ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ Российский патент 2004 года по МПК C12N9/78 C12N1/20 C12P13/00 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий, обладающего нитрилгидратазной активностью. Нитрилгидратаза-фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот до соответствующих амидов.

Известны штаммы бактерий, продуцирующие фермент - нитрилгидратазу и способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Rhodococcus sp. N 771 [1], Rhodococcus sp. N 774 [2], Pseudomonas chlororophis B23 [3], Rhodococcus rhodochrous J-1 [4], Rhodococcus R312 [5], Rhodococcus rhodochrous M33 [6], Agrobacterium radiobacter SC-C15-1 [7]. Известен также штамм Bacillus cereus В5-продуцент нитрилгидратазы [8].

Наиболее близким по технической сущности и достигнутому результату является штамм Bacillus cereus В5. Недостатком этого штамма является быстрое снижение активности нитрилгидратазы при трансформации акрилонитрила в акриламид после достижения концентрации 40%.

Задачей изобретения является получение нового легко культивируемого штамма, с высокой активностью нитрилгидратазы в интервале концентраций получаемых амидов до 50%.

Для решения этой задачи предлагается штамм бактерий Rhodococcus ruber - продуцент нитрилгидратазы, используемый в биотехнологическом процессе получения акриламида и других амидов карбоновых кислот.

Штамм характеризуется следующими культуральными, морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культуральные свойства: при росте на мясопептонном агаре штамм образует круглые колонии с блестящей или матовой поверхностью, от светло-кремового до красного цвета.

Морфологические признаки. Клетки грамположительные, не спорообразующие, факультативно анаэробные, палочковидные неправильной формы, размеры 0,6-1•2,0-25 мкм. Имеют цикл развития: ветвящиеся палочки-кокки. В возрасте 12-18 часов на мясопептонном агаре образуют слабо ветвящиеся нити, распадающиеся после 40-48 часов культивирования на короткие палочковидные и кокковидные клетки.

Хемотаксономические признаки: в клеточной стенке содержатся миколовые кислоты. LCN-A характерный для Rhodococcus ruber, арабиноза и галактоза. Основная диаминокислота клеточной стенки - мезо-диаминопимелиновая кислота.

Биохимические свойства приведены в табл. А.

Физиологические свойства: Температура роста 10-40^oС, оптимальное значение 28-30^oС. Штамм растет при рН 5-10, оптимальное значение рН 7,2. Штамм образует кислоту при росте на глюкозе, сахарозе и многоатомных спиртах. Не гидролизует желатин, крахмал и целлюлозу. В качестве источников азота использует соединения аммония и нитраты.

Чувствительность к антибактериальным препаратам:
Штамм чувствителен к хлорамфениколу, бензилпенициллину, ампициллину, канамицину, мономицину, стрептомицину, тетрациклину.

Патогенность: штамм непатогенный.

На основании этих характеристик штамм был отнесен к виду Rhodococcus ruber, Штамм депонирован в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганимов, под 612 от 27.11.2001.

Культура используемого в данном изобретении штамма бактерий может быть получена на различных видах сред, включающих различные источники углерода и азота, органические и неорганические соли, которые широко используются для получения культуры обычных бактерий.

Ферментативную активность определяли с использованием в качестве субстратов нитрилов карболовых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество нитрилгидратазы, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль амида в минуту (мкМ амид/мг сух.вес.•мин).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Заявляемый штамм Rhodococcus ruber GT был выделен из почвы следующим образом.

1,0 г почвы вносили в 100 мл среды следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
KH₂PO₄ - 0,8
K₂HPO₄•3H₂O - 1,5
NaCl - 1
MgSO₄•7H₂O - 0,5
FeSO₄•7H₂O - 0,1
CoCl₂•6H₂O - 0,01
pH - 7,2
Суспензию культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл 3 суток при температуре 28^oС и аэрации. 2 мл полученной суспензии ресуспендировали в 100 мл той же среды. Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на агаризированную среду (1,5% агар-агара) с теми же компонентами. После инкубации в течение 72 ч при 30^oС отбирали отдельные колонии и изучали их способность к трансформации акрилонитрила в акриламид. В результате был выделен штамм Rhodococcus ruber GT, обладающий нитрилгидратазной активностью.

Пример 2. Выращивание бактериальных клеток штамма Rhodococcus ruber GT, обладающих нитрилгидратазной активностью.

Для выращивания штамма Rhodococcus ruber GT была использована синтетическая среда N следующего состава, г/л: КН₂РО₄ - 1.0, К₂НРО₄•3Н₂О - 1.6, NaCl - 0.5, MgSO₄•7H₂O - 0.5, СаСl₂ - 0.005, дополненная 2,5 мл/л раствора микроэлементов, содержащего FeSO₄•7H₂O - 10.0, СоСl₂•6Н₂О - 10.0, pH среды 7.2±0.2. В качестве источника углерода использовали 40% раствор глюкозы - 2.5 мл/л среды. Источником азота служил 1М раствор NH₄Cl или (NН₄)₂SO₄ - 5 мл/л среды. В качестве индуктора добавляли 1М ацетамид до конечной концентрации 10 мМ.

Из среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила при выходе культуры в стационарную фазу (период максимального накопления биомассы) была не менее 120 ед.

Пример 3 Использование штамма Rhodococcus ruber GT для трансформации акрилонитрила в акриламид.

Клетки культивировали в среде следующего состава, г/л:
Глюкоза - 1
Ацетонитрил - 1
KH₂PO₄ - 0,8
K₂HPO₄•3H₂O - 1,5
NaCl - 1
MgSO₄•7H₂O - 0,5
FeSO₄•7H₂O - 0,1
pH - 7,2
Из среды периодически отбирали пробы для определения концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности. Концентрацию клеток определяли фотометрически при длине волны 540 нм.

Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом. 1 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Клетки ресуспендировали в том же буфере до значения оптической плотности 0,1-0,6 (А 540 нм). К 2 мл клеточной суспензии добавляли акрилонитрил в количестве 30 мкл. Реакцию проводили при 25^oС в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. НСl. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии. В качестве контроля использовали серийные разведения чистых препаратов акрилонитрила, акриламида и акриловой кислоты. Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 330 ед.

Пример 4. Использование штамма Rhodococcus ruber GT для трансформации нитрилов карбоновых кислот в соответствующие амиды.

Подготовку культуры Rhodococcus ruber GT и процесс трансформации нитрилов проводили аналогично примеру 2. В качестве субстратов реакции использовали нитрилы: ацетонитрил, пропионитрил, бутиронитрил, изобутиронитрил, акрилонитрил, адипонитрил, малонодинитрил и бензонитрил в количестве 30 мкл. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. Концентрацию амидов в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии. Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 590 ед.

Пример 5. Конверсия акрилонитрила в акриламид с применением штамма Rhodococcus ruber GТ
Клетки Rhodococcus ruber GT выращивали в ферментере объемом 10 л. Биомассу бактерий выделяли центрифугированием при 12000g 10 мин. Полученную биомассу с удельной активностью более 150 ед. использовали для синтеза акриламида. Синтез проводили в лабораторном термостатируемом химическом реакторе объемом 2 л при температуре 18-21^oС, рН 7.3. Дозирование акрилонитрила осуществлялось таким образом, чтобы его концентрация не превышала 0,5%. За 7 часов синтеза получали 49-54% растворы акриламида. Выход акриламида составлял 99%. Акриловая кислота и остаточный акрилонитрил в реакционной массе не обнаружены.

Заявляемый бактериальный штамм на основании таксономического изучения отнесен к роду Rhodococcus. Штамм отличается быстрым ростом, обладает нитрилгидратазной активностью, достигающей 330 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила и осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов до амидов. Индукция нитрилгидратазы достигается при выращивании клеток Rhodococcus ruber GТ на минеральной среде, содержащей в качестве индуктора нитрилы или амиды органических кислот, например ацетонитрил или ацетамид, а в качестве источника углерода - глюкозу или другие коммерчески доступные субстраты. Максимальная активность фермента наблюдается при 38^oС.

Штамм Rhodococcus ruber GT может быть использован в биотехнологических процессах получения амидов, в частности растворов акриламида с концентрацией до 50%.

Источники информации
1. Brennan B. A. , Nelson M.J, Dumey L.T., Scarrow R.C. (1996) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous Jl contains a non-corrin cobalt ion with two sullfur ligands. J. Am. Chem. Soc. 118, 9194-9195.

2. Nagamune Т., Honda J., Cho W.D., Kamiya N.. Teratani Y., Hirata A., Sasabe H. , Endo I. (1991) Cristallization of a photosensitive nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771. J Mol. Biol. 220, 221-222.

3. Nagasava Т., Nanba H., Ryuno K., Yamada H. (1987) Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororophis B23. Purification and characterization. Eur. J. Biochem. 162, 691-698.

4. Brennan В.A., Alms G., Nelson M.J., Dumey L.T., Scarrow R.C. (1996b) Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J-1 contains a non-corrin cobalt ion with two sulfur ligands. J. Am. Chem, Soc. 118, 9194-9195.

5. Osprian I., Jarret C., Strauss U., Kroutil W., Orru R.V.A., Feifer U. , Willetts A.J., Faber K. Large-scale preparation of a nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococceus R 312 (CBS 717.73) // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 6 (1999) 555-560.

6. Патент RU 2053300.

7. Патент US 05395758.

8. Патент RU 2160778.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза амидов карбоновых кислот из соответствующих нитрилов. Штамм бактерий Rhodococcus ruber GT отличается быстрым ростом на простой органоминеральной среде при высокой активности нитрилгидратазы, достигающей 330 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила. Нитрилгидратаза штамма Rhodococcus ruber GT термостабильна, применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах. Изобретение обеспечивает высокую активность нитрилгидратазы в интервале концентраций получаемых амидов до 50%. 3 табл.

Штамм бактерий Rhodococcus ruber GT - продуцент нитрилгидратазы.