СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ КОСТНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии, травматологии, ортопедии, и может быть использовано при дифференциальной диагностике злокачественных новообразований среди лиц с доброкачественной патологией и злокачественными опухолями костно-мышечной системы.

Новообразования костей являются одними из первых описанных опухолей, но, несмотря на это, литература, посвященная этим разделам, скудна и фрагментирована. Злокачественные опухоли костей встречаются относительно редко, составляя 0,2-2,1% в общей структуре всех онкологических заболеваний человека, однако в диагностическом плане это один из труднейших разделов клинической онкологии [Васев Р.В. Костные саркомы (эпидемиология, состояние помощи больным и пути ее совершенствования по материалам Свердловской области). Автореферат на соискание степени кандидата медицинских наук, Уфа. 2006 г.].

Пик заболеваемости костными опухолями приходится на социально значимый возраст, например при остеосаркоме и саркоме Юинга - 10- 25 лет, при хондросаркоме - 35-40 лет, при этом более половины больных выявляются на поздней стадии опухолевого процесса, когда выполнение радикальных оперативных вмешательств становится невозможным.

Одним из возможных подходов к дифференциальной диагностике костных опухолевых новообразований могли бы стать серологические маркеры. По данным анализа отечественных и зарубежных литературных источников на роль специфичных маркеров костной резорбции и остеообразования претендуют одна из изоформ тартратрезистентной кислой фосфатазы (TRAP-5b) и костная фракция щелочной фосфатазы (КФЩФ). Показано, что TRAP-5b в процессе резорбции кости секретируется остеокластами в кровь, отражает их активность в реальном времени и, как следствие, скорость разрушения костной ткани. КФЩФ является специфичным маркером остеобластов, за счет которых происходит синтез новой костной ткани [Державин В. А. Диагностический алгоритм использования серологических маркеров остеосинтеза и остеолизиса у больных первичными местнораспространенными и диссеменированными опухолями костей. Автореферат на соискание степени кандидата медицинских наук, Москва. 2010 г.].

Однако определение сывороточной концентрации маркеров метаболизма костной ткани, таких как тартратрезистентная кислая фосфатаза и костная фракция щелочной фосфатазы, имеет ограниченное значение вследствие своей низкой специфичности у больных с первичными местнораспространенными и диссеминированными опухолями костей вследствие возможности продукции данных маркеров в растущей кости, а также при наличии переломов костей и замедленной их консолидации.

Известно также, что в механизмах роста, апоптоза, пролиферативной активности и ангиогенеза при опухолях костей участвует ряд цитокинов - низкомолекулярных пептидов, секретируемых клетками воспаления, иммунного ответа и самой опухоли. Клетки злокачественных опухолей и их микроокружение могут сами секретировать некоторые цитокины, в том числе IL-6, и экспрессировать соответствующие рецепторы. При этом чрезмерная продукция IL-6 может благоприятствовать росту опухоли и усилению ее васкуляризации, что способствует распространению регионарных и отдаленных метастазов. В связи с этим имеются сведения о том, что в сыворотке крови больных с опухолями костей, в частности остеосаркомой и хондросаркомой, наблюдается повышение уровня IL-6, причем секреция последнего возрастает при диссеминации опухолевого процесса [Тарасова Т.А. Интерлейкин-6 и его рецептор в сыворотке крови больных опухолями и опухолеподобными поражениями костей. Автореферат на соискание степени кандидата медицинских наук, Москва. 2010 г.].

Однако изолированное определение концентрации IL-6 не позволяет достоверно осуществлять дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных опухолей, а также степени прогрессии злокачественных опухолей ввиду влияния различных неспецифических факторов на содержание данного интерлейкина в сыворотке крови. Согласно литературным данным, повышение концентрации IL-6 может быть связано с неспецифическими и специфическими локальными и генерализованными инфекционно-воспалительными процессами, аутоиммунными заболеваниями, травматической болезнью, аллергическими реакциями.

Известно также, что у больных со злокачественными опухолями костей наблюдается значительное повышение уровня фактора некроза опухоли TNF-α, определенного методом иммуноферментного анализа в периферической крови, чем у группы контроля (значения показателя в норме) [Xiao Т. et al. Determination and significance of patients with malignant bone tumors. Hunan Yi Ke Da Xue Bao. 1998$ 23(6): 596-598].

Однако исследования были проведены на клетках крови (моноцитах) больных опухолями, которые были индуцированы липополисахаридом, что позволяет считать полученные доказательства участия TNF-α в патогенезе опухолей костей косвенными. Это связано с тем, что в условиях отсутствия опухолевого процесса липополисахарид сам по себе может стимулировать выброс TNF-α.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является «Способ диагностики опухолей костной системы» [патент RU на изобретение №2454665, основными авторами которого являются авторы заявляемого изобретения]. В сыворотке крови спектрофотометрически определяют количественное значение уровня неоптерина. При значении выше 2,6 нг/мл до 7,0 диагностируют доброкачественный опухолевый процесс, при значении выше 7,1 нг/мл - злокачественный опухолевый процесс.

Однако в данном способе учитывается только один компонент, который отражает лишь частично взгляд на взаимодействие между отдельными цитокинами и иммунокомпетентными клетками, что приводит к понижению объективности и чувствительности способа диагностики.

Задачей заявляемого изобретения является повышение объективности способа дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы, включающем взятие венозной крови, подготовку образцов проб сыворотки крови, исследование полученных образцов методом иммуноферментного анализа ИФА на планшетах с определением количественного значения уровня неоптерина NP, дополнительно определяют количественные значения уровней молекулы адгезии сосудистого эндотелия vCAM, молекулы межклеточной адгезии ICAM, фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкина-6 IL-6, анализируют полученные данные, рассчитывают с их учетом коэффициент К по формуле:

$$K=NP+\frac{\sqrt{vCAM}}{\sqrt{ICAM}}+\frac{\sqrt{TNF-\alpha }}{\sqrt{IL-6}}$$

и при значении К≤12,5 диагностируют доброкачественный процесс, при значении К>12,5 - злокачественный процесс.

Технический результат заявляемого изобретения. Повышение объективности диагностики достигается путем использования комплекса выбранных иммунологических маркеров, отражающих этапы онкогенеза при развитии доброкачественных и злокачественных опухолей костной системы, а именно секрецию различных цитокинов, стимулирующих онкогенез, молекул клеточной адгезии, активирующих неоваскулогенез, а также биологически активных веществ, обеспечивающих взаимодействие популяции моноцитов и макрофагов. Выбор маркеров, распределение их по группам и отражение патогенетической взаимосвязи между ними путем разработки расчетной математической формулы позволяет всесторонне оценивать состояние как клеточного, так и гуморального звеньев иммунной системы организма, дисбаланс которых приводит не только к активации процесса онкогенеза, но и к прогрессированию опухолевой агрессии. Анализ вышеперечисленных признаков способствует повышению точности и чувствительности проводимой диагностики.

Способ диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы осуществляют следующим образом. Первоначально осуществляют клиническое обследование больных с помощью стандартных методов, т.е. с оценкой жалоб и соматического статуса, детальным сбором анамнеза с выявлением факторов, влияющих на иммунный статус, и проведением обзорной рентгенографии исследуемой части скелета не менее чем в двух взаимоперпендикулярных проекциях. При необходимости результаты рентгенологического исследования дополняют прицельными снимками и томограммами.

После клинического обследования у больных с наличием новообразований костной системы производят взятие образца венозной крови в пробирку порядка 5 мл. С помощью центрифугирования готовят образцы проб сыворотки крови.

Исследуют полученные образцы сыворотки крови методом твердофазного иммуноферментного анализа ИФА на планшетах. При этом определяют в сыворотке крови количественные значения уровней опухолей неоптерина NP, молекулы адгезии сосудистого эндотелия vCAM, молекулы межклеточной адгезии ICAM, фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкина-6 IL-6. Для этого измеряют с помощью планшетного спектрофотометра оптическую плотность раствора в лунках при длине 450 нм и рассчитывают количественные значения уровней вышеперечисленных параметров. Анализируют полученные данные и рассчитывают с их учетом коэффициент К по формуле: $$K=NP+\frac{\sqrt{vCAM}}{\sqrt{ICAM}}+\frac{\sqrt{TNF-\alpha }}{\sqrt{IL-6}}$$ . При значении К≤12,5 диагностируют доброкачественный процесс, при значении К>12,5 - злокачественный процесс.

Пример 1.

Больной К., 26 лет, поступил в стационар ортопедического отделения с жалобами на боль, увеличение объема конечности, нарушение функции правого коленного сустава, хромоту. После клинического обследования выявленоналичие костного новообразования.

У больного было взято 5 мл венозной крови. Произвели определение количественного значения NP (нг/мл), vCAM и ICAM (пг/мл), TNF-α IL-6 (нг/мл) в сыворотке крови по описанному в данной заявке способу ИФА-методом на ридере «Anthos 2020» (Австрия) с помощью наборов «Bender MedSystems» (Австрия). Рассчитали коэффициент К по предлагаемой в данной заявке формуле:

$$\begin{array}{l}K=NP+\frac{\sqrt{vCAM}}{\sqrt{ICAM}}+\frac{\sqrt{TNF-\alpha }}{\sqrt{IL-6}}=\mathrm{6,8}+\frac{\sqrt{\mathrm{29,3}}}{\sqrt{\mathrm{17,6}}}+\frac{\sqrt{\mathrm{622,0}}}{\sqrt{\mathrm{300,3}}}=\\ =\mathrm{6,8}+\frac{\mathrm{5,41}}{\mathrm{4,2}}+\frac{\mathrm{24,9}}{\mathrm{17,3}}=\mathrm{6,8}+\mathrm{1,29}+\mathrm{1,44}=\mathrm{9,53}\end{array}$$

Больному диагностировали доброкачественный опухолевый процесс. Диагноз доброкачественной опухоли - хондрома у больного был подтвержден морфологически.

Пример 2.

Больная М., 32 лет, поступила в стационар ортопедического отделения с жалобами на боль, нарушение функции правого тазобедренного сустава. После клинического обследования выявлено наличие костного новообразования. У больной было взято 5 мл венозной крови. Произвели определение количественного значения NP (нг/мл), vCAM и ICAM (пг/мл), TNF-α и IL-6 (нг/мл) в сыворотке крови по описанному в данной заявке способу ИФА-методом на ридере «Anthos 2020» (Австрия) с помощью наборов «Bender MedSystems» (Австрия). Рассчитали коэффициент К по предлагаемой в данной заявке формуле:

$$\begin{array}{l}K=NP+\frac{\sqrt{vCAM}}{\sqrt{ICAM}}+\frac{\sqrt{TNF-\alpha }}{\sqrt{IL-6}}=\mathrm{27,5}+\frac{\sqrt{\mathrm{36,3}}}{\sqrt{\mathrm{16,7}}}+\frac{\sqrt{\mathrm{595,6}}}{\sqrt{\mathrm{198,2}}}=\\ =\mathrm{27,5}+\frac{\mathrm{6,025}}{\mathrm{4,09}}+\frac{\mathrm{24,4}}{\mathrm{14,08}}=\mathrm{27,5}+\mathrm{1,47}+\mathrm{1,73}=\mathrm{30,7}\end{array}$$

У больной диагностировали злокачественный опухолевый процесс. Диагноз злокачественной опухоли - хондросаркома у больной был подтвержден морфологически.

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и ортопедии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы. Для этого в образцах сыворотки крови методом иммуноферментного анализа определяют количественные значения уровней неоптерина NP, молекулы адгезии сосудистого эндотелия vCAM, молекулы межклеточной адгезии ICAM, фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкина-6 IL-6. Рассчитывают коэффициент К по формуле: $$K=NP+\frac{\sqrt{vCAM}}{\sqrt{ICAM}}+\frac{\sqrt{TNF-\alpha }}{\sqrt{IL-6}}$$ . При значении К≤12,5 диагностируют доброкачественный процесс, при значении К>12,5 - злокачественный процесс. Использование данного способа позволяет повысить объективность способа дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы путем использования комплекса выбранных иммунологических маркеров. 2 пр.

Способ диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований костной системы, включающий взятие венозной крови, подготовку образцов проб сыворотки крови, исследование полученных образцов методом иммуноферментного анализа ИФА на планшетах с определением количественного значения уровня неоптерина NP, отличающийся тем, что при исследовании образцов сыворотки крови дополнительно определяют количественные значения уровней молекулы адгезии сосудистого эндотелия vCAM, молекулы межклеточной адгезии ICAM, фактора некроза опухоли TNF-α, интерлейкина-6 IL-6, анализируют полученные данные, рассчитывают с их учетом коэффициент К по формуле:
,
и при значении К≤12,5 диагностируют доброкачественный процесс, при значении К>12,5 - злокачественный процесс.