ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ Российский патент 2003 года по МПК C12N9/78 C12P13/00 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью. Нитрилгидратаза - фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот до соответствующих амидов.

Известны штаммы бактерий, продуцирующие фермент - нитрилгидратазу и способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Pseudomonas chlororophis B23 (патент US 4,555,487), Rhodococcus rhodochrous J-1 (патент EP 0362829), Brevibacterium R312 (патент US 4,001,081), Rhodococcus rhodochrous M8 (патент SU 1731814), Rhodococcus rhodochrous М33 (патент RU 2053300), Agrobacterium radiobacter SC-C15-1 (патент US 5,395,758).

Известен также штамм Bacillus cereus В5-продуцент нитрилгидратазы (Патент RU 2160778, выдан 20.12.2000 г).

Целью изобретения является получение ряда новых легко культивируемых штаммов с высокой активностью нитрилгидратазы.

Сущность изобретения: получение нового штамма бактерий - продуцента фермента нитрилгидратазы, с использованием в качестве селективного агента ацетонитрила.

Штамм Rhodococcus erythropolis E84 обладает следующими признаками: грамположительный, неспорообразующий, некислотоустойчив, аэроб, имеет цикл развития. Клетки палочковидные или кокковидные.

Штамм Rhodococcus erythropolis E84 обладает высокой активностью нитрилгидратазы, достигающей 240 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила и 190 ммоль/мг/мин в отношении 3-цианопиридина. Штамм Rhodococcus erythropolis E84 может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот.

Штамм Rhodococcus erythropolis E84 отличается быстрым ростом на простой органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы.

Штамм характеризуется следующими культуральными, морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культуральные свойства:
При росте на агаризованной среде штамм образует круглые колонии с блестящей или матовой поверхностью, от молочно-белого, сероватого до бежевого или розоватого цвета.

Морфологические признаки:
Клетки грамположительные, подвижные, неспорообразующие, аэробные, имеют цикл развития, палочковидные (размеры 0,6-1,1 х 4,0-10 мкм) или кокковидные.

Физиологические свойства:
Температура роста 4-37^oС, оптимальное значение 30^oС. Штамм растет при рН 4,5-10, оптимальное значение рН 7,2.

Биохимические свойства:
Тест с метиловым красным - Положительно
Реакция Фогес-Проскауэра - Отрицательно
Потребление цитрата - Положительно
Восстановление нитрата - Отрицательно
Разложение тирозина - Положительно
Оксидаза - Отрицательно
Каталаза - Положительно
Уреаза - Положительно
Фосфатаза - Отрицательно
Липаза - Отрицательно
Образование индола - Отрицательно
Гидролиз целлюлозы - Отрицательно
Денитрификация - Отрицательно
Штамм использует в качестве источников азота соединения аммония, нитриты и нитраты. Гидролизует крахмал и казеин. Образует кислоту при росте на большинстве углеводов и многоатомных спиртов (см.таблицу А).

Хемотаксономические признаки:
Клеточная стенка содержит липид LCN-A типа Rhodococcus erythropolis. Основная аминокислота клеточной стенки - мезоДАПК (мезодиаминопимелиновая кислота).

Чувствительность к антибактериальным препаратам:
Штамм чувствителен к хлорамфениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, стрептомицину, тетрациклину.

Патогенность: штамм не патогенный.

На основании перечисленных характеристик штамм был отнесен к виду Rhodococcus erythropolis.

Изобретение описывает данный микроорганизм для использования в процессе гидратации различных нитрилосоединений и получения соответствующих амидосоединений.

Культура используемого в данном изобретении штамма бактерий может быть выращена на простых микробиологических средах, включающих различные источники углерода и азота, органические и неорганические соли, которые обычно используются для получения биомассы бактерий.

Ферментативную активность биомассы бактерий определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество нитрилгидратазы, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль амида в минуту мкМ амида/мг сухого веса/мин.

Пример 1. Заявляемый штамм Rhodococcus erythropolis E84 был выделен из почвы следующим образом:
1,0 г почвы вносили в 100 мл среды следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
КН₂РO₄ - 0,8
К₂НРO₄•3Н₂O - 1,5
NaCl - 1
MgSO₄•7H₂O - 0,5
Микроэлементы - 2 мл
рН - 7,2
Суспензию культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл 3 сут при температуре 28^oС и аэрации. 2 мл полученной суспензии ресуспендировали в 100 мл той же среды. Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 24-48 ч при 30^oС отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Rhodococcus erythropolis E84, обладающий нитрилгидратазной активностью.

Пример 2. Использование штамма Rhodococcus erythropolis E84 для трансформации акрилонитрила в акриламид.

Клетки культивировали в среде следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
(NH₄)₂SO₄ - 1
КН₂РO₄ - 0,8
К₂НРO₄•3Н₂O - 1,5
NaCl - 1
MgSO₄•7H₂O - 0,5
Микроэлементы - 2 мл
рН - 7,2
Из реакционной среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.

Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом: 1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Клетки ресуспендировали в том же буфере до значения оптической плотности 0,2-0,5 при длине волны 540 нм. К 2 мл клеточной суспензии добавляли акрилонитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 25^oС в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. НСl. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.

Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 240 ед. Изменение нитрилгидратазной активности в процессе культивирования показано в таблице 1.

Пример 3. Использование штамма Rhodococcus erythropolis E84 для трансформации 3-цианопиридина в никотинамид.

Штамм Rhodococcus erythropolis E84 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавляли 3-цианопиридин в количестве 25 мкл. Активность нитрилгидратазы в отношении 3-цианопиридина достигала 190 ед.

Пример 4. Влияние температуры на активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus erythropolis E84.

Бактерии Rhodococcus erythropolis E84, выращивали в течение 24 ч и подготавливали к трансформации по примеру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегося в реакционной смеси акриламида определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведения реакции трансформации представлено в таблице 2. Заявляемый бактериальный штамм на основании таксономического изучения отнесен к виду Rhodococcus erythropolis E84. Штамм обладает индуцибельной нитрилгидратазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Rhodococcus erythropolis E84 на минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или другие дешевые субстраты (ацетат, сахароза). Все компоненты среды являются коммерчески доступными соединениями, что особенно важно в случае промышленного использования штамма. Важными технологическими качествами для использования штамма являются высокая скорость роста и достаточная температурная стабильность фермента. Максимальная активность фермента наблюдается при 35^oС.

Штамм депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь.

Штамм Rhodococcus erythropolis E84 и его производные могут быть использованы в биотехнологических процессах получения амидов, в частности акриламида и никотинамида.

Штамм бактерий, относящийся к виду Rhodococcus erythropolis, обладает высокой нитрилгидратазной активностью. Депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН под 84. Данный микроорганизм отличается быстрым ростом на простых органоминеральных средах при высокой активности нитрилгидратазы. Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в биотехнологических процессах получения амидов, в частности акриламида и никотинамида. 3 табл.

Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis Е-84 - продуцент нитрилгидратазы.