигнутая после относительно длительного времени ферментации, приблизительно 115 часов, не превышала 2880 Ед/мл.

Таким образом, все еще существует потребность в биотехнологических способах культивирования штаммов, проявляющих нитрилгидратазную активность, которые обеспечивают возможность повышения промышленного выхода биомассы, проявляющей высокую нитрилгидратазную активность.

Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление такого способа.

Неожиданно было найдено, что способ культивирования Rhodococcus rhodochrous, продуцирующего нитрилгидратазу, например, штамма М33, который депонирован под номером DSM 14230 в DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH), Marschroder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany, становится объектом изобретения, когда культивирование осуществляется с использованием культуральной среды на основе от 12 до 60 мМ фосфатного буфера, соответствующего потребностям клеток в фосфоре и поддерживающего рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования и к которому дозируется уксусная кислота в качестве нового источника углерода после потребления предусмотренной в начальной стадии глюкозы.

В соответствии с данным изобретением применяется культуральная среда, которая соответствует потребностям клеток в фосфоре и делает возможным поддержание рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования. Предпочтительно, такая культуральная среда содержит кукурузный экстракт в качестве дополнительного ростового фактора.

В способе данного изобретения особенно предпочтительным является использование кукурузного экстракта в качестве дополнительного ростового фактора в культуральной среде, путем добавления его в форме, например, кукурузного сиропа в концентрации, например, от 1 до 10 г/л. В качестве кукурузного экстракта может быть любая жидкость при замочке кукурузы, которая содержит компоненты кукурузных зерен, которые перешли в раствор в концентрированной форме в результате стандартного процесса замачивания. В соответствии с данным изобретением предпочтительно использовать жидкости от замачивания кукурузы, поставляемые под наименованием Cerestar 15840 фирмой Cerestar Deutschland GmbH, Krefeld.

Культуральная среда (сокращенно обозначаемая в дальнейшем в данном документе как SI), которая может применяться в способе данного изобретения, предпочтительно имеет следующий состав (в г/л):

a) 7,9 г/л Na2HPO4x12H2O

b) 1,8 г/л KH2PO4

c) от 0,02 до 0,04 г/л CoCl2x6H2O

d) 1,0 г/л MgSO4x7H2O

e) от 0 до 10 г/л кукурузного экстракта

f) от 20 до 90 г/л глюкозы

g) от 4 до 20 г/л мочевины.

В частности, применяется такая культуральная питательная среда, к которой добавлен кукурузный экстракт в концентрации от 1 до 10 г/л, предпочтительно, от 2 до 8 г/л и еще более предпочтительно, от 2 до 6 г/л. Наиболее предпочтительным является применение в культуральной питательной среде кукурузного экстракта в концентрации 4 г/л.

Основой культуральной питательной среды является 12-60 мМ фосфатный буфер, соответствующий потребностям клеток в фосфоре и обеспечивающий уверенность, что может быть поддержано значение рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования; глюкоза и уксусная кислота используются в качестве источника углерода, и уксусная кислота используется в качестве нового дополнительного источника углерода помимо глюкозы.

Особо предпочтительным в способе данного изобретения является использование 35,3 мМ фосфатного буфера.

В успешном варианте культуральная среда содержит от 20 до 90 г/л, предпочтительно от 20 до 60 г/л и более предпочтительно от 20 до 40 г/л глюкозы в качестве источника углерода, особенно при культивировании во встряхиваемых колбах. Помимо глюкозы уксусная кислота может использоваться в качестве источника углерода, источник углерода предпочтительно добавлять по двухэтапной схеме, особенно при культивировании в ферментерах в лабораторном или промышленном масштабе.

Первая стадия процесса характеризуется инициацией и интенсификацией клеточного роста Rhodococcus rhodochrous М33 на основе первого источника углерода, исходно присутствующего в среде, предпочтительно 20 г/л глюкозы. Ферментация, сопровождающаяся потреблением глюкозы, продолжается на второй стадии, которая известна как процесс с подпиткой, в котором в качестве источника углерода используется уксусная кислота. Не столь дорогостоящая уксусная кислота может заменить пригодную для культивирования глюкозу, и вышеупомянутая уксусная кислота обеспечивает высокую удельную нитрилгидратазную активность и высокую общую активность.

Уксусная кислота может быть успешно альтернативно добавлена в форме ее водорастворимых солей, при этом ацетат натрия является особенно предпочтительным в качестве водорастворимой соли уксусной кислоты. В одном из примеров осуществления изобретения в соответствии с изобретением может использоваться водорастворимая соль уксусной кислоты дозированно после потребления глюкозы, в этом случае предпочтительный для применения ацетат натрия может добавляться в подпитывающей концентрации от 1 до 4 г/л. Добавление ацетата натрия с подпитывающей концентрацией 3 г/л является особенно предпочтительным.

В другом примере осуществления способа изобретения водорастворимая соль уксусной кислоты, предпочтительно ацетат натрия, присутствует в исходной загрузке. После того как рН возрастет до 7,5-8,5, уксусная кислота дозируется в виде водного раствора с концентрацией от 20 до 50%, предпочтительно 30%. Успешным является дозирование водного раствора уксусной кислоты в питательную среду с постоянным значением рН от 7,5 до 8,5, предпочтительно при рН 7,9.

Кроме того, способ этого изобретения может осуществляться посредством дозирования добавляемых компонентов, предпочтительно CoCl2x6H2O и мочевины, в определенное время и в подходящих концентрациях в процессе ферментации, при этом кобальт действует как кофактор и мочевина действует как индуктор.

В частности, от 4 до 20 г/л мочевины и от 0,02 до 0,04 г/л CoCl2 x 6H2O дозированно добавляются к культуральной среде для индукции нитрилгидратазы. Предпочтительным является присутствие мочевины в качестве индуктора в исходной загрузке питательной среды, предпочтительно, в концентрации 4 г/л, и остаток дозируется в предпочтительной концентрации в питающей среде 6 г/л после расходования первоначально предоставленной глюкозы.

В соответствии с изобретением добавление CoCl2x6H2O в качестве кофактора может осуществляться посредством смешивания CoCl2x6H2O, предпочтительно с концентрацией в питающей среде 0,01 г/л с питательной средой в начале экспотенциальной фазы роста на основе глюкозы в качестве источника углерода и затем после расходования глюкозы посредством дополнительного дозированного добавления предпочтительно с подающейся смесью в концентрации 0,03 г/л.

Было неожиданно найдено, что время ферментации может быть сокращено в случае, если способ изобретения осуществляется с дозированным добавлением CoCl2x6H2O, предпочтительно с концентрацией в питающей среде 0,01 г/л с момента начала экспотенциальной фазы роста.

Культивирование штамма по способу изобретения осуществляется во встряхиваемых колбах (встряхиваемые культуры) и в лабораторных или промышленных ферментерах в температурном интервале от 25 до 30°С в течение времени культивирования от 48 до 170 часов. В предпочтительном варианте осуществления способа изобретения подача кислорода в процессе культивирования, особенно в промышленных ферментерах, контролируется таким образом, чтобы относительное парциальное давление О2 было более 30%, предпочтительно ≥50%.

Преимущества способа этого изобретения для культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33, продуцирующего нитрилгидратазу, заключаются в том, что использование культуральной среды этого изобретения, особенно, если кукурузный экстракт применяется как дополнительный фактор роста, дает возможность продуцирования не только больших количеств биомассы, содержащей нитрилгидратазу (выход вплоть до 39,5 г/л сухой биомассы), но также еще и в том, что биомасса проявляет высокую специфическую нитрилгидратазную активность (вплоть до 315 Ед/мг), в то же время может достигаться общая нитрилгидратазная активность 7169 Ед/мл, как это можно заключить из нижеприведенных примеров.

В противоположность известному способу культивирования штаммов, продуцирующих нитрилгидратазу, настоящий способ в соответствии с этим изобретением характеризуется использованием культуральной среды, основанной на фосфатном буфере 12-60 мМ, который удовлетворяет потребности клеток в фосфоре и поддерживает рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования, и путем дозированного добавления уксусной кислоты в качестве нового источника углерода после расходования первоначально предоставленного количества глюкозы. Кроме того, кукурузный экстракт в жидкости от замочки кукурузы может использоваться в качестве дополнительного ростового фактора. Более того, преимуществами являются то, что имеется возможность замены глюкозы, которая может применяться для культивирования, не слишком дорогой уксусной кислотой, и таким образом при использовании способа изобретения обеспечивается высокая удельная нитрилгидратазная активность и высокая общая активность.

Стандартный тест для измерения нитрилгидратазной активности

1 мл раствора акрилонитрила с концентрацией 2% в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5) смешивается с 1 мл суспензии клеток М33, полученной предварительным центрифугированием культурального бульона, промывкой и последующим ресуспендированием клеток в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,5). Суспензия содержит от 0,08 до 0,16 мг клеток (сухой массы). Реакция протекает 5 минут, после чего реакция останавливается добавлением 20 мл концентрированной HCl. Концентрация образовавшегося акриламида определяется газовой хроматографией или фотометрией.

Нитрилгидратазная активность приводится в нижеследующих единицах:

• удельная активность - в Молях акриламида/мин х мг сухой биомассы = [Ед/мг]

• общая активность - в Молях акриламида/мин х мл культурального бульона = [Ед/мл]

Изобретение иллюстрируется посредством нижеследующих примеров:

Пример 1

Встряхиваемые колбы (250 мл), содержащие 50 мл культуральной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na2HPO4x12H2O; 1,8 KH2PO4; 0,02 CoCl2x6H2O; 1,0 MgSO4x7H2O; 2,0 кукурузного экстракта; рН 7,2±0.2) и содержащее глюкозу (50 г/л) и мочевину (от 4 до 20 г/л), инокулировались 1 мл инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов в той же среде. Культивирование осуществлялось во встряхиваемом инкубаторе при 180 об/мин (вращательное движение) при 30°С в течение 96 часов. Определялись выход биомассы и нитрилгидратазная активность клеток. Результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1Концентрация мочевины [г/л]Выход сухой биомассы [г/л]Нитрилгидратазная активностьУдельная активность [Ед/мг]Общая активность [Е/мл]422,3621383824,212630401224,415036601625,117744532023,01733970

Пример 2

Встряхиваемые колбы (250 мл), содержащие 50 мл культуральной среды "S1" (состав в г/л: 7,9 Na2HPO4x 12H2O; 1,8 KH2PO4; 0,02 CoCl2x6H2O; 1,0 MgSO4x7H2O; 16,0 мочевины; рН 7,2±0,2) и содержащее глюкозу (50 г/л) и кукурузный экстракт (от 0 до 10 г/л), инокулировались 1 мл инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов в той же среде. Культивирование осуществлялось во встряхиваемом инкубаторе при 180 об/мин (вращательное движение) при 30°С в течение 96 часов. Определялись выход биомассы и нитрилгидратазная активность клеток. Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2Концентрация кукурузного экстракта [г/л]Выход сухой биомассы [г/л]Нитрилгидратазная активностьСпецифическая активность [Ед/мг]Общая активность [Ед/мл]0*23,31262940125,51403299224,41503660424,91724290624,61634012824,415638021025,31413562*0,01 г/л FeSO4x7H2O дозированно добавлялись к исходной смеси

Из вышеупомянутых данных очевидно, что добавление кукурузного экстракта приводит к повышению удельной и общей нитрилгидратазной активностей. Оптимальная концентрация кукурузного экстракта была 4 г/л.

Пример 3

Встряхиваемые колбы (250 мл), содержащие 50 мл культуральной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na2HPO4x12H2O; 1,8 KH2PO4; 0,02 CoCl2x6H2O; 1,0 MgSO4x7H2O; 16,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2), содержали глюкозу в концентрации от 20 до 90 г/л. Инокуляция и инкубация колб осуществлялась как в Примере 1. Измеренные выход биомассы и нитрилгидратазная активность клеток суммированы в Таблице 3.

Таблица 3Концентрация глюкозы [г/л]Выход сухой биомассы [г/л]Время инкубации [час]Нитрилгидратазная активностьСпецифическая активность [Ед/мг]Общая активность [Ед/мл]2010,57230632123015,97225540514019,29622342825023,59621650766027,412020455957032,714419864658036,416619169569039,51661827169

Как можно видеть из таблицы 3, выход клеточной массы и общая нитрилгидратазная активность повышается пропорционально повышению концентрации глюкозы в культуральной среде. Это происходит в результате того, что все компоненты культуральной среды присутствуют в неограничивающих концентрациях.

Пример 4

Трехлитровый лабораторный ферментер, содержащий 1,5 л питательной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na2HPO4x12H2O; 1,8 KH2PO4; 0,01 CoCl2x6H2O; 1,0 MgSO4x7H2O; 16,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2) и содержащий 5 г/л глюкозы, инокулировался 100 мл инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов в той же среде.

Условия культивирования:

• температура 30°С

• скорость перемешивания 560 об/мин

• скорость аэрации 1,5 объем/объем/мин.

После 18 часов ферментации дозированно добавлялись 1,5 г/л глюкозы каждые 2 часа до тех пор, пока конечная концентрация не достигла 40 г/л. В результате показано, что полученные 16,4 г/л сухой биомассы проявляют удельную активность 215 Ед/мг. Общая активность была 3526 Ед/мл.

Пример 5

Трехлитровый лабораторный ферментер, содержащий 1,5 л питательной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na2HPO4x12H2O; 1,8 KH2PO4; 0,01 CoCl2x6H2O; 1,0 MgSO4x7H2O; 16,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2) и содержащий 20 г/л глюкозы, инокулировался как в Примере 4. Условия культивирования также были как в Примере 4. После ферментации в течение периода времени от 24 до 36 часов и расходования всей глюкозы дозированно добавлялись 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl2x6H2O. После повышения рН питательной среды дозированно добавлялась уксусная кислота с концентрацией 30% (питательная добавка). При этих условиях было найдено, что 19,6 г/л сухой биомассы, произведенные за 72 часа, проявляют удельную активность 315 Ед/мг. Общая активность была 6174 Ед/мл.

Пример 6

Пятнадцатилитровый лабораторный ферментер, содержащий 7,0 л питательной среды "SI" (состав в г/л: 7,9 Na2HPO4x12H2O; 1,8 KH2PO4; 1,0 MgSO4x7H2O; 4,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2) и содержащий 20 г/л глюкозы, инокулировался 4% (об./об.) инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инокулят инкубировался в течение 24 часов как встряхиваемая культура в среде такого же состава.

Условия культивирования:

• температура от 29 до 30°С

• скорость аэрации 0,5 объем/объем/мин

• внешнее давление 0,3 бар

• относительное парциальное давление О2 ≥50% контролируется при скорости перемешивания)

• скорость перемешивания от 300 до 600 об/мин.

После ферментации в течение 12 часов (начало экспотенциальной фазы роста) дозированно добавлялся 0,01 г/л CoCl2x6H2O. После ферментации в течение периода времени от 21 до 23 часов и потребления всей глюкозы были дозированно добавлены 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl2x6H2O. После того как рН культурального бульона возрос до 7,9, новый источник углерода в виде уксусной кислоты (30%) был дозированно добавлен, что сопровождалось установлением значения рН питающей среды 7,9. При этих условиях была возможность получить в течение только 66,5 ч 19,9 г/л сухой биомассы, проявляющей удельную активность 294 Ед/мг. Общая активность была 5851 Ед/мл.

Благодаря тому что CoCl2x6H2O не добавлялся к питательной среде до начала экспотенциальной фазы роста, стало возможным уменьшить время ферментации в сравнении с Примером 5.

Пример 7

Промышленный ферментер, имеющий емкость 15 м3 и содержащий 10 м3 культуральной среды "SI" (состав в г/л: 3,48 H3PO4; 0,74 КОН; NaOH для доведения рН до 6,9; 0,01 CoCl2x6H2O; 1,0 MgSO4x7H2O; 4,0 мочевины; 4,0 г кукурузного экстракта; рН 7,2±0,2), содержащий 20 г/л глюкозы инокулировался 5% (об./об.) инокулята Rhodococcus rhodochrous М33. Инкубация инокулята была предварительно завершена за 24 часа в пре-ферментере, опять же с использованием среды "SI".

Условия культивирования:

• температура от 28 до 30°С

• скорость перемешивания от 160 до 165 об/мин

• скорость аэрации 0,5 объем/объем/мин.

После периода времени от 24 до 36 часов и потребления всей глюкозы были дозированно добавлены к питательной среде 6 г/л мочевины, 3 г/л ацетата натрия и 0,03 г/л CoCl2x6H2O. Дозирование уксусной кислоты было аналогичным тому, как это описано в Примере 6. После 72 ч ферментации было найдено, что произведено 18,8 г/л сухой биомассы, проявляющей удельную активность 290 Ед/мг. Общая активность была 5452 Ед/мл.

Похожие патенты RU2340667C2

название год авторы номер документа
ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS AETHERIVORANS BKM AC-2610D - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ, СПОСОБ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛАМИДА 2012
  • Козулин Сергей Владимирович
  • Козулина Татьяна Николаевна
  • Козулин Алексей Сергеевич
RU2520870C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ 1993
  • Яненко А.С.
  • Астаурова О.Б.
  • Воронин С.П.
  • Герасимова Т.В.
  • Кирсанов Н.Б.
  • Пауков В.Н.
  • Полякова И.Н.
  • Дебабов В.Г.
RU2053300C1
ШТАММ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS NCIMB 41164 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТА НИТРИЛГИДРАТАЗЫ 2004
  • Хьюз Джонатан
  • Армитейдж Ивонна
  • Куллар Джейтиндер
  • Гринхал Стьюарт
RU2403280C2
ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ 2001
  • Демаков В.А.
  • Максимов А.Ю.
  • Кузнецова М.В.
  • Овечкина Г.В.
  • Козлов С.В.
  • Ремезовская Н.Б.
  • Максимова Ю.Г.
RU2196822C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛАМИДА 1996
  • Дебабов В.Г.
  • Воронин С.П.
  • Козулин С.В.
  • Синолицкий М.К.
  • Козулина Т.Н.
  • Полянский А.Б.
  • Синтин А.А.
  • Яненко А.С.
  • Байбурдов Т.А.
  • Хоркин А.А.
  • Луйксаар И.В.
  • Решетникова Л.В.
  • Федченко Н.Н.
RU2077588C1
Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы 1990
  • Яненко Александр Степанович
  • Полякова Инга Николаевна
  • Астаурова Ольга Борисовна
  • Пауков Владимир Николаевич
  • Козулин Сергей Владимирович
  • Синолицкий Максим Константинович
  • Моисеева Татьяна Николаевна
  • Воронин Сергей Петрович
  • Дебабов Владимир Георгиевич
SU1731814A1
ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ 2001
  • Демаков В.А.
  • Максимов А.Ю.
  • Аликин В.Н.
  • Кузнецова М.В.
  • Овечкина Г.В.
  • Будников В.И.
  • Федченко В.Н.
  • Федченко Н.Н.
  • Кузьмицкий Г.Э.
  • Черешнев В.А.
RU2223316C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛОВЫХ МОНОМЕРОВ И ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 2006
  • Яненко Александр Степанович
  • Ларикова Галина Андреевна
  • Герасимова Татьяна Васильевна
  • Леонова Татьяна Евгеньевна
  • Полякова Инга Николаевна
  • Дебабов Владимир Георгиевич
RU2304165C1
Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора 2018
  • Яненко Александр Степанович
  • Воронин Сергей Петрович
  • Новиков Андрей Дмитриевич
  • Глинский Сергей Алексеевич
  • Лавров Константин Валерьевич
  • Минасян Рубен Арменович
RU2731289C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ АМИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА 2007
  • Максимов Александр Юрьевич
  • Демаков Виталий Алексеевич
  • Максимова Юлия Геннадьевна
  • Олонцев Валентин Федорович
RU2352635C2

Реферат патента 2008 года СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА Rhodococcus rhodochrous МЗЗ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО НИТРИЛГИДРАТАЗУ

Способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous М33 предусматривает использование среды для культивирования, которая основывается на 12-60 мМ фосфатном буфере в деминерализованной воде, удовлетворяющем потребность клеток в фосфоре. Величину рН поддерживают в интервале от 5,5 до 9,0. После потребления всей первоначально предоставленной глюкозы добавляют уксусную кислоту и/или ее водорастворимую соль в качестве нового источника углерода. Среда для культивирования штамма включает 7,9 г/л Na2HPO4×12H2O, 1,8 г/л КН2PO4, 0,02-0,04 г/л CoCl2×6H2O, 1,0 г/л MgSO4×7H2O, 0-10 г/л кукурузного экстракта, 20-90 г/л глюкозы, 4-20 г/л мочевины, деминерализованную воду. Среда используется в указанном способе. Изобретение характеризуется повышенным выходом биомассы с высокой нитрилгидратазной активностью. Нитрилгидратазная активность составляет 7169 Ед/мл. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 3 табл.

Формула изобретения RU 2 340 667 C2

1. Способ культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous M33, продуцирующего нитрилгидратазу, зарегистрированного под номером DSM 14230 в DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH), Marschroder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany, отличающийся тем, что используемая культуральная среда основывается на 12-60 мМ фосфатном буфере в деминерализованной воде, соответствующем потребностям клеток в фосфоре, и поддерживающем рН в интервале от 5,5 до 9,0 в процессе культивирования, и к которому дозируют уксусную кислоту и/или ее водорастворимую соль в качестве нового источника углерода после потребления всей первоначально предоставленной глюкозы.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что кукурузный экстракт используют в качестве ростового фактора в вышеупомянутой питательной среде для культивирования.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве кукурузного экстракта используют жидкость и/или раствор, полученный при замочке кукурузы.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что вышеупомянутый кукурузный экстракт используют в указанной питательной среде для культивирования в концентрациях от 1 до 10 г/л.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источников углерода в питательной среде для культивирования используют последовательно глюкозу и уксусную кислоту.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что вышеупомянутая среда для культивирования содержит в качестве источника углерода глюкозу в концентрации от 20 до 90 г/л.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что добавляемая уксусная кислота представлена в форме ее водорастворимой соли.8. Способ по п.7, отличающийся тем, что используемая водорастворимая соль уксусной кислоты представляет собой ацетат натрия.9. Способ по п.7, отличающийся тем, что уксусную кислоту, применяемую наряду с ее водорастворимой солью в первоначальной загрузке, дозированно добавляют, когда водорастворимая соль уксусной кислоты использована и когда рН повышается до значений рН от 7,5 до 8,5.10. Способ по п.7, отличающийся тем, что после потребления глюкозы дозированно добавляют водорастворимую соль уксусной кислоты в концентрации от 1 до 4 г/л и, предпочтительно, 3 г/л.11. Способ по п.1, отличающийся тем, что последующее добавление уксусной кислоты осуществляют в форме водного раствора с концентрацией от 20 до 50%, предпочтительно, с концентрацией 30%.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что раствор уксусной кислоты дозированно добавляют в питательную среду с постоянным значением рН от 7,5 до 8,5, предпочтительно, при рН 7,9.13. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду для культивирования дозированно добавляют мочевину и CoCl2·6Н2О.14. Способ по п.13, отличающийся тем, что порцию мочевины, действующей как индуктор, включают в состав питательной среды, используемой в первоначальной загрузке, и затем, когда потреблена предоставленная вначале глюкоза, опять дозированно добавляют мочевину.15. Способ по п.1, отличающийся тем, что CoCl2·6Н2О добавляют в питательную среду в начале экспотенциальной фазы роста, осуществляемой на глюкозе в качестве источника углерода, и опять добавляют после потребления глюкозы.16. Способ по п.1, отличающийся тем, что во время культивирования в ферментере обеспечение кислородом контролируют таким образом, что относительное парциальное давление О2 составляло более 30% и, предпочтительно, ≥50%.17. Среда для культивирования штамма Rhodococcus rhodochrous M33, зарегистрированного под номером DSM 14230 в DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH), Marschroder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany, для использования в способе по любому из пп.1-16, включающая

a) 7,9 г/л Na2HPO4·12H2O;

b) 1,8 г/л КН2PO4;

c) 0,02-0,04 г/л CoCl2·6Н2О;

d) 1,0 г/л MgSO4·7H2O;

e) от 0 до 10 г/л кукурузного экстракта;

f) от 20 до 90 г/л глюкозы;

g) от 4 до 20 г/л мочевины; и

h) деминерализованную воду.

18. Среда для культивирования по п.17, отличающаяся тем, что среда для культивирования содержит кукурузный экстракт в концентрации от 1 до 10 г/л среды для культивирования.19. Среда для культивирования по п.17, отличающаяся тем, что указанная среда включает уксусную кислоту в качестве дополнительного источника углерода.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2008 года RU2340667C2

КИМ B-Y et al
Способ сопряжения брусьев в срубах 1921
  • Муравьев Г.В.
SU33A1
// Biotechnol
Bioprocess Eng
Перекатываемый затвор для водоемов 1922
  • Гебель В.Г.
SU2001A1
US 5827699, 27.10.1998
ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES DENITRIFICANS-ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ 2001
  • Полтавская С.В.
  • Козулина Т.Н.
  • Сингирцев И.Н.
  • Козулин С.В.
  • Воронин С.П.
RU2177034C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ 1993
  • Яненко А.С.
  • Астаурова О.Б.
  • Воронин С.П.
  • Герасимова Т.В.
  • Кирсанов Н.Б.
  • Пауков В.Н.
  • Полякова И.Н.
  • Дебабов В.Г.
RU2053300C1

RU 2 340 667 C2

Авторы

Лоренц Йозеф

Воронин Сергей Петрович

Козулин Сергей Владимирович

Сингирцев Игорь Николаевич

Дебабов Владимир Георгиевич

Яненко Александр Степанович

Даты

2008-12-10Публикация

2004-04-06Подача