СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕЛОГО ТЕЧЕНИЯ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОГО ГЕНЕЗА Российский патент 2019 года по МПК G01N33/50 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза.

Синдром механической желтухи (МЖ) возникает при наличии препятствия для оттока желчи в двенадцатиперстную кишку (ДИК), встречается от 12,0 до 45,2% случаев всех заболеваний желудочно-кишечного тракта [Воробьев, 2004; Дедерер, 1990; Сажин, 2003]. Чаще всего синдром МЖ доброкачественного генеза обусловлен желчнокаменной болезнью. Частота осложнений при МЖ колеблется от 47 до 70% случаев, при этом летальный исход возникает у больных МЖ неопухолевого генеза от 10 до 25% [Ветшев, 1999]. Основными патогенетическими звеньями МЖ являются гипербилирубинемия, ахолия, развитие системно-воспалительной реакции, эндотоксикоз. При данном состоянии отмечаются выраженные изменения в иммунной системе, которые, вероятно, ответственны за прогрессирование патологического процесса и развитие осложнений. У больных механической желтухой неопухолевого генеза отмечаются значимые нарушения в системах ПОЛ - АОЗ с преобладанием проокислительного компонента, что позволяет рассматривать данные изменения как существенные [Зарубина, 1999; Костюченко, Семиголовский, 2002, Топузов]. Тяжесть клинического состояния и высокая частота осложнений при МЖ обусловлены длительностью как самой механической желтухи и ограниченностью хирургического лечения при данной патологии, так и значимыми нарушениями функционирования различных систем организма. Таким образом, ранняя диагностика тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза, является актуальной для предупреждения развития осложнений и неблагоприятного исхода заболевания.

Известен способ прогнозирования течения механической желтухи различного генеза [3]. По разработанной балльной шкале определяют уровень билирубина крови, общего белка и генеза заболевания. Дополнительно вводят данные о возрасте больного, наличии сахарного диабета и сопутствующей патологии. Прогноз течения МЖ (благоприятный, сомнительный неблагоприятный, очень плохой) рассчитывают по математической формуле.

К недостаткам известного способа относятся: большое число требуемых критериев, субъективность в оценке многих показателей, необходимость применения дополнительных лабораторных и инструментальных исследований для оценки сахарного диабета, сопутствующей патологии, стадии злокачественного заболевания. В случае отсутствии соответствующих данных информативность способа снижается, а статистическая ошибка возрастает.

Задачей изобретения является создание информативного способа для ранней диагностики тяжелого послеоперационного течения синдрома механической желтухи доброкачественного генеза.

Задача достигается тем, что проводят иммунологическое и биохимическое исследование гепаринизированной венозной крови больных. Для этого методом непрямой иммунофлюоресценции в крови определяют абсолютное количество рап-маркеров Т-лимфоцитов и естественных киллеров (NK-клеток), а в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют уровни иммуноглобулина IgG и цитокинов - интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли - альфа (TNF-α). Спектрофотометрическим методом в эритроцитах определяют содержание малонового диальдегила (MDA) и активность дуплекса ферментов супероксиддисмутазы и каталазы (SOD-CAT). При абсолютном количестве рап-маркеров Т-лимфоцитов ниже 0,47×10⁹/л, NK-клеток ниже 0,14×10⁹/л, уровне IgG выше 5 г/л, ИЛ-10 выше 30 пг/мг, TNF-α выше 2 пг/мл, MDA выше 40 нмоль/1 г Hb, активности SOD ниже 600 ед/мин/ 1 г Hb, CAT ниже 0,8 ммоль/с/ 1 г Hb прогнозируют тяжелое течение синдрома механической желтухи доброкачественного генеза.

Развитие синдрома механической желтухи - сложный патогенетический процесс, характеризующийся нарушением энтерогепатической циркуляции желчных кислот, транслокацией кишечной микрофлоры в кровеносное русло, эндогенной интоксикацией, развитием вторичного иммунодефицита, угнетением гепатоцитов. При длительной обструкции желчевыводящих путей нарушается гемодинамика с развитием ишемии. Эндотоксикоз - главное патологическое воздействие на организм больного при механической желтухе. Гипербилирубинемия и токсическое воздействие других агентов изменяют клиническую картину заболевания, затрудняют диагностику патологии. Ухудшение функции гепатоцитов нарушает процесс захвата билирубина, в крови нарастает неконьюгированный токсический билирубин. Желчная гипертензия в протоках выше места желчного блока способствует развитию воспалительной реакции. Осложнения при механической желтухе разнообразны, обусловлены несколькими механизмами, и способствуют возникновению у больного синдрома полиорганной недостаточности.

Холестаз с развитием печеночно-клеточной недостаточности.

Нарушение системы детоксикации организма человека.

Резкое увеличение содержания в крови и тканях продуктов окислительного стресса.

Нарушение иммунного ответа и развитие инфекций.

Микроциркуляционный и реперфузионный механизм нарушения метаболизма.

Pan-маркеры Т-лимфоцитов - гетерогенная группа лимфоцитов, отвечающие за клеточный адаптивный иммунитет, выделяют эффекторные и регуляторные клетки, распознают «измененные свои антигены» в контексте с аутологичноймолекулой главного комплекса гистосовместимости - МНС (majorhistocompatibilitycomplex).

NK-клетки, естественные киллеры, - гетерогенная популяция лимфоцитов системы врожденного иммунитета. Они осуществляют противоопухолевый и противовирусный контроль организма. Кроме естественной цитолитической активности, натуральные киллеры оказывают регулирующее влияние на иммунные реакции посредством секреции цитокинов, хемокинов и ростовых факторов.

Иммуноглобулины G составляют до 80% от всего количества сывороточных иммуноглобулинов, осуществляют активацию комплемента по классическому пути, способствуя образованию иммунных комплексов, нейтрализацию токсинов, участвуют в аллергических реакциях немедленного типа, присоединяясь к тучным клеткам, базофилам и эозинофилам.

Цитокины, как регуляторы межклеточных взаимодействий в иммунной системе, также способствуют активации иммунного ответа, являясь связующим звеном между иммунной и другими системами организма. ИЛ-10 подавляет синтез цитокинов ТЫ-лимфоцитами, снижает активность макрофагов и пролиферацию Т-клеток. TNF-α активирует фагоцитирующие клетки, участвует в реализации цитотоксических эффектов NK-клеток, индуцирует апоптоз опухолевых и вирус-инфицированных клеток, усиливает экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках, макрофагах и нейтрофилах, повышает синтез простагландинов, является хемоаттрактантом для клеток иммунной системы.

Малоновый диальдегид (MDA) - реакционноспособное соединение, содержащее две альдегидные группы, конечный продукт перекисного окисления липидов. Он способен модифицировать белки, в том числе ферменты антиоксидантной системы, снижая их активность. Важным компонентом антиоксидантной системы является бифункциональная система: супероксиддисмутаза и каталаза (SOD-CAT). SOD участвует в устранении первичной активной формы кислорода - супероксиданион-радикала, являющегося пусковым звеном каскада свободнорадикальных реакций. Пероксид водорода, образующийся в реакции, катализируемой SOD, эффективно устраняется CAT. Таким образом, использование в качестве достоверных маркеров диагностики тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза абсолютного количества рап-маркеров Т-лимфоцитов, NK-клеток, уровня иммуноглобулина G, цитокинов в крови и уровня MDA, SOD-САТ является целесообразным. Было доказано, что наиболее значимыми для диагностики тяжелого послеоперационного течения механической желтухи доброкачественного генеза является понижение pan-маркеров Т-лимфоцитов ниже 0,47×10⁹/л, NK-клеток ниже 0,14×10⁹/л, содержании IgG выше 5 г/л, ИЛ-10 выше 30 пг/мг, TNF-α выше 2пг/мл, MDA выше 40 нмоль/1 г Hb, активности SOD ниже 600 ед/мин/1 г Hb, CAT ниже 0,8 ммоль/с/ 1 г Hb. При данных уровнях исследуемых цитокинов, иммуноглобулина G, малонового диальдегида, супероксиддисмутазы, каталазы и абсолютном количестве рап-маркеров Т-лимфоцитов и NK-клеток наличие тяжелого послеоперационного течения механической желтухи следует признавать высоким.

Пороговые значения цитокинов ИЛ-10, TNF-α, IgG, MDA, SOD, CAT и количества рап-маркеров Т-лимфоцитов, NK-клеток получены опытным путем на основании сопоставления уровней исследуемых цитокинов, иммуноглобулина G, малонового диальдегида, супероксиддисмутазы, каталазы и количества рап-маркеров Т-лимфоцитов и естественных киллеров с данными по наличию тяжелых послеоперационных осложнений у больных механической желтухой доброкачественного генеза, полученных при последующем наблюдении за клиническим состоянием больных.

CD3⁺-клетки ниже 0,47×10⁹/л ОШ=6,2 (95%ДИ=0,72-53,3, р_1-2=0,0017)

CD16⁺-клетки ниже 0,14×10⁹/л ОШ=3,2 (95%ДИ=0,61-16,2, р_1-2=0,0009)

IgG выше 5 г/л ОШ=6,6 (95%ДИ=0,77-56,3, р_1-2=0,032)

IL-10 выше 30 пг/мг ОШ=5 (95%ДИ=0,47-43,2, р_1-2=0,028)

TNF-α выше 2 пг/мл ОШ=2 (95%ДИ=0,47-8,42, р_1-2=0,002)

MDA выше 40 нмоль/1 г Hb ОШ=5,8 (95%ДИ=0,64-49,9, р_1-2=0,008)

SOD-CAT, SOD ниже 600 ед/мин /1 г Hb, CAT ниже 0,8 ммоль/с/ 1 г Hb ОШ=2,2 (95% ДИ=0,52-9,2, p_1-2=0,044)

Проведенные исследования показали, что при тяжелом течении механической желтухи доброкачественного генеза количество рап-маркеров Т-лимфоцитов варьировало от 0,17×10⁹ до 0,9×10⁹, NK-клеток - от 0,04×10⁹ до 0,32×10⁹, содержание IgG - от 5,0 до 10,0 г/л, уровни цитокинов IL-10 от 30 до 70 пг/мл, TNF-α - от 2 до 9 пг/мл, содержание MDA - от 40 до 85 нмоль/ 1 г Hb, SOD - от 100 до 750 ед/мин/ 1 г Hb, CAT - от 0,1 до 1,0 ммоль/с/ 1 г Hb. При этом в 100% случаев тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза независимо от уровня билирубина в крови развивалось при заявленных уровнях исследуемых показателей (CD3⁺-клетки ниже 0,47×10⁹/л, CD16⁺-клетки ниже 0,14×10⁹/л, IgG выше 5 г/л, IL-10 выше 30 пг/мг, TNF-α выше 2 пг/м, MDA выше 40 нмоль/ 1 г Hb, SOD ниже 600 ед/мин/ 1 г Hb, CAT ниже 0,8 ммоль/с/ 1 г Hb).

Рап-маркеры Т-лимфоцитов (CD3⁺CD56^+-клетки) - гетерогенная группа лимфоцитов, развивающиеся у человека в тимусе, выполняют важную роль в приобретенном иммунном ответе, обеспечивают распознавание и уничтожение клеток, несущих чужеродные антигены, усиливают действие моноцитов, NK-клеток, принимают участие в переключении изотипов иммуноглобулинов.

NK-клетки - CD16⁺CD56⁺-лимфоциты, участвуют в выработке как противовоспалительных, так и иммуносупрессирующих цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-альфа и ИЛ-10, секретируют гранулоцитарно-макрофагальный и гранулоцитарный колониестимулирующий факторы, ИЛ-3 и служат одним из основных источников интерферона-гамма в организме. Биологическая роль NK-клеток в противоопухолевой активности, контроле инфекционного процесса, регуляции пролиферативной активности и дифференцировки гемопоэтических клеток, участие в реакции отторжения трансплантата.

Иммуноглобулин G (IgG) участвует в антибактериальной защите через механизм комплемент-зависимого лизиса микробной клетки, проникает через плаценту, участвует в «армировании» макрофагов, в повышенной реактивности аллергического типа. Вырабатывается как при первичном, так и при вторичном иммунном ответе, обладают максимальной способностью проникать в ткани, они наиболее эффективно связывают и удаляют антигены.

Интерлейкин-10 (ИЛ-10) - вещество белковой природы, синтезируется Th2-хелперами 2 типа, блокирует синтез провоспалительных цитокинов, является сильным супрессором эффекторных функций макрофагов, Т-клеток и NK-лимфоцитов, участвует в пролиферации и дифференцировке В-клеток, тучных клеток и тимоцитов.

Фактор некроза опухоли - альфа (TNF-α) - внеклеточный белок, который вырабатывается макрофагами, моноцитами, лимфоцитами, эндотелиоцитами сосудов. Основные биологические эффекты: участие в иммунных реакциях, регуляция воспаления, влияние на процесс кроветворения, обладает цитотоксическим действием и имеет межсистемный эффект.

Малоновый диальдегид (MDA) возникает в организме при деградации полиненесыщенных жиров активными формами кислорода, является маркером перекисного окисления липидов и оксидативного стресса, способен реагировать с ДНК, образуя ДНК-аддукты.

Супероксиддисмутаза (SOD, КФ 1.15.1.1) относится к группе антиоксидантных ферментов. Вместе с каталазой и другими антиоксидантными ферментами защищает организм человека от постоянно образующихся высокотоксичных кислородных радикалов. SOD катализирует дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода. Супероксиддисмутаза играет важнейшую роль в антиокидантной защите практически всех клеток, находящихся в контакте с кислородом. Каталаза - фермент (КФ 1.11.1.6), катализирует разложение пероксида водорода на воду и молекулярный кислород, окисляет в присутствии пероксида водорода низкомолекулярные спирты и нитриты, содержится почти во всех организмах, участвует в тканевом дыхании.

Заявленный способ апробирован на 62 больных механической желтухой доброкачественного генеза (у 11 больных уровень билирубина в крови менее 60 мкмоль/л, у 35 - уровень билирубина в крови 60-200 мкмоль/л, у 16 - уровень билирубина в крови более 200 мкмоль/л), проходивших лечение в I хирургическом отделении КГБУЗ «Красноярская межрайонная больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича». У 7 (семи) больных было диагностировано тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза, которое в дальнейшем подтвердилось клиническим наблюдением и инструментальными исследованиями. У одного больного механической желтухой доброкачественного генеза диагностика не совпала. Таким образом, отмечено совпадение заявленного способа диагностики с доказанными инструментальными исследованиями в 98,0%.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного с механической желтухой доброкачественного генеза, независимо от уровня билирубина в крови, после оперативного пособия в хирургическом отделении забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирку. Из образца выделяют эритроциты, лимфоциты и сыворотку. Методом непрямой иммунофлюоресценци ииммунофенотипируют CD3⁺CD56⁺-клетки (pan-маркеры Т-лимфоцитов), CD16⁺CD56⁺-лимфоциты (NK-клетки) и определяют их количество в 1 литре. Метод определения цитокинов и иммуноглобулинов основан на «сэндвич» варианте твердофазного иммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител к цитокинам ИЛ-10 и TNF-α и IgG с использованием коммерческих тест-систем «Вектор-Бест». Уровень малонового диальдегида, супероксиддисмутазы и каталазы определяют спектрофотометрическим способом в выделенных эритроцитах. При сочетании показателей pan-маркеров Т-лимфоцитов ниже 0,47×10⁹/л, NK-клеток ниже 0,14×10⁹/л, содержании IgG выше 5 г/л, ИЛ-10 выше 30 пг/мг, TNF-α выше 2 пг/мл, MDA выше 40 нмоль/ 1 г Hb, активности SOD ниже 600 ед/мин/ 1 г Hb, CAT ниже 0,8 ммоль/с/ 1 г Hb прогнозируют тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза независимо от уровня билирубина в крови.

Больные с измененными иммунологическими и биохимическими показателями попадают в группу риска. Раннее назначение патогенетической терапии улучшает результаты основного лечения и способствует развитию благоприятного исхода, улучшая прогноз заболевания.

Клинический пример 1. Больная Е., 47 лет, поступила на стационарное лечение в I хирургическое отделение КГБУЗ «Красноярская межрайонная больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича» с диагнозом: жечнокаменная болезнь, обострение. Механическая желтуха. Больная поступила на обследование и лечение. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоят явления диспепсии, механической желтухи и боль в области правого подреберья. Проведено оперативное вмешательство по устранению механической желтухи.

Проведено обследование по заявленному способу. Определены уровни цитокинов, иммуноглобулина G в сыворотке крови, количество Т-лимфоцитов и NK-клеток, MDA, SOD, CAT:

СО3⁺-клетки (рап-маркеры Т-лимфоцитов) 0,2×10⁹/л (ниже 0,47×10⁹/л) CD 16⁺-клетки (NK-клетки) 0,1×10⁹/л (ниже 0,14×10⁹/л) IgG 9 г/л (выше 5 г/л) IL-10 50 пг/мг (выше 30 пг/мг) TNF-α 7 пг/мл (выше 2 пг/мл) MDA 53 нмоль/1 г Hb (выше 40 нмоль/1 г Hb) SOD 300 ед/мин/1 г Hb (ниже 600 ед/мин/1 г Hb) CAT 0,4 ммоль/с/1 г Hb (ниже 0,8 ммоль/с/1 г Hb)

Согласно изобретению, у больной прогнозируют тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза. Установленный диагноз подтвержден данными клинического наблюдения и инструментальными обследованиями. У больной в послеоперационном периоде развилось острое воспалительное поражение желчевыводящих путей (острый холангит). Больной назначена патогенетическая терапия.

Клинический пример 2. Больная М., 43 лет, поступила на стационарное лечение в I хирургическое отделение КГБУЗ «Красноярская межрайонная больница скорой медицинской помощи имени Н.С. Карповича» с диагнозом: ЖКБ, обострение. Механическая желтуха. Больная поступила на обследование и лечение. При поступлении состояние больного тяжелой степени тяжести, беспокоят явления механической желтухи и боль в области правого подреберья. Проведено оперативное вмешательство по устранению механической желтухи.

Проведено обследование по заявленному способу. Определены уровни цитокинов, иммуноглобулина G в сыворотке крови, количество Т-лимфоцитов и NK-клеток, MDA, SOD, CAT:

CD3⁺-клетки (pan-маркеры Т-лимфоцитов) 0,5×10⁹/л (ниже 0,47×10⁹/л) CD 16⁺-клетки (NK-клетки) 0,18×10⁹/л (ниже 0,14×10⁹/л) IgG 4,5 г/л (выше 5 г/л) IL-10 25 пг/мг (выше 30 пг/мг) TNF-α 1,8 пг/мл (выше 2 пг/мл) MDA 38 нмоль/1 г Hb (выше 40 нмоль/1 г Hb) SOD 650 ед/мин/1 г Hb (ниже 600 ед/мин/1 г Hb) CAT 0,94 ммоль/с/1 г Hb (ниже 0,8 ммоль/с/1 г Hb)

Согласно изобретению, у больной не прогнозируют тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза. Прогноз благоприятный. Установленный диагноз подтвержден данными клинического наблюдения и инструментальными обследованиями.

Технический результат от реализации предлагаемого способа:

- повышение точности диагностики развития тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза за счет анализа регуляторного звена иммунной системы и ПОЛ-АОЗ;

- возможность ранней диагностики тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза;

- расширение арсенала средств для диагностики тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза.

Таким образом, предложенный высокочувствительный информативный способ позволяет своевременно диагностировать тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза, корректировать план и тактику лечения данной категории больных и улучшать результаты течения заболевания и прогноза.

Источники информации.

1. Гальперин Э.И. Классификация тяжести механической желтухи // Анналы хирургической патологии. - 2012. - т. 17, №2. - С. 26-33.

2. Гальперин Э.И., Ветшев П.С.Руководство по хирургии желчных путей // М: Видар, 2006, 559 с.

3. Патент №2619334 РФ. Способ прогнозирования течения механической желтухи различного генеза. Опубл. 15.05.2017.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза, отличающийся тем, что методом непрямой иммунофлюоресценции в крови определяют абсолютное количество pan-маркеров Т-лимфоцитов и естественных киллеров (NK-клеток), а в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют уровни иммуноглобулина IgG и цитокинов - интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), спектрофотометрическим методом в эритроцитах определяют содержание малонового диальдегида (MDA) и активность дуплекса ферментов супероксиддисмутазы и каталазы (SOD-CAT) и при абсолютном количестве раn-маркеров Т-лимфоцитов ниже 0,47×10⁹/л, NK-клеток ниже 0,14×10⁹/л, уровне IgG выше 5 г/л, ИЛ-10 выше 30 пг/мг, TNF-α выше 2 пг/мл, MDA выше 40 нмоль/1 г Нb, активности SOD ниже 600 ед./мин /1 г Hb, CAT ниже 0,8 ммоль/с/1 г Нb прогнозируют тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза. Изобретение обеспечивает возможность ранней диагностики тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза и повышение точности указанной диагностики. 2 пр.

Способ диагностики тяжелого течения механической желтухи доброкачественного генеза, включающий исследование биологического материала, отличающийся тем, что проводят иммунологическое и биохимическое исследование гепаринизированной венозной крови больных, для этого методом непрямой иммунофлюоресценции в крови определяют абсолютное количество pan-маркеров Т-лимфоцитов и естественных киллеров (NK-клеток), а в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют уровни иммуноглобулина IgG и цитокинов - интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), спектрофотометрическим методом в эритроцитах определяют содержание малонового диальдегида (MDA) и активность дуплекса ферментов супероксиддисмутазы и каталазы (SOD-CAT) и при абсолютном количестве раn-маркеров Т-лимфоцитов ниже 0,47×10⁹/л, NK-клеток ниже 0,14×10⁹/л, уровне IgG выше 5 г/л, ИЛ-10 выше 30 пг/мг, TNF-α выше 2 пг/мл, MDA выше 40 нмоль/1 г Нb, активности SOD ниже 600 ед./мин /1 г Hb, CAT ниже 0,8 ммоль/с/1 г Нb прогнозируют тяжелое течение механической желтухи доброкачественного генеза.