Способ иммунодиагностики рака желудка Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/574 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и онкологии, может быть использовано для диагностики рака желудка.

Рак желудка имеет высокую заболеваемость и летальность во всех странах мира. В 2021 г. в Российской Федерации (РФ) прирост первичной заболеваемости злокачественными новообразованиями по сравнению с 2020 г. составил 4,4%. Показатель распространенности злокачественных опухолей среди населения РФ в 2021 г. составил 2 690,5 на 100 тысяч населения, что выше уровня 2011 г. на 32,6%. Считается, что рост показателя обусловлен как ростом заболеваемости, так и увеличением выявляемости и выживаемости онкологических больных. В РФ в 2021 г. при сравнении с 2011 г. увеличился удельный вес больных с впервые в жизни установленным диагнозом рака желудка, подтвержденным морфологически, с 86,5 до 96,8 %, выявленным активно – с 6 до 13,1 % (Каприн А.Д., Старинский В.В., Шахзадова А.О. Состояние онкологической помощи населению России в 2021 году. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2022).

Известен способ диагностики рака желудка путем проведения эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) с биопсией Указанный метод позволяет определить также локализацию и размер опухоли, выраженность воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка (СОЖ) (Назаров В.Е. и др. Эндоскопия пищеварительного тракта. - М.: Триада-Фарм, 2002).

Но в применении ЭГДС существуют медицинские ограничения: проведение данной процедуры затруднено у пациентов с хроническими заболеваниями дыхательной, сердечно-сосудистой систем, у пожилых пациентов и у детей, а так как метод инвазивный, существует риск вирусного и бактериального инфицирования.

Оценка иммунных параметров в диагностических целях при соматических заболеваниях, в том числе опухолевых, является актуальной, эффективной, не инвазивной. Преимуществами иммунологических методов являются хорошая воспроизводимость и точность, что обеспечивает практическую реализацию их применения во многих лечебно-диагностических учреждениях.

Ранее предложено в венозной крови больных раком желудка исследовать абсолютное содержание моноцитов и количество туморнекротизирующего фактора-α (TNF-α) для прогнозирования метастазирования опухолевого процесса (RU 2455924, МПК A61B 5/00, G01N 33/48, опубл. 20.07.2012).

Но данное изобретение не может быть использовано для иммунодиагностики рака желудка.

При раке желудка морфофункциональные изменения являются следствием воспалительного процесса и в условиях иммунной дисрегуляции сопровождаются нарушениями антигенного профиля мембран клеток. Специфичными считаются количественные изменения раково-эмбрионального антигена (РЭА), раковых антигенов (СА) 19-9 и 72-4.

Известен способ прогнозирования перитонеальных метастазов рака желудка по содержанию СА 19-9 в ткани большого сальника и брюшины, определяемому методом иммуноферментного анализа (ИФА) на этапе хирургического удаления опухоли (RU 2686689, МПК G01N 33/68, опубл. 30.04.2019).

Однако предложенный способ не может применяться для диагностики рака желудка.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ иммунодиагностики рака желудка на основе дефиниции сывороточной концентрации васкулоэндотелиального фактора роста, РЭА и пепсиногена-1, который позволяет выявить наличие онкотрансформации желудочного эпителия (RU 2580309, МПК G01N 33/50, опубл. 10.04.2016).

Однако ранее предложенный способ имеет меньшую диагностическую ценность для иммунологического стадирования рака желудка.

Известны результаты исследования количественного уровня интерлейкина (IL)-17 как провоспалительного цитокина и индуктора ангиогенеза при заболеваниях желудка (Матвеева Л.В., Мосина Л.М. Изменения сывороточной концентрации интерлейкина-17 при заболеваниях гастродуоденальной зоны. - Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2013. - №8).

Однако представленные данные получены в меньшей по объему выборке больных раком желудка, что не способствует иммунологическому стадированию злокачественного новообразования.

Техническим результатом изобретения является разработка малоинвазивного, не требующего больших материальных затрат, способа иммунологической верификации и стадирования рака желудка.

Сущность изобретения заключается в том, что способ иммунодиагностики рака желудка при определении иммунологических параметров крови, включает то, что в сыворотке крови исследуют количества ракового антигена 19-9 (СА 19-9), интерлейкина-17 (IL-17) и туморнекротизирующего фактора-α (TNF-α), при значениях СА 19-9 от 11 до 31,9 Ед/мл, IL-17 от 5,5 до 6,9 пг/мл, TNF-α включительно от 10,5 до 16 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия II стадии; при значениях СА 19-9 от 32 до 36,5 Ед/мл, IL-17 от 7 до 10 пг/мл, TNF-α от 16,5 до 21,5 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия III стадии; при значениях СА 19-9 больших или равных 55 Ед/мл, IL-17 больших или равных 11 пг/мл, TNF-α больших или равных 22 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия IV стадии.

На фиг. 1 показана зависимость изменений CA 19-9 от стадии рака желудка; на фиг. 2 показана зависимость изменений IL-17 от стадии рака желудка; на фиг. 3 показана зависимость изменений TNF-α от стадии рака желудка; в таблице отражено количество CA 19-9, IL-17, TNF-α в сыворотке крови здоровых лиц и больных раком желудка.

Способ осуществляют следующим образом: забор крови для исследования проводят в утренние часы натощак из локтевой вены в объеме 5 мл в сухую стерильную пробирку, отделяют сыворотку с помощью центрифугирования при скорости 1500 оборотов в минуту в течение 10–15 минут. Определение количественного уровня сывороточных СА 19-9, IL-17 и TNF-α проводят методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем.

В работе использовали наборы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), следуя инструкциям.

При определении концентрации СА 19-9 во все лунки планшета последовательно вносят по 50 мкл раствора для разведения образцов, затем вносят по 50 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С в течение 30 мин при интенсивности перемешивания 650 об/мин. После инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем в лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С в течение 60 мин при интенсивности перемешивания 650 об/мин. После этого лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл раствора тетраметилбензидина и инкубируют в темноте при температуре 18–25 °С в течение 15 мин. Для остановки реакции во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается в желтый цвет. Через 2–3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. Сывороточную концентрацию СА 19-9 определяют при построении калибровочного графика на трафарете. Достоверность результатов анализа оценивают по концентрации показателя в контрольном образце.

При определении концентрации как IL-17, так и TNF-α, во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора для разведения образцов, затем последовательно вносят по 100 мкл калибровочных образцов, контрольного образца, исследуемых образцов сыворотки крови. Заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С в течение 120 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. После 1-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата №1, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С в течение 60 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. После 2-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата №2, заклеивают планшет пленкой и инкубируют в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С в течение 30 мин при интенсивности перемешивания 700 об/мин. После 3-й инкубации лунки планшета промывают 5 раз промывочным раствором, затем вносят по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина и инкубируют в темноте при температуре 18–25 °С в течение 25 мин. Для остановки реакции во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента, содержимое лунок окрашивается. Через 2–3 мин после остановки реакции измеряют оптическую плотность в лунках с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. Сывороточную концентрацию IL-17 и TNF-α определяют при построении соответствующих калибровочных графиков на прилагаемом трафарете. Достоверность результатов анализа оценивают по количеству показателя в контрольном образце.

Способ апробирован на 90 больных раком желудка (основная группа) обоего пола (мужчин было 50 (55,6%), женщин – 40 (44,4%)) в возрасте от 35 до 78 лет. Средний возраст больных составил 59,02±2,33 года. Для корректного статистического анализа обследуемые пациенты были распределены в равнозначные по численности (n=30) группы сравнения: 1-я группа – онкобольные со II стадией РЖ, 2-я группа – больные РЖ III стадии, 3-я группа – больные РЖ IV стадии.. Среди больных с III и IV стадией РЖ отмечалось превалирование лиц мужского пола, взаимосвязанное с прогрессированием опухолевого процесса. Статистически значимых возрастных различий среди онкологических больных не наблюдалось.

Диагноз определяли на основании клинических данных, результатов ЭГДС и гистологического исследования. ЭГДС проводили в утренние часы, натощак, с взятием биоптатов из зоны поражения слизистой оболочки.

Кровь для исследования брали при первичном обращении до проведения хирургического или комбинированного лечения опухолевого заболевания при получении информированного согласия обследуемых лиц. В качестве сравнения использовали серологические показатели, полученные в контрольной группе у здоровых добровольцев (n=30), средний возраст которых составил 39,17±2,04 лет, из них 14 мужчин и 16 женщин.

Определение сывороточных концентраций CA 19-9, IL-17 и TNF-α у здоровых добровольцев позволило установить интервал нормы (таблица). При этом диапазон значений CA 19-9 в контрольной группе был значимо меньше, чем в рекомендациях производителя тест-системы. Данный факт может быть обусловлен относительной однородностью когорты добровольцев и отсутствием анамнестических данных об аддикциях (курение, злоупотребление алкоголем), способных самостоятельно инициировать генетическую нестабильность и онкогенез.

Анализ изменений сывороточных уровней CA 19-9, IL-17 и TNF-α у больных раком желудка выявил увеличение их содержания, зависящее от стадии опухолевого процесса, превышение дискриминационного уровня маркеров наблюдалось в 74,44%, 76,67% и 100% случаев соответственно (таблица).

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют обнаружить и верифицировать стадии опухолевого процесса в желудке по сывороточным уровням CA 19-9, IL-17 и TNF-α.

Пример 1. Больной Е., 60 лет, поступил на стационарное лечение во 2-е хирургическое отделение Мордовского республиканского онкологического диспансера 17.06.2019 г. с жалобами на ноющие боли в эпигастрии, похудание. После проведенного обследования выставлен диагноз: Злокачественное новообразование тела желудка (С16.2). Рак желудка II ст.

ЭГДС от 18.06.2019 г.: Инфильтративный рак тела желудка.

Гистологическое исследование биоптатов желудка: низкодифференцированная аденокарцинома.

Рентгенография желудка от 19.06.2019 г.: Инфильтративный рак тела желудка.

Иммунологическое исследование от 18.06.2019 г.: количество CA 19-9 – 31 Ед/мл, IL-17 – 6 пг/мл, TNF-α – 12 пг/мл.

Наличие злокачественного новообразования желудка у больного подтвердилось данными ЭГДС, гистологического, рентгенологического и иммунологического исследований. При хирургическом лечении были выявлено прорастание опухоли через мышечный слой желудка, метастатических очагов опухоли не обнаружено, установлена II стадия опухолевого процесса.

Пример 2. Больная Ш.,70 лет, поступила на стационарное лечение во 2-е хирургическое отделение Мордовского республиканского онкологического диспансера 10.08.2020 г. с жалобами на слабость, «голодные» боли в эпигастрии, тошноту. После обследования выставлен диагноз: Злокачественное новообразование тела желудка (С16.2). Рак желудка T3N0M0 IIА ст. Проведена лапароскопическая дистальная субтотальная резекция желудка по Бильрот 2 (типа Ру).

ЭГДС от 11.08.2020 г.: рак тела желудка.

Гистологическое исследование биоптатов желудка: эпителиальная опухоль тела желудка смешанного гистологического строения: перстневидно-клеточный рак (50%), низкодифференцированная аденокарцинома (50%). В 21 лимфоузле из 21 без метастазов. В краях резекции без опухолевого роста.

Рентгенография желудка от 12.08.2020 г.: Блюдцеобразный рак тела желудка.

Иммунологическое исследование от 11.08.2020 г.: количество CA 19-9 – 12 Ед/мл, IL-17 – 6 пг/мл, TNF-α – 13 пг/мл.

Наличие злокачественного новообразования желудка у больной подтвердилось данными ЭГДС, гистологического, рентгенологического и иммунологического исследований. При хирургическом лечении метастатических очагов опухоли не обнаружено, установлена II стадия опухолевого процесса.

Пример 3. Больной Т., 62 лет, поступил на стационарное лечение во 2-е хирургическое отделение Мордовского республиканского онкологического диспансера 05.04.2021 г. с жалобами на дискомфорт и боли в эпигастрии после еды, похудание. После проведенного обследования и лечения выставлен диагноз: Злокачественное новообразование преддверия привратника желудка (С16.3). Рак желудка T4аN1M0 IIIА ст.

ЭГДС от 06.04.2021 г.: Инфильтративный рак преддверия привратника желудка.

Гистологическое исследование биоптатов желудка: низкодифференцированная аденокарцинома с перстневидноклеточным компонентом, прорастающая в клетчатку сальника, с периневральной инвазией, в лимфатических сосудах подслизистого слоя опухолевые эмболы.

Рентгенография желудка от 07.04.2021 г.: Инфильтративный рак преддверия привратника желудка.

Иммунологическое исследование от 06.04.2021 г.: количество CA 19-9 – 34 Ед/мл, IL-17 – 9 пг/мл, TNF-α – 19 пг/мл.

При хирургическом лечении диагноз, установленный по результатам ЭГДС, гистологического, рентгенологического, иммунологического исследований, подтвердился.

Пример 4. Больная Г., 59 лет, поступила на стационарное лечение во 2-е хирургическое отделение Мордовского республиканского онкологического диспансера 06.07.2020 г. с жалобами на слабость, сонливость, боли в эпигастрии, правом подреберье, отеки, похудание. После проведенного обследования и лечения выставлен диагноз: Злокачественное новообразование желудка с распадом (С16.8). Рак желудка T3N2M2, IV ст. Раковая кахексия.

ЭГДС от 07.07.2020 г.: в просвете желудка циркулярно стенозирующееся образование от кардиального до антрального отдела с изъязвленной слизистой, покрытой местами фибрином, выраженно контактно ранимой, с практически не расправляющимися складками. Опухоль желудка с распадом.

Гистологическое исследование биоптатов желудка: высокодифференцированная аденокарцинома, HER2-негативный вариант.

Рентгенография желудка от 08.07.2020 г.: Инфильтративно-язвенный рак тела и антрального отдела желудка.

Ультразвуковое исследование брюшной полости: асцит, метастатическое поражение печени, правого яичника, гепатомегалия.

Иммунологическое исследование от 07.07.2020 г.: количество CA 19-9 – 70 Ед/мл, IL-17 – 15 пг/мл, TNF-α – 28 пг/мл.

При хирургическом лечении диагноз, установленный по результатам ЭГДС, гистологического, рентгенологического, иммунологического исследований, подтвердился.

При корреляционном анализе результатов определены статистически значимые сильные положительные взаимосвязи стадии опухолевого процесса с иммунными параметрами. Коэффициент корреляции Пирсона составил для CA 19-9 0,7438 (фиг. 1), для IL-17 – 0,8533 (фиг. 2), для TNF-α – 0,8798 (фиг. 3).

Способ предусматривает сочетанное определение сывороточной концентрации ракового антигена 19-9, интерлейкина-17 и туморнекротизирующего фактора-α. При значениях СА 19-9 больших или равных 11 Ед/мл, IL-17 больших или равных 5,5 пг/мл, TNF-α больших или равных 10,5 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия II стадии; при значениях СА 19-9 больших или равных 32 Ед/мл, IL-17 больших или равных 7 пг/мл, TNF-α больших или равных 16,5 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия III стадии; при значениях СА 19-9 больших или равных 55 Ед/мл, IL-17 больших или равных 11 пг/мл, TNF-α больших или равных 22 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия IV стадии. Данный способ может быть использован для скринингового выявления рака желудка, позволяя быстро, без значительных материальных и технических затрат с высокой вероятностью (>74%) выявить у пациентов с заболеваниями гастродуоденальной зоны наличие онкотрансформации желудочного эпителия и осуществить иммунологическое стадирование рака желудка.

Таблица

Показатели Контрольная группа Основная группа 1-я группа 2-я группа 3-я группа СА 19-9, Ед/мл Me [Q1; Q3] 2 [0; 3] 32 [20; 45] ¹⁾ 11 [4; 32] ¹⁾ 32 [28; 34] ^{1), 2)} 55 [43; 74] ^{1), 2), 3)} 5–95 процентили 0–4 3–81 2–33 12–36,5 24–84 Отклонение от нормы, % – 74,44% 46,67% 76,67% 93,33% IL-17, пг/мл Me [Q1; Q3] 2,5 [1; 3] 7 [6; 11] ¹⁾ 5,5 [5; 6] ¹⁾ 7 [6,5; 9] ^{1), 2)} 11 [10,5; 12,5] ^{1), 2), 3)} 5–95-й процентили 0–3,5 5–14 5–7 5–10 10–15 Отклонение от нормы, % – 76,67% 50% 80% 100% TNF-α, пг/мл Me [Q1; Q3] 2 [0; 3] 19 [15; 22,5] ¹⁾ 14 [12; 15] ¹⁾ 19 [18; 20] ^{1), 2)} 24 [22; 26] ^{1), 2), 3)} 5–95-й процентили 0–4 12–28 10,5–16 16,5–21,5 22–30 Отклонение от нормы, % – 100% 100% 100% 100%

Примечания: медиана – Me, 1-й квартиль (25-й процентиль) – Q1,

3-й квартиль (75-й процентиль) – Q3,

отличия от контрольной группы при р<0,001 – ¹⁾,

от больных со II стадией – ²⁾,

от больных с III стадией – ³⁾.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии и онкологии, и может быть использовано для иммунодиагностики рака желудка при определении иммунологических параметров крови. В сыворотке крови исследуют количества ракового антигена 19-9 (СА 19-9), интерлейкина-17 (IL-17) и туморнекротизирующего фактора-α (TNF-α). При значениях СА 19-9 от 11 до 31,9 Ед/мл, IL-17 от 5,5 до 6,9 пг/мл, TNF-α от 10,5 до 16 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия II стадии. При значениях СА 19-9 от 32 до 36,5 Ед/мл, IL-17 от 7 до 10 пг/мл, TNF-α от 16,5 до 21,5 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия III стадии. При значениях СА 19-9, больших или равных 55 Ед/мл, IL-17, больших или равных 11 пг/мл, TNF-α, больших или равных 22 пг/мл, устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия IV стадии. Способ обеспечивает возможность малоинвазивной, не требующей больших материальных затрат иммунологической верификации и стадирования рака желудка за счет определения у пациентов количественных уровней сывороточных СА 19-9, IL-17 и TNF-α. 3 ил., 1 табл., 4 пр.

Способ иммунодиагностики рака желудка при определении иммунологических параметров крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови исследуют количества ракового антигена 19-9 (СА 19-9), интерлейкина-17 (IL-17) и туморнекротизирующего фактора-α (TNF-α), при значениях СА 19-9 от 11 до 31,9 Ед/мл, IL-17 от 5,5 до 6,9 пг/мл, TNF-α от 10,5 до 16 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия II стадии; при значениях СА 19-9 от 32 до 36,5 Ед/мл, IL-17 от 7 до 10 пг/мл, TNF-α от 16,5 до 21,5 пг/мл устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия III стадии; при значениях СА 19-9, больших или равных 55 Ед/мл, IL-17, больших или равных 11 пг/мл, TNF-α больших или равных 22 пг/мл, устанавливают наличие онкотрансформации желудочного эпителия IV стадии.