ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ЛИНИЮ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ЭНДОКРИННЫХ КЛЕТОК Российский патент 2014 года по МПК C12N5/71 

В рамках настоящего изобретения испрашивается приоритет заявки с серийным номером 61/110287, поданной 31 октября 2008 года.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются способы стимуляции дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток. В частности, в настоящем изобретении предлагается способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.

При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, формирующих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование сформированной эндодермы. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF-3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.

Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании сформированной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия Pdx1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.

По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в публикации Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщается о дифференцировании эмбриональных стволовых клеток мыши в инсулин-секретирующие структуры, сходные с островками поджелудочной железы. В публикации Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщается, что инсулин-секретирующие клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши, нормализовали гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.

В одном примере, в публикации Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид 3-киназы (LY294002) приводила к образованию клеток, сходных с β-клетками.

В другом примере, в публикации Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003), сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши с конститутивной экспрессией Pax4.

В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуру на 4 день дифференцирования эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).

В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Эти результаты показывают, что экспрессия экзогенного Pdx1 очевидно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, P48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).

В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Также авторы наблюдали, что на уровень экспрессии мРНК инсулина и Pdx1 не влияла ретиноевая кислота; однако обработка раствором FGF7 с концентрацией 3 нM приводила к повышению уровня транскрипта Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).

В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16).

В публикации Gordon et al. продемонстрирована индукция образования эндодермальных клеток brachyury⁺/HNF-3бета ⁺ из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального пути Wnt (US 2006/0003446A1).

В публикации Gordon et al. (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались одновременно сигнальные пути Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».

Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например у человека.

В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека должны культивироваться в очень специфических условиях (патенты США № 6200806; WO 99/20741; WO 01/51616).

D'Amour et al. описывают производство обогащенных культур сформированной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки сформированной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшему дифференцированию в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).

В публикации D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали процесс дифференцирования, преобразующий человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭС) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы, инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование сформированной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».

В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировали с антагонистами TGF-β, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином с получением Pdx1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование запускалось никотинамидом.

В одном примере Benvenistry et al. сообщают: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия Pdx1 увеличивала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только in vivo» (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).

Циклины задействованы в функциях бета-клеток. Например, в работе Lilja et al сообщается, что Cdk5 присутствует в секретирующей инсулин панкреатической β-клетке (J. Biol. Chem., Vol. 276, Issue 36, 34199-34205, 07 сентября 2001 г.). Lilja et al утверждают, что «Cdk5 присутствует в β-клетках и действует как положительный регулятор экзоцитоза инсулина».

В другом примере Marzo et al утверждают, что «мыши с вставкой гена Cdk4 имеют значительно более высокую массу бета-клеток и являются физиологически функциональными, и это показывает, что Cdk4 является потенциальной мишенью для восстановления массы панкреатических бета-клеток при диабетах 1 типа» (Diabetalogia, Vol. 47, Number 4, 686-694, 01 апреля 2004 г.).

В другом примере Ubeda et al сообщают, что ингибирование активности циклин-зависимой киназы 5 защищает панкреатические бета-клетки от глюкотоксичности (J. Biol. Chem., Vol. 281, Issue 39, 28858-28864, 29 сентября 2006 г.).

В другом примере в публикации Wei et al сообщается о Cdk5-зависимой регуляции стимулируемой глюкозой секреции инсулина (Nature Medicine 11, 1104-1108 (01 октября 2005 г.)).

В другом примере Vanderford et al утверждают, что «MafA является основным транскрипционным фактором с лейциновыми застежками, экспрессируемым в бета-клетках поджелудочной железы, и он необходим для поддержания нормального глюкозного гомеостаза, поскольку задействован в различных аспектах биологии бета-клеток. Известно, что концентрация белка MafA увеличивается в ответ на высокий уровень глюкозы посредством пока не до конца охарактеризованных механизмов. Мы провели исследование, чтобы определить, контролируется ли экспрессия MafA дискретными событиями внутриклеточной сигнализации. Мы обнаружили, что общий ингибитор киназ стауроспорин индуцирует экспрессию MafA, не влияя на стабильность этого белка. Ингибирование MAP-киназы JNK имитирует влияние стауроспорина на экспрессию MafA. Кальмодулиновая киназа и кальциевая сигнализация также играют важную роль при стимуляции экспрессии MafA высоким уровнем глюкозы. Однако стауроспорин, JNK и кальмодулиновая киназа оказывают различные эффекты на индукцию экспрессии инсулина. Эти данные показывают, что концентрации MafA жестко контролируются скоординированными влияниями нескольких киназных путей» (Archives of Biochemistry and Biophysics (2008), doi: 10.1016/j.abb.2008.10.001).

Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке способов дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки, клетки, экспрессирующие панкреатические гормоны, или клетки, секретирующие панкреатические гормоны. В настоящем изобретении предлагаются способы увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий в себя этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей достаточное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1, панель a, показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние соединений из библиотеки ингибиторов киназ EMD Calbiochem на отношение экспрессии глюкагона к экспрессии инсулина в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Буквенно-цифровое обозначение соответствует идентификатору соединения, показанному в Таблице 1. На панели b показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние соединений из библиотеки ингибиторов киназ EMD Calbiochem на отношение экспрессии MAFA к экспрессии ARX4 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Буквенно-цифровое обозначение соответствует идентификатору соединения, показанному в Таблице 1.

На фиг.2 a) показана 4-кратная микрофотография клеток, обработанных в соответствии со способами, описанными в Примере 1, на 4 день обработки, соответствующей стадии 6. На панели b) показана 4-кратная микрофотография клеток, обработанных соединением PubChem № 5330812 в концентрации 0,5 мкM, на 4 день обработки. На панели c) показана 4-кратная микрофотография клеток, обработанных соединением PubChem № 5330812 в концентрации 1 мкM, на 4 день обработки. На панели d) показана 20-кратная микрофотография клеток, обработанных в соответствии со способами, описанными в Примере 1, на 6 день обработки, соответствующей стадии 6. На панели e) показана 20-кратная микрофотография клеток, обработанных 0,5 мкM соединения PubChem № 5330812, на 6 день обработки. На панели f) показана 20-кратная микрофотография клеток, обработанных соединением PubChem № 5330812 в концентрации 1 мкM, на 6 день обработки.

На фиг.3 показана экспрессия 23 обозначенных генов в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, и после пятидневной обработки соединением PubChem № 5330812 в концентрации 0,5 мкM (темные столбцы) или 1,0 мкM (светлые столбцы). Уровни экспрессии определяли в день 0, день 2 и день 5.

На фиг.4 показано влияние обработки CDK-ингибитором III на экспрессию маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, в клетках, прошедших обработку, соответствующую стадии 7 протокола дифференцирования, описанного в Примере 4.

На фиг.5 показано влияние обработки CDK-ингибитором III на окрашивание дитиазоном кластеров, подобных островкам поджелудочной железы.

На фиг.6 показана экспрессия инсулина, синаптофизина и глюкагона в инсулин-продуцирующих клетках, полученных в соответствии со способами, описанными в Примере 5. Экспрессию указанных белков определяли методом FACS.

На фиг.7 показана экспрессия инсулина, синаптофизина и глюкагона в инсулин-продуцирующих клетках, полученных в соответствии со способами, описанными в Примере 5. Экспрессию указанных белков определяли методом FACS.

На фиг.8 показана экспрессия MAFA (панель a) и инсулина (панель b) в инсулин-продуцирующих клетках, полученных способами, составляющими предмет настоящего изобретения. Образцы клеток для ПЦР-анализа отбирали в дни 1, 2, 3 и 4. После 4 дней обработки ингибитором CDK ингибитор CDK убирали из культуральной среды и клетки культивировали еще 4 дня в среде DMEM-F12 + 1% B27 + 20 нг/мл активина A. По истечении четырех дней отбирали в трех повторностях образцы для ПЦР-анализа.

На фиг.9 показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние соединений из библиотеки ингибиторов I киназ EMD Calbiochem на экспрессию MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.

На фиг.10 показано измеренное методом ПЦР в реальном времени влияние генестеина на экспрессию мРНК инсулина, глюкагона, соматостатина и MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

Определения

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

По потенциалу развития стволовые клетки классифицируются следующим образом: (1) тотипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным и внеэмбриональным типам клеток; (2) плюрипотентные, т.е. способные давать начало всем эмбриональным типам клеток; (3) мультипотентные, т.е. способные давать начало группе клеточных линий дифференцирования в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гематопоэтические стволовые клетки (HSC) могут давать таких потомков, как HSC (самообновление), олигопотентные предшественники, ограниченные клетками крови, и все типы клеток и клеточных элементов (таких как тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, т.е. способные давать начало более ограниченному набору клеточных линий дифференцирования, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, т.е. способные давать начало единственной клеточной линии дифференцирования (например, сперматогенные стволовые клетки).

Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которая может использоваться для оценки дифференцирования некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцирования.

Термин «β-клеточная линия дифференцирования» используется в настоящем документе для обозначения клеток, положительных по экспрессии гена транскрипционного фактора PDX-1 и по меньшей мере одного из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 или PAX6. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для β-клеточной линии дифференцирования, относятся β-клетки.

Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки сформированной эндодермы.

Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF- или HB9. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 или PTF1 альфа. Клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток, включают в себя панкреатические эндокринные клетки, панкреатические клетки, экспрессирующие гормоны и панкреатические клетки, секретирующие гормоны, а также клетки β-клеточной линии дифференцирования.

Используемый в настоящей заявке термин «сформированная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки сформированной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 бета, GATA4, SOX17, церберус, OTX2, гузекоид, C-Kit, CD99 или MIXL1.

Используемый в настоящей заявке термин «внеэмбриональная эндодерма» относится к популяции клеток, экспрессирующих по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX7, AFP или SPARC.

Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» обозначает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.

Используемый в настоящей заявке термин «мезэндодермальная клетка» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: CD48, эомезодермин (EOMES), SOX17, DKK4, HNF3 бета, GSC, FGF17 или GATA6.

Используемые в настоящей заявке термины «панкреатическая эндокринная клетка» или «клетка, экспрессирующая гормон поджелудочной железы» относятся к клетке, экспрессирующей по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка панкреатической эндодермы» относится к клеткам, способным к экспрессии по меньшей мере одного из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, PAX4 или NKX2.2.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка, продуцирующая гормон поджелудочной железы» относится к клетке, способной производить по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид.

Термин «клетка, секретирующая гормон поджелудочной железы» в настоящем документе обозначает клетку, способную секретировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка задней части передней кишки» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, HNF1, PTF1 альфа, HNF6, HB9 или PROX1.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка-предшественник клетки первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Nodal и FGF8.

Термин «клетка первичной кишечной трубки» в настоящем документе обозначает клетку, способную секретировать по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF1 или HNF4A.

Используемый в настоящей заявке термин «клетка первичной полоски» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок или FGF4.

Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток

Характеристика плюрипотентных стволовых клеток

Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или несколько стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к утрате экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81 (если имеются) и к увеличению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют Oct-4 и TERT, обнаруживаемые способом ОТ-ПЦР (RT-PCR).

Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.

Источники плюрипотентных стволовых клеток

К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся стабильные линии плюрипотентных клеток, получаемых из ткани, формирующейся после наступления беременности, в том числе из преэмбриональной ткани (например, бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе беременности, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).

В одном из вариантов осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в следующих публикациях Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).

Культивирование плюрипотентных стволовых клеток

В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные клетки в различных отношениях. Как вариант, плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенного дифференцирования. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.

Например, в публикациях Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147) описано культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов.

В публикации Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) анализировали набор из 11 различных слоев питающих клеток, полученных от взрослых, новорожденных и эмбрионов людей, по их способности осуществлять поддержку культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Richards et al. сообщают: «линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивируемые на питающих слоях из фибробластов кожи взрослых людей, сохраняют морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток, и остаются плюрипотентными».

В заявке на патент US20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку плюрипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент US20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.

В другом примере Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанного дифференцирования человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В еще одном примере Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают источник питающих клеток, получаемых из человеческой плаценты.

Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.

В другом примере Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих постнатальных фибробластов крайней плоти.

В патенте US6642048 описывается среда, поддерживающая рост плюрипотентных стволовых клеток приматов (пПС) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В патенте US6642048 говорится: «Данное изобретение включает мезенхимо- и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способы получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды».

В другом примере, в заявке на патент WO2005014799, описывается кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцирования клеток млекопитающих. В заявке на патент WO2005014799 говорится: «Культуральная среда, произведенная в соответствии с настоящим изобретением, кондиционируется при помощи секреторной активности клеток мыши, в частности активности дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов, именуемых MMH (Met Murine Hepatocyte)».

В другом примере Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.

В другом примере, заявке на патент US20070010011, описывается культуральная среда определенного химического состава для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.

В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 октября 2005 г.) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере, Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).

В другом примере, в заявке на патент US20050148070, описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде с определенным составом без сыворотки и без питающих клеток-фибробластов, где данный способ включает: культивирование стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заменитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, культуральную среду, по существу не включающую эмбриональную сыворотку млекопитающих и содержащую по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, причем фактор роста происходит из источника, отличного от просто слоя питающих клеток-фибробластов, среду, поддерживающую пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без слоя питающих клеток или кондиционированной среды.

В другом примере, в заявке на патент US20050233446, описывается среда с определенным составом, которая может быть использована при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. В растворе среда является по существу изотонической относительно культивируемых стволовых клеток. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенного дифференцирования.

В другом примере, в заявке на патент US6800480, отмечается: «В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания зародышевых стволовых клеток приматов в по существу недифференцированном состоянии, содержащая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, состоящей из питающих клеток и экстраклеточного матрикса, полученного из питающих клеток. Среда дополнительно содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, состоящей из нуклеозидов и соли-пирувата».

В другом примере, в заявке на патент US20050244962, говорится: «В одном аспекте в изобретении предлагается способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, по существу свободной от эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно также по существу свободной от сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, отличного от просто слоя питающих фибробластов. В предпочтительной форме слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов».

В другом примере, в заявке на патент WO2005065354, описывается изотоническая культуральная среда определенного состава, по существу не содержащая питающих клеток и сыворотки, содержащая: a. базальную среду; b. количество bFGF, достаточное для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; c. количество инсулина, достаточное для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d. количество аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.

В другом примере, в заявке на патент WO2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.

Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления подходящим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.

В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.

Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.

Подходящая культуральная среда может содержать следующие компоненты, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM), Gibco № 11965-092; модифицированную по способу Дульбекко среду Игла Knockout (KO DMEM), Gibco № 10829-018; базальную среду Хэма F12/50% DMEM; 200 мM L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco № 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.

Образование панкреатических продуцирующих гормоны клеток из плюрипотентных стволовых клеток

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения панкреатических продуцирующих гормоны клеток из плюрипотентных стволовых клеток, включающий:

a. культивирование плюрипотентных стволовых клеток,

b. дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы,

c. дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и

d. дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки.

Плюрипотентные стволовые клетки, соответствующие целям настоящего изобретения, включают, например, эмбриональные стволовые клетки человека линии H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07) и эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, которые экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, крипто, CD9, FOXD3, коннексин43, коннексин45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1-60 или Tra1-81.

Маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбираются из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, NODAL, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксового белка, FGF4 CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбирают из группы, состоящей из PDX1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбирают из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF1 альфа. В одном из вариантов осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую экспрессирующую гормоны клетку. В качестве альтернативы панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую секретирующую гормоны клетку.

В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцирования β-клеток. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии, экспрессирует Pdx1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 или PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для β-клеточной линии, представляет собой β-клетку.

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al, Development 131, 1651-1662 (2004).

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al, Stem Cells 25, 29-38 (2007).

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой, а затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и лиганд Wnt в отсутствие сыворотки, затем удаления лиганда Wnt и культивирования клеток с активином A и сывороткой. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 60/990529.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076889.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076900.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076908.

Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076915.

Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) и иммунологические способы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких из следующих факторов: ABCG2, крипто, FOXD3, коннексин43, коннексин45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1-60 или Tra1-81.

После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или с использованием способа, предложенного в настоящем изобретении.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, фактором роста фибробластов и ингибитором сигнального пути Hedgehog KAAD-циклопамином с последующим удалением содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин среды и культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 60/990529.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, хорошо известны специалистам в данной области, и дополнительные маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, продолжают выявляться. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатической эндодермы. К маркерам, характерным для линии панкреатической эндодермы, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, HLXB9, PTF1 альфа, PDX1, HNF6 или HNF1 бета.

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы.

Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) и иммунологические способы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Создание клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или с использованием способа, раскрываемого в настоящем изобретении.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей DAPT и экзендин-4, с последующим удалением содержащей DAPT и экзендин-4 среды и культивированием клеток в среде, содержащей экзендин-1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей экзендин-4, с последующим удалением содержащей экзендин-4 среды и культивированием клеток в среде, содержащей экзендин-1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей DAPT и экзендин-4. Пример использования данного способа приведен в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток путем культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в среде, содержащей экзендин-4. Пример использования данного способа приведен в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/736,908, принадлежащей LifeScan, Inc.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 60/953178, принадлежащей LifeScan, Inc.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США № 60/990529.

В одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ увеличения экспрессии маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток, включающий обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток средой, содержащей достаточное количество агониста рецептора TGF-β, чтобы вызвать увеличение экспрессии маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток, в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/110278.

Обнаружение клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток

Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели характерные особенности линии панкреатических эндокринных клеток. К маркерам, характерным для линии панкреатических эндокринных клеток, относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, NGN3, NEUROD или ISL1.

Маркеры, характерные для линии β-клеток, хорошо известны специалистам в данной сфере, и дополнительные маркеры, характерные для линии β-клеток, продолжают выявляться. Такие маркеры могут использоваться для подтверждения того, что клетки, прошедшие обработку в соответствии с настоящим изобретением, дифференцировались и приобрели свойства, характерные для β-клеточной линии дифференцирования. К специфичным характеристикам β-клеточной линии дифференцирования относится экспрессия одного или нескольких факторов транскрипции, таких как, например, PDX1, NKX2.2, NKX6.1, ISL1, PAX6, PAX4, NEUROD, HNF1 бета, HNF6, HNF3 бета или MAFA. Такие факторы транскрипции широко используются в данной области для идентификации эндокринных клеток. См., например, обзор Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).

Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. В качестве альтернативы эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии β-клеток.

Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) и иммунологические способы, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, метод проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

В одном из аспектов настоящего изобретения эффективность дифференцирования определяли путем измерения процентной доли инсулин-положительных клеток в данной клеточной культуре после обработки. В одном из вариантов осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 100% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 90% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 80% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 70% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 60% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 50% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 40% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 30% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 20% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 10% инсулин-положительных клеток в данной культуре. В альтернативном варианте осуществления способы, составляющие предмет настоящего изобретения, давали приблизительно 5% инсулин-положительных клеток в данной культуре.

В одном из аспектов настоящего изобретения эффективность дифференцирования определяли путем измерения стимулированной глюкозой секреции инсулина, определявшейся по количеству С-пептида, секретируемого клетками. В одном из вариантов осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 1000 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 900 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 800 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 700 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 600 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 500 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 400 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 500 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 400 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 300 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 200 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 100 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 90 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 80 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 70 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 60 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 50 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 40 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 30 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 20 нг C-пептида/пг ДНК. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, производили приблизительно 10 нг C-пептида/пг ДНК.

Увеличение экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей достаточное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA.

Ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 1. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 2. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 4. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 5. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать циклин-зависимую киназу 9. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может ингибировать несколько изоформ циклин-зависимой киназы, в любом их сочетании.

Ингибитор циклин-зависимых киназ может представлять собой белок. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может представлять собой пептид. Как вариант, ингибитор циклин-зависимых киназ может представлять собой малую молекулу. В одном варианте осуществления низкомолекулярный ингибитор циклин-зависимых киназ может быть выбран из группы, состоящей из 7-н-бутил-6-(4-гидроксифенил)[5H]пирроло[2,3-b]пиразина, 9-нитро-7,12-дигидроиндоло[3,2-d][1]бензазепин-6(5H)-она, 3-(6-оксо-9-нитро-5,6,7,12-тетрагидроиндоло[3,2-d][1]бензазепин-2-ил)пропионитрила, (2R)-2-((6-((3-амино-5-хлорфенил)амино)-9-(1-метилэтил)-9H-пурин-2-ил)амино)-3-метил-1-бутанола, аркириафлавина A, [6-бензиламино-2-(3-гидроксипропиламино)-9-изопропилпурина, бутиролактона I, (Z)-1-(3-этил-5-метокси-2,3-дигидробензотиазол-2-илиден)пропан-2-она, 2-(3-гидроксипропиламино)-6-(o-гидроксибензиламино)-9-изопропилпурина, 1-(2,6-дихлорфенил)-1,5-дигидро-6-((4-(2-гидроксиэтокси)фенил)метил)-3-(1-метилэтил)-4H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-4-она, Cdk/циклин-ингибиторного пептида III, 3-(2-хлор-3-индолилметилен)-1,3-дигидроиндол-2-она, этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилата, RO-3306, N-(цис-2-аминоциклогексил)-N-(3-хлорфенил)-9-этил-9H-пурин-2,6-диамина, 6-циклогексилметокси-2-(4′-сульфамоиланилино)пурина, 5-амино-3-((4-(аминосульфонил)фенил)амино)-N-(2,6-дифторфенил)-1H-1,2,4-триазол-1-карботиоамида, 3-амино-1H-пиразоло[3,4-b]хиноксалина, Cdk2-ингибитора I, Cdk2-ингибитора II, 2(бис-(гидроксиэтил)амино)-6-(4-метоксибензиламино)-9-изопропилпурина, 4-(6-циклогексилметокси-9H-пурин-2-иламино)-N,N-диэтилбензамида, N4-(6-аминопиримидин-4-ил)-сульфаниламида, (4-(2-амино-4-метилтиазол-5-ил)пиримидин-2-ил)-(3-нитрофенил)амина, 2-бром-12,13-дигидро-5H-индоло[2,3-a]пирроло[3,4-c]карбазол-5,7(6H)-диона, 1,4-диметоксиакридин-9(10H)-тиона, 5-(N-(4-метилфенил)амино)-2-метил-4,7-диоксобензотиазола, 4-(3,5-диамино-1Hпиразол-4-илазо)-фенола, 2-(2-гидроксиэтиламино)-6-(3-хлоранилино)-9-изопропилпурина, фаскаплизина, индирубин-3′-моноксима, индирубин-3′-моноксима, 5-иодо-, индирубин-3′-моноксим-5-сульфоновой кислоты, изогранулатимида, 2-(2-гидроксиэтиламино)-6-бензиламино-9-метилпурина, 6-(2-гидроксибензиламино)-2-((1R)-(гидроксиметил)пропил)амино)-9-изопропилпурина, 5-бром-3-(2-(4-фторфенил)-2-оксоэтилидин)-1,3-дигидроиндо-2-она, N6,N6-диметиладенина, 2-(1R-изопропил-2-гидроксиэтиламино)-6-(3-хлоранилино)-9-изопропилпурина, рапамицина, 2-(R)-(1-этил-2-гидроксиэтиламино)-6-бензиамино-9-изопропилпурина, сцитонемина, 3-[1-(3H-имидазол-4-ил)-мет-(Z)-илиден]-5-метокси-1,3-дигидроиндо-2-она и 4-(3′-гидроксифенил)амино-6,7-диметоксихиназолин.

В одном варианте осуществления ингибитор циклин-зависимой киназы представляет собой этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилат. В одном варианте осуществления этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилат добавляют к клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, в количестве от приблизительно 0,1 мкM до приблизительно 10 мкM на период от приблизительно одного до приблизительно семи дней.

В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, обрабатывают этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилатом в течение периода от приблизительно одного до приблизительно семи дней.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочего, следующими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в панкреатические эндокринные клетки в отсутствие эмбриональной бычьей сыворотки

Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1, пассаж 52, культивировали на чашках, покрытых препаратом MATRIGEL^® (разведение 1:30), и к ним применяли приведенный далее протокол дифференцирования для их дифференцирования в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.

a. Среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем

b. среда DMEM/F12 + 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее

c. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение четырех дней (стадия 3), далее

d. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM DAPT (ингибитор гамма-секретазы) (№ по кат. 565784, Calbiochem, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) + 100 нг/мл Netrin-4 (R&D Systems, Миннесота) в течение трех дней (стадия 4), далее

е. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5).

Среду заменяли ежедневно. На каждой стадии количество клеток подсчитывали с помощью гемоцитометра и для ПЦР-анализа отбирали образцы РНК. Все образцы отбирали в трех повторностях.

Пример 2

Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов II киназ EMD на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанном в Примере 1

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 44, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. После этого клетки в течение четырех дней обрабатывали средой DMEM/F12 + 1% B27, содержащей соединение из библиотеки EMD Calbiochem (№ по кат. 539745, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) в итоговом количестве 1 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. На всем протяжении выполнения протокола среду меняли ежедневно. Все образцы проходили обработку в двух повторностях. По завершении обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и Arx4. Результаты, измеренные методом ПЦР в реальном времени, выражали в виде отношения инсулин/глюкагон (фиг.1, панель a) или отношения MAFA к ARX4 (фиг.1, панель b) в образцах, прошедших обработку, в сравнении с необработанной контрольной группой. В Таблице 1 приведены соответствующие идентификационные номера соединений для каждого номера лунки.

При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединениями A6, B7, B8 или C2 в количестве 1 мкM отношение инсулин/глюкагон составляло приблизительно 3,0 или выше (см. фиг.1, панель a).

Далее исследовали влияние этих соединений на отношение MAFA/ARX4 и наблюдали, что при обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, некоторыми соединениями изменение отношения MAFA/ARX4 было значительно более сильным, чем при обработке другими протестированными соединениями из библиотеки: в клетках, обработанных соединением C2, наблюдаемое отношение MAFA/ARX4 составляло приблизительно 1000. При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединением C2 соотношение MAFA/ARX4 составляло приблизительно 100 (см. фиг.1, панель b).

Пример 3

Влияние обработки ингибитором циклин-зависимых киназ на экспрессию инсулина и MAFA в клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 1

Некоторые из соединений, повышавших отношение экспрессии инсулин/глюкагон или экспрессии MAFA/ARX4 в Примере 2, представляли собой ингибиторы циклин-зависимых киназ. Одним таким соединением было соединение № 5330797 (5-амино-3-((4-(аминосульфонил)фенил)амино)-N-(2,6-дифторфенил)-1H-1,2,4-триазол-1-карботиоамид) (№ по каталогу 217714; Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния). Для подтверждения этих наблюдений человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1, пассаж 42, культивировали в чашках площадью 10 см², покрытых препаратом MATRIGEL^®, и обрабатывали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. После стадии 5 клетки обрабатывали средой DMEM/F12 с добавлением 1% B27, содержащей соединение № 5330797 в количестве 1 мкM, в течение шести дней. Среду меняли через день. Образцы клеток отбирали для анализа методом ПЦР в реальном времени до обработки соединением и на второй и пятый дни обработки соединением.

На фиг.2 представлены характерные микрофотографии клеток на 4 и 6 день обработки соединением в сравнении с необработанными контрольными группами. Необработанные клетки расположены очень плотно (фиг.3, панели a и d), и различить отдельные клетки сложно. При этом после обработки соединением № 5330797 в количестве 0,5 мкM или 1 мкM в течение шести дней отдельные ядра становятся видимыми (фиг.2, панели e и f) в сравнении с необработанной контрольной группой (фиг.2, панель d), и это свидетельствует о том, что в популяции клеток происходит дифференцирование. Также это сопровождалось гибелью некоторого числа клеток, как отмечено пробелами в слоях клеток на фиг.2, панели b и c.

Обработка клеток соединением № 5330797 в разной степени приводила к увеличению экспрессии инсулина, глюкагона, MAFA, MAFB и соматостатина. На фиг.3, панели a-v, показана относительная индукция экспрессии генов в зависимости от обработки, в сравнении с днем 0 (до обработки). Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые подвергали обработке соединением № 5330797 в количестве 1 мкM, демонстрировали приблизительно 1,5-кратное увеличение экспрессии глюкагона через 48 часов обработки. Через 5 дней обработки указанная экспрессия снижалась до уровня меньшего, чем до обработки. Увеличение экспрессии глюкагона не наблюдалось при обработке соединением № 5330797 в количестве 0,5 мкM (см. фиг.3, панель a).

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в количестве 1 мкM в течение пяти дней, демонстрировали приблизительно 1,5-кратное увеличение экспрессии инсулина (см. фиг.3, панель b).

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в количестве 1 мкM в течение пяти дней, демонстрировали приблизительно 200-кратное увеличение экспрессии MAFA (см. фиг.3, панель d).

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в количестве 0,5 мкM в течение пяти дней, демонстрировали приблизительно 1,5-кратное увеличение экспрессии MAFB (см. фиг.3, панель c). Наблюдали дозозависимое увеличение экспрессии соматостатина (фиг.3, панель e).

Не наблюдали изменений в экспрессии амилазы в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые обрабатывали соединением № 5330797 в течение пяти дней (см. фиг.3, панель f). Однако наблюдали снижение уровня экспрессии PAX4 (фиг.3, панель h), NKX6.1 (фиг.3, панель k), PDX1 (фиг.3, панель l), NEUROD (фиг.3, панель o) и BRN4 (фиг.3, панель q).

Пример 4

Обработка ингибитором циклин-зависимых киназ повышала экспрессию MAFA в кластерах, подобных островкам поджелудочной железы

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 52, культивировали на чашках с покрытием MATRIGEL^® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1. Была введена дополнительная стадия (стадия 6) для дальнейшего созревания клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Стадия 6 в данном примере включала семидневную обработку средой DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния). Среду заменяли ежедневно.

После стадии 6 клетки обрабатывали в течение 5 минут при комнатной температуре 1X раствором аккутазы (Sigma, Миссури). Аккутазу удаляли и добавляли к клеткам среду DMEM/12 + 1% B27. Прикрепленные клетки снимали клеточным скребком, аккуратно ресуспендировали и пропускали через клеточный фильтр на 40 мкм. Клетки, оставшиеся на фильтре, снимали путем промывания базальной средой и культивировали в суспензии на сверхнизкопрофильных культуральных планшетах Ultra-Low (№ по кат. 3471, Corning, Массачусетс). Далее клетки проходили следующую обработку: клетки культивировали в среде DMEM/F12 + 1 % B27, содержащей 20 нг/мл активина A (AA), 1 мкм CDK-ингибитора III (№ по кат. 217714, Calbiochem, Калифорния) в течение 10 дней (стадия 7). В качестве контрольной группы использовали клетки, обработанные средой. В дни с 7 по 10 отбирали образцы для ПЦР-анализа и окрашивания дитизоном. Предполагалось, что клетки, культивированные в суспензии в соответствии со способами, описанными в данном примере, имели морфологию, сходную с кластерами в островках поджелудочной железы. Обработка CDK-ингибитором III, по-видимому, не влияла на морфологию кластеров, сходных с островками поджелудочной железы.

На фиг.4, панели a-i, показано влияние обработки CDK-ингибитором III на профиль экспрессии генов в клеточных кластерах. Обработка CDK-ингибитором III повышала экспрессию маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток, и, в частности, повышала экспрессию проинсулинового транскрипционного фактора MAFA.

На фиг.5, панели a-b, показано влияние CDK-ингибитора III на окрашивание кластеров дитиазоном (DTZ). Клеточные кластеры, обработанные CDK-ингибитором и окрашенные DTZ, имели более красный характер окраски, чем кластеры, не обработанные CDK-ингибитором III.

Пример 5

Анализ методом FACS инсулин-продуцирующих клеток, получаемых способами, составляющими предмет настоящего изобретения

Эмбриональные человеческие стволовые клетки линии H1, пассаж 42, культивировали на планшетах, покрытых препаратом MATRIGEL^®, и дифференцировали в инсулин-продуцирующие клетки с использованием следующего протокола:

a. среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем

b. среда DMEM/F12 + 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее

c. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение четырех дней (стадия 3), далее

d. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM DAPT (ингибитор гамма-секретазы) (№ по кат. 565784, Calbiochem, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) + 100 нг/мл Netrin-4 (R&D Systems, Миннесота) в течение трех дней (стадия 4), далее

e. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5), далее

f. среда DMEM/F12 + 1% B27 в течение семи дней (стадия 6), далее

g. обработка аккутазой в течение 5 минут, затем удаление скребком оставшихся прикрепленными клеток. Затем клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр 40 мкм. Клетки, оставшиеся на фильтре, извлекали путем смывания базальной средой и культивировали в суспензии на сверхнизкопрофильных культуральных планшетах в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (№ по кат. 11995-073, Invitrogen, Калифорния) + 1 % B27 + 20 нг/мл активина A (AA) и 1 мкМ CDK-ингибитора III (№ по кат. 217714, Calbiochem, Калифорния) в течение 5 дней (стадия 7).

Сходные с островками кластеры диспергировали на одиночные клетки с помощью реактива TrypLE Express (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния) и отмывали холодным PBS. Для фиксации клетки ресуспендировали в 200-300 мкл буфера Cytofix/Cytoperm (BD 554722, BD, Калифорния) и инкубировали в течение 30 мин при 4°C. Клетки дважды отмывали в 1 мл буферного раствора Perm/Wash (BD 554723) и ресуспендировали в 100 мкл раствора для окраски/блокировки, содержащем 2% нормальной козьей сыворотки в буфере Perm/Wash. Для анализа методом проточной цитометрии клетки окрашивали следующими первичными антителами: антителами к инсулину (кроличьи моноклональные антитела, Cell Signaling № C27C9; разведение 1:100); антителами к глюкагону (мышиные моноклональные антитела, Sigma № G2654, 1:100); антителами к синаптофизину (кроличьи поликлональные антитела, DakoCytomation № A0010, 1:50). Клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°C, после чего дважды промывали буфером Perm/Wash, а затем в течение 30 минут инкубировали в подходящих вторичных антителах: козьих антикроличьих Alexa 647 (Invitrogen № A21246) или козьх антимышиных 647 (Invitrogen № A21235); козьих антикроличьих R-PE (BioSource № ALI4407). Все вторичные антитела применяли в разведении 1:200. Клетки отмывали по меньшей мере один раз в буфере Perm/Wash и анализировали с применением метода BD FACS. Для анализа фиксировали не менее 10000 событий. В качестве контрольной группы использовали недифференцированные клетки H1 и клетки линии β-TC (CRL-11506™ ATCC, Вирджиния).

На фиг.6, панели a-c, показана процентная доля инсулин-положительных, синаптофизин-положительных и глюкагон-положительных клеток среди клеток, подвергавшихся обработке, соответствующей стадии 7, в базовой среде. На фиг.7, панели a-c, показана процентная доля инсулин-положительных, синаптофизин-положительных и глюкагон-положительных клеток среди клеток, подвергавшихся обработке, соответствующей стадии 7, в среде, содержащей CDK-ингибитор III в количестве 1 мкM, в течение 5 дней. Количество клеток, положительных по одному гормону, инсулину, после обработки CDK-ингибитором увеличилось с 3% до 8%. Кроме того, процентная доля полигормональных (инсулин- и глюкагон-положительных) клеток после обработки CDK-ингибитором уменьшилась.

Пример 6

Кинетика экспрессии MAFA, индуцированной CDK-ингибитором

Эмбриональные человеческие стволовые клетки линии H1, пассаж 42, культивировали на планшетах, покрытых препаратом MATRIGEL^®, и дифференцировали в инсулин-продуцирующие клетки с использованием следующего протокола:

a. среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем

b. среда DMEM/F12 + 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее

c. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение четырех дней (стадия 3), далее

d. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM DAPT (ингибитор гамма-секретазы) (№ по кат. 565784, Calbiochem, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) + 100 нг/мл Netrin-4 (R&D Systems, Миннесота) в течение трех дней (стадия 4), далее

e. среда DMEM/F12 + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5), далее

f. среда DMEM/F12 + 1% B27 в течение семи дней (стадия 6), далее

g. обработка аккутазой в течение 5 минут, затем удаление скребком оставшихся прикрепленными клеток. Затем клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр 40 мкм. Клетки, оставшиеся на фильтре, извлекали путем смывания базальной средой и культивировали в суспензии на сверхнизкопрофильных культуральных планшетах в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (№ по кат. 11995-073, Invitrogen, Калифорния) + 1% B27 + 20 нг/мл активина A (AA) и 2 мкм CDK-ингибитора III (№ по кат. 217714, Calbiochem, Калифорния) в течение 1-8 дней (стадия 7).

Образцы отбирали для ПЦР-анализа в дни 1, 2, 3 и 4. После 4 дней обработки CDK-ингибитором CDK-ингибитор извлекали из культуральной среды и клетки культивировали еще 4 дня в среде DMEM-F12 + 1% B27 + 20 нг/мл активина A. По истечении четырех дней отбирали в трех повторностях образцы для ПЦР-анализа.

На фиг.8, панели a-b, показан характер экспрессии MAFA и инсулина в разные моменты времени стадии 7. Обработка ингибитором CDK приводила к значительному увеличению экспрессии MAFA и инсулина, и это увеличение росло с течением времени. Однако удаление CDK-ингибитора приводило к значительному падению экспрессии как MAFA, так и инсулина в образцах, взятых через четыре дня после прекращения использования данного соединения.

Пример 7

Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов киназ BIOMOL™ на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанном в Примере 1

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 51, сеяли на 24-луночные планшеты с покрытием MATRIGEL^® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. После этого клетки выращивали в течение одного дня в среде DMEM/F12 + 1% B27, а затем обрабатывали в течение шести дней средой DMEM/F12 + 1% B27, содержащей соединение из библиотеки BIOMOL™ (№ по кат. 2832, BIOMOL, Plymouth Meeting, Пенсильвания) с итоговой концентрацией 4 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. В течение всего протокола обработки среду, содержащую базовые компоненты или соединение, меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях. По завершении обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и ARX4. Результаты, измеренные методом ПЦР в реальном времени, выражали в виде отношения инсулин/глюкагон (Таблица 2) или отношения MAF/Arx4 (Таблица 2) в образцах, прошедших обработку, относительно необработанной контрольной группы. В Таблице 3 указаны соответствующие № по кат., № CAS, название соединения или идентификационный номер для каждой обозначенной буквенно-цифровым кодом лунки.

При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединениями C8 или F1 в количестве 4 мкM отношение экспрессий инсулин/глюкагон составило приблизительно 10,0 или выше. У клеток, обработанных соединением D9, отношение экспрессий инсулин/глюкагон составляло приблизительно 1840,0 (Таблица 2).

Далее исследовали влияние этих соединений на отношение MAFA/ARX4 и наблюдали, что при обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, некоторыми соединениями изменение отношения MAFA/ARX4 было значительно более сильным, чем при обработке другими протестированными соединениями из библиотеки: в клетках, обработанных соединением B6 или F1, отношение MAFA/ARX4 составляло приблизительно 10. При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединением C8 соотношение MAFA/ ARX4 составляло приблизительно 84, а в клетках, обработанных соединением D9, отношение MAFA/ARX4 составило приблизительно 212 (Таблица 2).

Пример 8

Влияние ингибиторов циклин-зависимых киназ на экспрессию инсулина и MAFA в клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 1

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 51, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL™ (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 1, до стадии 5. Далее клетки выращивали в течение восьми дней в среде DMEM/F12 + 1% B27, а затем обрабатывали в течение четырех дней средой DMEM/F12 + 1% B27, содержащей ингибитор циклин-зависимых киназ с итоговой концентрацией 0,6125, 1,25 или 5,0 мкM. Были протестированы 6 ингибиторов: № 5330812 (№ по кат. EMD 217714), № 4566 (№ по кат. EMD 217713), № 5330797 (№ по кат. EMD 219476), № 73292 (№ по кат. EMD 341251), № 4592 (№ по кат. EMD 495620) и № 160355 (№ по кат. EMD 557360). В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. В течение всего протокола обработки среду, содержащую базовые компоненты или соединение, меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях. По завершению обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и ARX4. Результаты выражались в виде измеренной методом ПЦР в реальном времени кратности изменения относительно контрольной группы, обработанной чистой средой.

Мы наблюдали, что соединения № 5330812, № 4566, № 5330797 и № 73292 в протестированных количествах стимулировали экспрессию MAFA (Таблица 4). Соединения № 4592 и № 160355 в протестированных количествах не стимулировали экспрессию MAFA (Таблица 4). Оказалось, что соединения № 5330812, № 4566, № 5330797, № 4592 и № 160355 стимулировали экспрессию инсулина (Таблица 4). Соединение № 5330797 снижало экспрессию глюкагона и Arx4 (Таблица 4), а также стимулировало экспрессию MAFA.

Пример 9

Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток линии H1 в панкреатические эндокринные клетки с помощью среды DMEM, содержащей 25 мкM глюкозы (DMEM-HG) и не содержащей эмбриональной бычьей сыворотки

Человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 культивировали на чашках, покрытых препаратом MATRIGEL^® (разведение 1:30), и дифференцировали в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использованием следующего протокола:

a. среда RPMI с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, Миннесота), с добавлением 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, Миннесота), с добавлением 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, Нью-Джерси), в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A, с добавлением 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем

b. среда RPMI с добавлением 2% БСА + 50 нг/мл FGF7 + 0,25 мкM KAAD-циклопамина (№ 239804, Calbiochem, Калифорния) в течение двух дней (стадия 2), далее

c. среда DMEM-HG + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 50 нг/мл FGF7 + 0.25 мкM Cyclopamine- KAAD + 2 мкM ретиноевой кислоты (RA) (Sigma, Миссури) + 100 нг/мл Noggin (R & D Systems, Миннесота) в течение шести дней (стадия 3), далее

d. среда DMEM-HG + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 100 нг/мл Noggin + 1 мкM ALK5-ингибитора II (№ по кат. 616452, Calbiochem, Калифорния) в течение трех дней (стадия 4), далее

e. среда DMEM-HG + 1% B27 (Invitrogen, Калифорния) + 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) в течение семи дней (стадия 5).

Среду заменяли ежедневно. На каждой стадии количество клеток подсчитывали с помощью гемоцитометра и для ПЦР-анализа отбирали образцы РНК. Все образцы отбирали в трех повторностях.

Пример 10

Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов I киназ EMD на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 9

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 45, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL^® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 9, до стадии 5. Далее клетки культивировали и обрабатывали в дни 1, 3 и 5 стадии 5 средой, содержащей DMEM-HG, 1% B27 (Invitrogen, Калифорния), 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) и соединение из библиотеки EMD Calbiochem 1, разведенное в DMSO (№ по кат. 539744, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) с итоговой концентрацией при обработке 2,5 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. На всем протяжении протокола среду меняли ежедневно, за искючением стадии 5, когда среду меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях.

По завершению обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировали методом ПЦР в реальном времени на экспрессию MAFA. Результаты, измеренные методом ПЦР в реальном времени, выражали в виде кратности изменения экспрессии MAFA относительно необработанных человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 (Таблица 5).

При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, соединениями A4 (№ по кат. 124001, Akt-ингибитор IV), E8 (№ по кат. 527450, ингибитор PKR) и F9 (№ по кат. 539648, стауроспорин, N-бензоил-) в количестве 2,5 мкM экспрессия MAFA возросла по меньшей мере в 4 раза в сравнении с контрольной группой, обработанной средой (Таблица 5). При обработке соединением E6 (№ по кат. 521233, ингибитор IV тирозинкиназы рецептора PDGF) в количестве 2,5 мкM экспрессия MAFA возрастала по меньшей мере в 2,5 раза в сравнении с контрольной группой, обработанной средой (Таблица 5).

Пример 11

Скрининговое исследование влияния соединений из библиотеки ингибиторов II киназ EMD на клетки, обработанные в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 9

Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, пассаж 46, культивировали на 24-луночных планшетах с покрытием MATRIGEL^® (разведение 1:30) и дифференцировали в соответствии со способами, описанными в Примере 9, до стадии 5. Далее клетки культивировали и обрабатывали в дни 1, 3 и 5 стадии 5 средой, содержащей DMEM-HG, 1% B27 (Invitrogen, Калифорния), 1 мкM ALK5-ингибитора II (Calbiochem, Калифорния) и соединение из библиотеки EMD Calbiochem II, разведенное в DMSO (Таблицы 1 и 6, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) с итоговой концентрацией при обработке 2,5 мкM. В качестве контрольной группы инкубировали лунки со средой. На всем протяжении протокола среду меняли ежедневно, за искючением стадии 5, когда среду меняли через день. Все образцы проходили обработку в двух повторностях.

По завершению обработки отбирали РНК для ПЦР-анализа. Образцы анализировались методом ПЦР в реальном времени на экспрессию MAFA. Показаны измеренные методом ПЦР в реальном времени результаты по соединениям, стимулировавшим экспрессию MAFA, выраженные в форме кратности увеличения экспрессии MAFA в сравнении с контрольными образцами (фиг.9).

При обработке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, любым из следующих соединений: алстерпауллоном, 2-цианоэтилом; SU9516; алстерпауллоном; Cdk1/2-ингибитором III; ингибитором казеинкиназы I, D4476; или MEK1/2-ингибитором, в количестве 2,5 мкM экспрессия MAFA увеличивалась в 4,5 раза относительно необработанной контрольной группы (Таблица 7).

Пример 12

Ингибирование смены фаз клеточного цикла в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, низкомолекулярными ингибиторами стимулирует экспрессию MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток

Рост клеток, происходящий в результате смены фаз клеточного цикла, можно активировать и поддерживать, стимулируя клетки экстраклеточными ростовыми факторами. Ростовые факторы связываются с внеклеточными доменами рецепторов ростовых факторов и вызывают конформационное изменение внутриклеточного домена рецептора. Это изменение запускает димеризацию рецептора и активацию тирозинкиназ, расположенных на внутриклеточном домене рецептора, что ведет к фосфорилированию и активации нескольких нижележащих сериновых/треониновых киназ, и это в итоге приводит к продвижению клеток по фазам клеточного цикла и пролиферации клеток.

В нормальных физиологических условиях зрелые панкреатические бета-клетки, характеризующиеся экспрессией инсулина и транскрипционного фактора MAFA, находятся в состоянии покоя, оставаясь, как правило, в фазе G0 клеточного цикла. Тем не менее, для образования достаточного для формирования функционального органа количества клеток и удовлетворения потребностей зрелого организма животного, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющие предмет изобретения, должны проходить через фазы клеточного цикла. Таким образом, в определенный момент эмбрионального развития клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющие предмет настоящего изобретения, дифференцируются в бета-клетки и переходят из состояния активно меняющей фазы цикла пролиферирующей клетки в состояние покоящейся клетки.

Наши данные свидетельствуют, что путем ингибирования смены фаз клеточного цикла в результате блокады сигнальных каскадов при помощи низкомолекулярных ингибиторов киназ можно заставить клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, экспрессировать MAFA, маркер зрелых панкреатических бета-клеток. Ингибиторы киназ, нацеленные на рецептор ростовых факторов (ингибитор IV тирозинкиназ рецептора PDGF), или ингибиторы, нарушающие работу киназ, расположенных далее по каскаду от тирозинкиназных рецепторов (MEK1/2-ингибитор, PKR-ингибитор или Akt-ингибитор IV), нарушают работу пролиферативной сигнализации, связанной с ростовыми факторами и киназами, что приводит к остановке клеточного цикла и индукции экспрессии MAFA. Использование ингибиторов широкого спектра действия, таких как стауроспорин, позволяет эффективно индуцировать экспрессию MAFA, однако такой ингибитор в действующих количествах является цитотоксичным. Более специфические соединения, такие как ингибиторы циклин-зависимых киназ (алстерпауллон, 2-цианоэтил; SU9516; алстерпауллон или Cdk1/2-ингибитор III), индуцируют экспрессию MAFA и имеют меньшую цитотоксичность, чем ингибиторы широкого спектра действия, такие как стауроспорин.

Чтобы выяснить, способен ли ингибитор киназ широкого спектра действия индуцировать экспрессию MAFA и образование более зрелого фенотипа у клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, мы провели дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 в соответствии со способами, описанными в Примере 9, и обработали их в дни 1, 3 и 5 протеинтирозинкиназным ингибитором, генистеином, который, как было показано, индуцирует остановку фазы G2 в человеческих и мышиных клеточных линиях и ингибирует несколько киназ. При использовании доз 10 и 30 нг/мл наблюдался увеличенный уровень экспрессии эндокринных гормонов инсулина, соматостатина и транскрипционного фактора MAFA в сравнении с необработанной контрольной группой, тогда как при использовании дозы 10 нг/мл увеличивалась экспрессия эндокринного гормона глюкагона (фиг.10). При использовании дозы генистеина 100 нг/мл наблюдалась значительная токсичность, коррелировавшая с утратой экспрессии инсулина, глюкагона и соматостатина.

Эти данные показывают, что ингибируя смену фаз клеточного цикла путем блокирования сигнальных каскадов низкомолекулярными ингибиторами киназ, ориентированными на ингибирование трансдукции сигнала от тирозинкиназ рецепторов ростовых факторов, к ядру и циклин-зависимым киназам, можно заставить клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, составляющие предмет изобретения, экспрессировать MAFA, маркер зрелых панкреатических бета-клеток.

Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включены в настоящий документ. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Таблица 1
Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие №№ библиотеки ингибиторов II для киназ Calbiochem EMD Лунка № Лунка № Лунка № Лунка № A2 16760529 В2 16760303 C2 5330797 D2 9797929 A3 5278396 B3 5326739 C3 3004085 D3 11493598 A4 6605258 B4 5353431 C4 481747 D4 16760417 A5 5005498 В5 2422 C5 1893668 D5 73292 A6 16760286 B6 5472558 C6 9969021 D6 4124851 A7 5326843 В7 2794188 C7 2856 D7 6539732 A8 3641059 В8 5330812 C8 6918386 D8 448014 A9 6604931 В9 438981 С9 10202471 D9 5287844 A10 11524144 В10 6419753 С10 9549301 D10 6538818 A11 9549303 В11 16760346 С11 5339183 D11 10020713 E2 5312137 F2 11382492 G2 6419739 H2 176155 E3 6419766 F3 11624601 G3 4665 H3 16219471 E4 6419741 F4 490561 G4 4713 H4 3387354

E5 3674 F5 3820 G5 4712 H5 5174 E6 9903786 F6 5312122 G6 5164 H6 5228 E7 6419764 F7 9951490 G7 4987 H7 16760659 E8 8515 F8 389898 G8 9549289 H8 451705 E9 11665831 F9 9549284 G9 5702541 H9 16760660 E10 11422035 F10 11644425 G10 5162 H10 5289419 E11 16760525 F11 509554 G11 5353940 H11 9549300

Таблица 2
Влияние соединений из библиотеки ингибиторов BIOMOL на отношение экспрессий инсулин/глюкагон и MAFA/Arx4, измеренное методом ПЦР в реальном времени в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Буквенно-цифровой код лунки соответствует идентификатору соединения из Таблицы 3.   Отношение в сравнении с контрольной группой № лунки Инсулин к глюкагону MAFA к Arx4 В1 1,6 0,9 В2 2,4 1,3 B3 2,9 2,9 B4 1,1 2,0 В5 1,3 1,3 B6 1,6 16,3 В7 1,3 0,5 В8 1,6 0,5 В9 1,1 1,5 В10 1,2 1,5 В11 1,1 2,1 В12 1,0 2,0 C1 0,7 0,8

C2 0,9 1,0 C3 1,3 0,9 C4 1,2 1,7 C5 1,0 1,1 C6 1,6 1,2 C7 4,3 0,2 C8 40,2 84,3 С9 0,8 0,5 С10 2,3 1,9 С11 1,1 0,4 С12 1,0 0,4 D1 2,7 1,2 D2 3,4 1,3 D3 1,7 2,1 D4 5,8 6,4 D5 1,4 1,1 D6 1,8 3,9 D7 1,7 0,6 D8 2,8 5,1 D9 1842,5 212,6 D10 0,9 1,3 D11 1,0 0,7 D12 1,1 2,5 E1 1,1 0,9 E2 0,8 0,8 E3 1,2 1,0 E4 2,1 1,3 E5 1,3 1,1

E6 2,0 1,5 E7 4,8 0,2 E8 3,7 0,0 E9 1,0 0,8 E10 0,6 0,2 E11 1,0 0,3 E12 0,8 0,2 F1 10,3 9,5 F2 2,9 1,9 F3 2,6 2,5 F4 1,5 2,7 F5 1,9 1,4 F6 1,6 1,2 F7 1,9 0,6 F8 1,5 0,6 F9 1,0 1,4 F10 5,4 3,4 F11 0,8 1,9 F12 1,0 1,4 G1 0,8 1,2 G2 0,6 1,1 G3 2,0 1,6 G4 1,3 1,6 G5 1,7 1,5 G6 1,5 1,3 G7 4,6 0,2 G8 3,9 0,4 G9 1,0 0,7

G10 1,3 0,7 G11 1,9 0,6 G12 1,4 0,8 H1 3,1 0,6 H2 1,8 3,5 H3 1,8 3,9 H4 1,2 4,0 H5 1,8 2,0 H6 1,4 2,9 H7 1,5 0,6 H8 2,1 0,8 Контрольная группа 1,0 1,0

Таблица 3
Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие № по кат., № CAS, название соединения или идентификационный номер для библиотеки ингибиторов киназ BIOMOL РАСПОЛОЖЕНИЕ НА ПЛАНШЕТЕ № по кат. № CAS НАИМЕНОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ № В1 EI-360 167869-21-8 PD-98059 В2 EI-282 109511-58-2 U-0126 B3 EI-286 152121-47-6 SB-203580 B4 EI-148 84477-87-2 H-7 В5 EI-195 84468-17-7 H-9 B6 EI-156 62996-74-1 Стауроспорин В7 EI-228 133550-35-5 AG-494 В8 EI-267   AG-825

В9 EI-185 125697-92-9 Лавендустин A В10 EI-253 136831-49-7 RG-14620 В11 EI-191 118409-57-7 Тирфостин 23 В12 EI-187 118409-58-8 Тирфостин 25 C1 EI-257 122520-85-8 Тирфостин 46 C2 EI-188 122520-86-9 Тирфостин 47 C3 EI-189 122520-90-5 Тирфостин 51 C4 EI-190 2826-26-8 Тирфостин 1 C5 EI-335 116313-73-6 Тирфостин AG 1288 C6 EI-277 63177-57-1 Тирфостин AG 1478 C7 AC-1133 71897-07-9 Тирфостин AG 1295 C8 EI-215 10537-47-0 Тирфостин 9 С9 EI-247   HNMPA (гидрокси-2-нафталенилметилфосфоновая кислота) С10 EI-370 120685-11-2 PKC-412 (протеинкиназа С) С11 EI-271 10083-24-6 Пицеатаннол С12 EI-275 172889-26-8 PP1 D1 EI-272 133550-35-3 AG-490 D2 EI-263   AG-126 D3 EI-229   AG-370 D4 EI-258   AG-879 D5 ST-420 154447-36-6 LY 294002 D6 ST-415 19545-26-7 Вортманнин D7 EI-246 133052-90-1 GF 109203X D8 EI-226 548-04-9 Гиперицин

D9 EI-283 138489-18-6 Ro 31-8220 D10 EI-155 123-78-4 Сфингозин D11 EI-196 127243-85-0 H-89 D12 EI-158 84478-11-5 H-8 E1 EI-184 91742-10-8 HA-1004 E2 EI-233 103745-39-7 HA-1077 E3 EI-232   HDBA (2-гидрокси-5-(2,5-дигидроксибензиламино)-бензойная кислота) E4 EI-230 127191-97-3 KN-62 E5 EI-268   KN-93 E6 EI-197 109376-83-2 ML-7 E7 EI-153 105637-50-1 ML-9 E8 CC-100 452-06-2 2-аминопурин E9 CC-202 158982-15-1 N9-изопропилоломоуцин E10 CC-200 101622-51-9 Оломоуцин E11 CC-201 101622-50-8 изооломоуцин E12 CC-205 186692-46-6 Росковитин F1 EI-293 24386-93-4 5-йодотуберцидин F2 EI-295 62004-35-7 LFM-A13 F3 EI-294 152121-30-7 SB-202190 F4 EI-297 172889-27-9 PP2 F5 EI-298 208260-29-1 ZM 336372 F6 EI-306 5812-07-7 SU 4312 F7 EI-303 146535-11-7 AG-1296 F8 EI-307 220904-83-6 GW 5074

F9 AC-1121 6865-14-1 Пальмитоил-DL-карнитин Cl F10 EI-270 82-08-6 Роттлерин F11 EI-147 446-72-0 Генистеин F12 ST-110 486-66-8 Даидзеин G1 EI-146 63177-57-1 Эрбстатина аналог G2 AC-1142 6151-25-3 Кверцитина дигидрат G3 AC-1293 SU1498 G4 EI-357 4452-06-6 ZM 449829 G5 EI-278 195462-67-7 BAY 11-7082 G6 EI-231 53-85-0 DRB (5,6-дихлор-1-β-D-рибофуранозилбензимидазол) G7 EI-273   HBDDE (2,2',3,3',4,4'-гексагидрокси-1,1'-бифенил-6,6'-диметанола диметиловый эфир) G8 EI-305 129-56-6 SP 600125 G9 CC-206 479-41-4 Индирубин G10 CC-207 160807-49-8 Индирубин-3'-моноксим G11 EI-299 146986-50-7 Y-27632 G12 EI-310 142273-20-9 Кенпауллон H1 EI-328 121-40-4 Терреиновая кислота H2 EI-332 35943-35-2 Трицирибин H3 EI-336   BML-257 H4 EI-343   SC-514 H5 EI-344   BML-259 H6 EI-345 520-36-5 Апигенин

H7 EI-346   BML-265 (аналог эрлотиниба) H8 A-275 53123-88-9 Рапамицин

Таблица 4
Влияние соединений из библиотеки ингибиторов BIOMOL на экспрессию инсулина, глюкагона, MAFA и Arx4, в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток Количество и № MAFA Инсулин Глюкагон Arx4 0,61 мкM 5330812 46,3 0,9 0,26 0,68 1,25 мкМ 5330812 209,2 1,3 0,31 0,66 5,0 мкM 5330812 2909,9 66,3 4,71 0,92 0,61 мкM 4566 1,0 1,0 0,77 0,78 1,25 мкM 4566 0,8 1,1 0,90 0,78 5,0 мкM 4566 1,0 1,1 0,96 0,69 0,61 мкM 5330797 0,7 0,6 0,34 0,36 1,25 мкM 5330797 1,5 0,8 0,25 0,37 5,0 мкM 5330797 6,3 1,3 0,04 0,16 0,61 мкM 73292 0,7 0,7 0,29 0,38

1,25 мкM 73292 1,3 1,0 0,25 0,42 5,0 мкM 73292 3,1 0,8 0,13 0,33 0,61 мкM 4592 0,9 0,9 0,81 0,61 1,25 мкM 4592 1,0 1,0 0,70 0,54 5,0 мкM 4592 0,6 1,3 1,08 0,77 0,61 мкM 160355 0,9 0,9 0,76 0,77 1,25 мкM 160355 0,7 1,0 0,61 0,65 5,0 мкM 160355 0,8 1,1 0,59 0,86 Контрольная обработка 1,0 1,0 1,00 1,00

Таблица 5
Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие № по кат., название соединения или идентификационный номер для библиотеки ингибиторов I киназ EMD Calbiochem Местонахождение планшета № по каталогу Название соединения Индукция экспрессии генов в сравнении с H1:MAFa A10 197221 Bcr-abl-ингибитор 1,5 A11 203290 Бисиндолилмалеимид I 0,8 A12 DMSO Контрольная группа 1,5 A2 121767 AG 1024 0,8 A3 121790 AGL 2043 0,8 A4 124011 Akt-ингибитор IV 45,7 A5 124012 Akt-ингибитор V, трицирибин 0,9 A6 124018 Akt-ингибитор VIII, изозим-селективный, Akti-1/2 1,6 A7 124020 Akt-ингибитор X 1,4

A8 521275 PDK1/Akt/Flt-ингибитор двух каскадов 2,1 A9 189404 Ингибитор II киназы Aurora 1,3         В10 317200 DMBI 1,9 В11 324673 EGFR/ErbB-2-ингибитор 2,4 В12 DMSO Контрольная группа 1,9 В2 203297 Бисиндолилмалеимид IV 1,9 B3 203696 BPIQ-I 1,6 B4 220285 Хелеритрина хлорид 2,3 В5 234505 Соединение 56 1,8 B6 260961 DNA-PK-ингибитор II 2,0 В7 260962 DNA-PK-ингибитор III 2,2 В8 528100 PI-103 1,9 В9 266788 Ингибитор II диацилглицериновой киназы 1,5         С10 375670 Гербимицин A, Streptomyces sp. 1,3 С11 343022 Flt-3-ингибитор III 1,1

С12 DMSO Контрольная группа 1,1 C2 324674 EGFR-ингибитор 3,5 C3 324840 EGFR/ErbB-2/ErbB-4-ингибитор 0,9 C4 343020 Flt-3-ингибитор 0,6 C5 343021 Flt-3-ингибитор II 0,5 C6 344036 Ингибитор тирозинкиназы рецептора cFMS 2,2 C7 365250 Gц 6976 1,9 C8 365251 Gц 6983 1,0 С9 371806 GTP-14564 0,7         D10 440203 LY 303511 1,7 D11 448101 Ингибитор Met-киназы 2,1 D12 Пуст.   1,7 D2 407248 IGF-1R-ингибитор II 1,6 D3 407601 IRAK-1/4-ингибитор 2,2 D4 420099 JAK-ингибитор I 1,4 D5 420104 JAK3-ингибитор II 2,0 D6 420121 JAK3-ингибитор IV 1,7 D7 420126 JAK3-ингибитор VI 1,9 D8 428205 Lck-ингибитор 1,9 D9 440202 LY 294002 2,3        

E10 528106 Ингибитор PI 3-Kg 1,6 E11 528108 Ингибитор PI 3-Kb II 1,4 E12 Пуст.   1,6 E2 513035 PD 158780 0,8 E3 513040 PD 174265 1,0 E4 521231 Ингибитор II тирозинкиназы рецептора PDGF 0,8 E5 521232 Ингибитор III тирозинкиназы рецептора PDGF 1,7 E6 521233 Ингибитор IV тирозинкиназы рецептора PDGF 5,5 E7 521234 Ингибитор PDGF RTK 1,9 E8 527450 Ингибитор PKR 24,6 E9 527455 Ингибитор PKR, отрицательная контрольная группа 1,5         F10 567805 Ингибитор I Src-киназы 2,3 F11 572660 SU11652 1,7 F12 DMSO Контрольная группа 2,1 F2 529574 PP3 1,3

F3 529581 PP1-аналог II, 1NM-PP1 2,3 F4 539652 Ингибитор PKCbII/EGFR 1,8 F5 539654 Ингибитор PKCb 1,6 F6 553210 Рапамицин 1,2 F7 555553 Ингибитор III Rho-киназы, Rockout 1,7 F8 555554 Ингибитор IV Rho-киназы 2,3 F9 539648 Стауроспорин, N-бензоил- 11,7         G10 658550 AG 1295 1,4 G11 658551 AG 1296 1,1 G12 DMSO Контрольная группа 1,2 G2 574711 Syk-ингибитор 1,2 G3 574712 Syk-ингибитор II 0,8 G4 574713 Syk-ингибитор III 1,1 G5 616451 Ингибитор киназы TGF-b RI 1,1 G6 616453 Ингибитор III TGF-b RI 1,6 G7 658390 AG 9 1,5 G8 658401 AG 490 1,4 G9 658440 AG 112 1,4

H10 189405 Ингибитор III киназы Aurora 2,0 H11 569397 Стауроспорин, Streptomyces sp. 0,0* H12 DMSO Контрольная группа 1,5 H2 658552 AG 1478 2,7 H3 676480 Ингибитор I киназы VEGF-рецептора 2 1,7 H4 676481 Ингибитор II тирозинкиназы рецептора VEGF 1,0 H5 676482 Ингибитор III тирозинкиназы рецептора VEGF, KRN633 1,6 H6 676485 Ингибитор II киназы VEGF-рецептора 2 1,0 H7 676487 Ингибитор III киназы VEGF-рецептора 2 1,1 H8 676489 Ингибитор IV киназы VEGF-рецептора 2 2,1 H9 260964 DNA-PK-ингибитор V 1,5

Таблица 6
Буквенно-цифровая маркировка лунок и соответствующие № по каталогу и № соединений для библиотеки ингибиторов II киназ EMD Calbiochem^® № лунки № по кат. № соединения A1 DMSO   A2 422706 KN-62 A3 118500 Ингибитор ATM-киназы A4 118501 Ингибитор ATM/ATR-киназы A5 126870 Алстерпауллон A6 126871 Алстерпауллон, 2-цианоэтил A7 128125 Алоизин A, RP107 A8 128135 Алоизин, RP106 A9 164640 Аминопурваланол A A10 171260 Ингибитор AMPK, Соединение C A11 189405 Ингибитор III киназы Aurora A12 Пуст.   В1 DMSO   В2 189406 Ингибитор киназы Aurora / Cdk B3 402085 Индирубин-3′-моноксим B4 196870 BAY 11-7082 В5 203600 Богемин B6 217695 Ингибитор Cdk1 В7 217696 Ингибитор Cdk1, CGP74514A В8 217714 Cdk1/2-ингибитор III В9 217720 Ингибитор Cdk1/5

В10 218696 Ингибитор казеинкиназы I, D4476 В11 218710 Ингибитор III казеинкиназы II, TBCA В12 Пуст.   C1 DMSO   C2 219476 Cdk4-ингибитор C3 219477 Cdk4-ингибитор II, NSC 625987 C4 219478 Cdk4-ингибитор III C5 219479 Ингибитор Cdc2-подобной киназы, TG003 C6 220486 Chk2-ингибитор II C7 234503 Соединение 52 C8 238803 Cdk2-ингибитор III С9 238804 Cdk2-ингибитор IV, NU6140 С10 219491 Иннгибитор Cdk/Crk С11 328009 ERK-ингибитор III С12 Пуст.   D1 DMSO   D2 688000 Ингибитор ROCK, Y-27632 D3 328007 ERK-ингибитор II, FR180204 D4 328008 ERK-ингибитор II, отрицательная контрольная группа D5 341251 Фаскаплизин, синтетический D6 361540 GSK-3b-ингибитор I D7 361541 GSK-3b-ингибитор II D8 361549 GSK-3b-ингибитор VIII D9 361550 GSK-3-ингибитор IX

D10 361551 GSK-3-ингибитор X D11 361553 GSK-3b-ингибитор XI D12 Пуст.   E1 DMSO   E2 572635 SU6656 E3 361555 GSK-3-ингибитор XIII E4 371957 Изогранулатимид E5 400090 IC261 E6 401481 IKK-2-ингибитор IV E7 402081 Индирубиновое производное E804 E8 420119 JNK-ингибитор II E9 420123 JNK ингибитор, отрицательная контрольная группа E10 420129 JNK-ингибитор V E11 420136 JNK-ингибитор IX E12 Пуст.   F1 DMSO   F2 475863 Ингибитор MK2a F3 420135 JNK-ингибитор VIII F4 420298 K-252a, Nocardiopsis sp. F5 422000 Кенпауллон F6 422708 KN-93 F7 444937 MEK-ингибитор I F8 444938 MEK-ингибитор II F9 444939 Ингибитор MEK1/2 F10 454861 Ингибитор MNK1 F11 481406 Ингибитор активации NF-кB F12 Пуст.   G1 DMSO   G2 506121 Ингибитор III MAP-киназы p38 G3 506126 Ингибитор MAP-киназы p38 G4 513000 PD 98059 G5 513030 PD 169316 G6 559396 SB220025 G7 540500 Пурваланол A G8 361554 GSK3b-ингибитор XII, TWS119 G9 371963 H-89, дигидрохлорид G10 559387 SB 202474, отрицательная контрольная группа для опытов с ингибированием p38 MAPK G11 559388 SB 202190 G12 Пуст.   H1 DMSO   H2 559389 SB 203580 H3 371970 HA 1077, дигидрохлорида фасудил H4 559402 SB 218078 H5 565625 SC-68376 H6 567305 SKF-86002 H7 567731 Ингибитор сфингозинкиназы H8 569397 Стауроспорин, Streptomyces sp. H9 570250 STO-609 H10 572650 SU9516 H11 616373 Ингибитор Tpl2-киназы H12 Пуст.  

Таблица 7
Кратность увеличения экспрессии MAFA некоторыми соединениями из библиотеки ингибиторов II киназ EMD в клетках, обработанных в соответствии с протоколом дифференцирования, описанным в Примере 9 № лунки Кратность относительно контрольной группы № по кат. Наименование соединения A6 24,8 126871 Алстерпауллон, 2-цианоэтил H10 18,0 572650 SU9516 A5 15,3 126870 Алстерпауллон В8 8,2 217714 Cdk1/2-ингибитор III В10 5,7 218696 Ингибитор казеинкиназы I, D4476 F9 4,92 444939 Ингибитор MEK1/2

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Способ включает этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей достаточное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA. При этом в качестве ингибитора циклин-зависимой киназы используют этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-карбоксилат. Изобретение может быть использовано в медицине. 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 9 пр.

1. Способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, включающий стадии:
a. последовательной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека с получением клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток;
b. культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA по сравнению с клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, которые не культивируют в среде, содержащей добавленное количество ингибитора циклин-зависимой киназы,
где ингибитор циклин-зависимой киназы представляет собой этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-3-карбоксилат.

2. Способ по п.1, где этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фтор[2,3-b])пиридин-3-карбоксилат добавляют к клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, в концентрации от около 0,1 мкМ до около 10 мкМ в течение от одного до семи дней.

3. Способ по п.2, где клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринных клеток, обрабатывают этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фтор[2,3-b])пиридин-3-карбоксилатом в течение от одного до семи дней.