КОМБИНИРОВАННЫЙ КОСТНЫЙ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК A61K35/32 A61L27/24 A61F2/28 

Изобретение относится к области медицины, в частности травматологии-ортопедии, и может быть использовано при лечении больных с травматическими дефектами кости, с несросшимися переломами, ложными суставами, переломами с замедленной консолидацией.

С развитием технического прогресса количество больных, перенесших высокоэнергетическую травму, неуклонно растет. Увеличивается количество больных с открытыми переломами, многооскольчатыми переломами, переломами, сопровождающимися дефектом кости. Несовершенство методов пластики костных дефектов, стимуляция костной регенерации приводят к значительному росту числа несращений и ложных суставов. Так, от 6 до 51,8% случаев переломов длинных трубчатых костей в процессе лечения осложняются несращениями и развитием ложных суставов [О.В. Кудашова, А.Н. Тюрчин, С.А. Тарасов // Применение биокомпозиционного материала «КОЛЛАПАН» в сочетании с концентрированными тромбоцитами в целях ранней профилактики и лечения несращений многооскольчатых переломов длинных трубчатых костей, ложных суставов и остеомиелитов, - Биоматериалы, - 2012, - №15 стр.3].

Один из вариантов лечения таких больных - заполнение травматического костного дефекта или дефекта после резекции костных отломков недеминерализованным губчатым костным аллотрансплантатом. Такой трансплантат обладает механической прочностью, позволяет на его основе произвести репозицию мелких осколков, после чего он достаточно длительный период служит для них опорой. Недеминерализованный костный аллотрансплантат обладает слабым остеоиндуктивным эффектом, процесс консолидации кости существенно не ускоряется. Причиной отсутствия остеостимулирующего эффекта является то, мезенхимальные клетки плохо фиксируются на аллотрансплантате губчатой кости из-за его крупноячеистой структуры и низкой биосовместимости. Длительная биодеградация обусловлена большим объемом недеминерализованной костной ткани. Основным преимуществом такого трансплантата является его механическая прочность - способность выполнять опорную функцию. Однако имеется необходимость в повышении остеокондуктивного и остеоиндуктивного эффекта путем разработки комбинированных костных трансплантатов, обеспечивающих одновременно биосовместимость, механическую прочность и ускорение регенерации костной ткани.

Аналогом предлагаемого комбинированного костного трансплантата может служить композитный (комбинированный) имплантат («Коллапан»), состоящий из синтетического гидроксиапатита, коллагена и антибиотика, который предназначен для лечения травматического костного дефекта или дефекта после резекции костных отломков [Панкратов А.С., Лекишвили М.В., Копецкий И.С. // Костная пластика в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, - М., - БИНОМ, - 2011. - стр.128]. Основными преимуществами «Коллапана» является то, что он обладает остеокондуктивным и остеоиндуктивным эффектами. Составляющие «Коллапана» утилизируются в организме пациента, биодеградируют, при этом создавая необходимые условия для усиления репарации костной ткани в области дефекта кости. Существуют различные формы выпуска имплантатов «Коллапан»: стандартные гранулы, гель, пластины [Снетков А.И. и соавт. // Применение коллапановых имплантатов в детской костной патологии, - Биоматериалы, - 2012, - №14. стр.4]. Главным недостатком всех форм выпуска «Коллапана» является отсутствие механической прочности, т.е. его невозможно использовать в качестве каркаса и опоры при репозиции мелкооскольчатых переломов.

Прототип. Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является недеминерализованный губчатый костный трансплантат, которым заполняют травматический костный дефект или дефект после резекции костных отломков [Bone allografts what they can offer and what they cannot / C. Delloye, O. Comu, V. Druez, O. Barbier // J Bone Joint Surg [Br] 2007; 89-B: 574-9]. Трансплантат обладает достаточной механической прочностью, т.е. способностью выполнять опорную функцию и остеокондуктивным эффектом, т.е. служит проводником для образования собственной кости пациента.

Главным недостатком недеминерализованных трансплантатов является отсутствие остеостимулирующего эффекта, т.е. процесс консолидации кости не ускоряется [Bone allografts what they can offer and what they cannot / C. Delloye, O. Comu, V. Dmez, O. Barbier // J Bone Joint Surg [Br] 2007; 89-B: 574-9]. Биодеградация такого трансплантата занимает длительный период времени. Большие по объему блоки могут рассасываться более года [Ткаченко С.С. Остеосинтез. Руководство для врачей. - ЕЕ Медиа. - 2012. 272 С.]. Причиной отсутствия остеостимулирующего эффекта является то, что мезенхимальные клетки плохо фиксируются в трансплантате и не могут дифференцироваться.

В этой связи предлагается комбинирование недеминерализованной кости аллотрансплантата с коллагеном 1 типа человека, а также с коллагеном 1 типа в сочетании с фибринолитически активной плазмой (ФАЛ) человека или с аллокостной крошкой.

Задача изобретения - модифицировать аллогенный недеминерализованный трансплантат с целью повышения его биосовместимости для обеспечения остеоиндуктивного эффекта.

Достигаемым техническим результатом является получение биосовместимого комбинированного костного трансплантата, обладающего механической прочностью, остеокондуктивным эффектом и стимулирующего остеогенез.

Таким образом, предлагается комбинированный костный аллогенный трансплантат, представляющий собой недеминерализованный костный блок, полученный из губчатой кости донора, и содержащий по всему объему костного блока коллаген 1 типа человека в виде губки с мелкоячеистой структурой, полученной при лиофильной сушке костного блока, пропитанного раствором коллагена.

Костные блоки, предпочтительно, имеют размер 3,0×3,0×1,0 см или 2,0×2,0×1,0 см. Комбинированный костный аллотрансплантат может дополнительно содержать аллогенную костную крошку или биологически активные вещества фибринолитически активной плазмы (ФАП).

Способ получения комбинированного костного аллогенного трансплантата предусматривает изготовление недеминерализованного костного блока из губчатой кости донора, пропитку костного блока раствором коллагена 1 типа человека с последующей лиофилизацией при условиях, обеспечивающих превращение раствора коллагена в губку с мелкоячеистой структурой по всему объему костного блока.

Лиофилизация может быть выполнена, например, по следующей программе: замораживание образцов до температуры -40°C, создание вакуума, поддержание данной температуры в течение 1 часа, повышение температуры до +36°C и выдержка образцов в течение 2 часов при данной температуре.

Костные блоки могут быть изготовлены размером 3,0×3,0×1,0 см или 2,0×2,0×1,0 см.

Пропитка костного блока раствором коллагена может быть осуществлена, например, путем высверливания сквозных отверстий диаметром 2 мм в различных направлениях костного блока с последующим погружением его в 10% раствор коллагена 1 типа человека и прокачивания раствора коллагена сквозь указанные отверстия шприцем, без использования иглы.

Для изготовления трансплантата с сочетанием коллагена 1 типа человека и костной пудры (костной крошки), после пропитки костного блока раствором коллагена осуществляют дополнительную обработку блока, суспензией аллогенной костной крошки, например 10% суспензией костной крошки размером 75-80 мкм, в физиологическом растворе при помощи шприца без использования иглы, поступательно-возвратными движениями.

Для изготовления трансплантата с сочетанием коллагена 1 типа человека и биологически активных веществ ФАП после пропитки костного блока раствором коллагена осуществляют дополнительную обработку блока фибринолитически активной плазмой, например, из расчета 0,5 см³ плазмы на 1 см³ костного блока.

Ниже приводятся примеры, которые служат для иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления предлагаемого комбинированного костного аллотрансплантата и способа его получения.

Способ получения осуществляется следующим образом.

Комбинированный костный трансплантат получают из губчатой кости, заготовленной от донора-трупа. Кости заготавливают на основании Федерального закона Российской Федерации от 21.11.2011 №323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" после признания его пригодным для донорства в соответствии с действующими на территории РФ нормативно-правовыми актами.

Заготовка костей осуществляется в стерильной операционной.

1 этап. Изготовление костного трансплантата, карантинизация.

Выделенные костные фрагменты погружают в 20% раствор глицерина на растворе «Рингер-Локка» (1000 мл). После 20 минут экспозиции костные фрагменты заворачивают в стерильный материал (простынь, клеенка) и помещают в низкотемпературную холодильную установку при температуре -40°C до получения результатов патологоанатомического исследования донора, исследования биологической безопасности тканей донора.

В случае выявления биологической опасности заготовленного биоматериала, он утилизируется в соответствии с Санитарными правилами и нормами СанПиН 2.1.7.728-99 "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 22 января 1999 г. N 2)

Биоматериал, с подтвержденной биологической безопасностью, передается на следующий этап изготовления трансплантата кости.

Костные фрагменты очищают от ткани и с помощью электромеханической пилы распиливают на костные губчатые блоки размерами 3,0×3,0×1,0 см и 2,0×2,0×1,0 см.

Полученные костные блоки погружают в 3% р-р перекиси водорода, помещают в вакуумную камеру и создают давление -2 атм. Далее костные блоки промывают в 0,9% р-р хлористого натрия, этот процесс повторяют 3-4 раза.

Отмытые костные блоки помещают в спирт 96% этанол на 12 часов для обезвоживания при комнатной температуре. Далее для обезжиривания заливают смесью спирт + эфир (в соотношении 1:1) на 24 часа. Этот процесс повторяют еще один раз. Далее костные блоки помещают в р-р эфира на 24 часа. После чего их переносят в стерильный бокс для просушки при температуре +37+38°C.

По завершению данного этапа получают обезжиренные недеминерализованные стерильные костные блоки, готовые для дальнейшего использования.

2 этап. Создание комбинированного костного аллотрансплантата.

Костные блоки пропитывают коллагеном 1 типа человека, а для стимуляции роста клеток сочетанием коллагена с фибринолитически активной плазмой (ФАЛ) или сочетанием коллагена с костной крошкой размером 75-85 мкм.

Для облегчения равномерного заполнения костных блоков раствором коллагена в них в различных направлениях высверливают сквозные отверстия диаметром 2 мм. Затем костные блоки погружают в 10% раствор коллагена 1 типа человека и шприцем, без использования иглы, прокачивают коллаген сквозь эти отверстия.

В целях обеспечения дополнительного ростостимулирующего эффекта, костные блоки, пропитанные коллагеном 1 типа, подвергают дополнительной обработке.

В костной крошке содержится белок BMP (англ. Bone Morphogenetic Protein), стимулирующий регенерацию кости. Костные блоки с коллагеном дополнительно пропитывают при помощи шприца без использования иглы, поступательно-возвратными движениями 10% раствором костной крошки (75-80 мкм) в физиологическом растворе.

ФАП содержит большое количество биологически активных веществ, в том числе PDGF-BB (тромбоцитарный фактор роста тромбоцитов). Костные блоки с коллагеном дополнительно обрабатывают ФАП из расчета 0,5 см³ плазмы на 1 см³ трансплантата.

По завершению данного этапа получают комбинированные (модифицированные) костные аллотрансплантаты, пропитанные коллагеном 1 типа человека, коллагеном 1 типа человека с ФАП или коллагеном 1 типа человека с костной крошкой.

3 этап. Лиофилизация.

Для увеличения срока хранения и упрощения условий хранения продукции комбинированные костные аллогенные трансплантаты (ККАТ) лиофилизируют по специальной программе в автоматической лиофильной сушке. Подбор данной программы осуществлен таким образом, чтобы коллаген превратился в губку по всему объему костного блока. Программа представляет собой последовательное прохождение следующих этапов: замораживание образцов до температуры -40°C, создание вакуума, поддержание данной температуры в течение 1 часа, повышение температуры до +36°C и выдержка образцов в течение 2 часов при данной температуре.

Получают лиофилизированные комбинированные костные аллогенные трансплантаты (ККАТ), готовые к упаковке и стерилизации.

4 этап. Упаковка и стерилизация.

По завершению 3 этапа ККАТ запаивают в двойные пластиковые полипропиленовые пакеты, снабжают временной документацией, в которой указывают номер трансплантата, дату заготовки и срок хранения и отправляют на стерилизацию гамма-лучами. Стерилизация производится при поглощенной дозе 20-25 кГр. Одновременно в партии ККАТ стерилизацию проходят сателлитные образцы размером 0,5*0,5*0,5 см для проведения контроля стерильности и проведения бактериологического обследования. При отрицательном результате бактериологической экспертизы ККАТ могут быть использованы в клинической практике.

Параметры готовой продукции

Получают ККАТ размерами 3,0×3,0×1,0 см или 2,0×2,0×1,0 см с коллагеном 1 типа человека, с коллагеном 1 типа человека и биологически активными веществами ФАЛ, с коллагеном 1 типа человека и костной крошкой.

ККАТ с коллагеном, с коллагеном и ФАЛ, с коллагеном и костной крошкой выдерживают нагрузку в 1400-1700 МПа. При этом жесткость нативных образцов губчатой кости составила 1700-2000 МПа.

В результате лиофилизации раствор коллагена становится губкой с мелкоячеистой структурой, такая мелкоячеистая структура создает дополнительные преимущества для заселения клетками.

Таким образом, трансплантат сохраняет основные механические свойства, способен выполнять опорную функцию, а также обладают остеокондуктивным и остеоиндуктивным эффектами, что проиллюстрировано следующим экспериментом.

В лунки 6-луночного планшета "Costar" помещали фрагменты недеминерализованных костных матриксов и их модификаций. К этим фрагментам добавляли по 5 мл суспензии фибробластов человека в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота "Gibco" из расчета 150×103 клеток на лунку. В контрольных лунках с клетками находился кусочек коллагеновой повязки из коллагена человека 1 типа. Через двое суток проводили оценку витально окрашенных культур клеток с помощью микроскопа Nicon Eclipse 80i при увеличении ×50 и ×200.

Исследовали следующие образцы:

№1. Нативный недеминерализованный матрикс губчатой кости;

№2. НДМК матрикс губчатой кости с коллагеном человека 1 типа;

№3. НДМК матрикс губчатой кости с коллагеном человека 1 типа и с фибринолитически активной плазмой (ФАП);

№4. НДМК матрикс губчатой кости с коллагеном человека 1 типа с добавлением костной пудры.

Результаты

Через 2 суток культивирования фибробласты человека были выявлены на поверхности образцов №2, 3 и 4, образцы №1 не содержали клеток. В образцах №2 содержание прикрепленных клеток на поверхности кости к концу 2-х суток составляло 5-8 тыс/см², в образцах №3 - 16-18 тыс/см², в образцах №4 - 5-7 тыс/см², в контрольных лунках с коллагеном - 14-19 тыс/см². Одновременно с этим во всех лунках количество прикрепленных клеток на стекле (вне кости) составляло 18-20 тыс/см².

Заключение:

1. Исследуемые матриксы биосовместимы с клетками культуры фибробластов человека, что обусловлено отсутствием токсических веществ в исследуемых образцах.

2. На губчатой кости адгезия клеток не происходит, что связано с отсутствием специфических лигандов адгезии в трансплантатах.

3. В образцах №2 и 4 наблюдалась адгезия клеток на трансплантате и их пролиферация, что является подтверждением наличия остеокондуктивного и остеоиндуктивного эффекта.

4. В присутствии образца №3 пролиферативная активность культуры клеток была в 3 раза выше, чем с образцами №2 и 4. Это демонстрирует выраженный ростостимулирующий эффект комбинированного костного аллотрансплантата с ФАП.

Изобретение относится к области медицины, в частности к травматологии-ортопедии, и может быть использовано при лечении больных с травматическими дефектами кости, с несросшимися переломами, ложными суставами, переломами с замедленной консолидацией. Описан комбинированный костный аллогенный трансплантат, представляющий собой недеминерализованный костный блок, полученный из губчатой кости донора, и содержащий по всему объему костного блока коллаген 1 типа человека в виде губки с мелкоячеистой структурой, полученной при лиофильной сушке костного блока, пропитанного раствором коллагена. Описан способ получения комбинированного костного аллогенного трансплантата, предусматривающий изготовление недеминерализованного костного блока из губчатой кости донора, пропитку костного блока раствором коллагена 1 типа человека с последующей лиофилизацией при условиях, обеспечивающих превращение раствора коллагена в губку с мелкоячеистой структурой по всему объему костного блока. Биосовместимый комбинированный костный трансплантат обладает механической прочностью, остеокондуктивным эффектом и стимулирует остеогенез. 2 н. и 10 з.п. ф-лы.

1. Комбинированный костный аллогенный трансплантат, представляющий собой недеминерализованный костный блок, полученный из губчатой кости донора, и содержащий по всему объему костного блока коллаген 1 типа человека в виде губки с мелкоячеистой структурой, полученной при лиофильной сушке костного блока, пропитанного раствором коллагена.

2. Комбинированный костный аллотрансплантат по п.1, в котором костный блок имеет размер 3,0×3,0×1,0 см.

3. Комбинированный костный аллотрансплантат по п.1, в котором костный блок имеет размер 2,0×2,0×1,0 см.

4. Комбинированный костный аллотрансплантат по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий аллогенную костную крошку.

5. Комбинированный костный аллотрансплантат по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий биологически активные вещества фибринолитически активной плазмы (ФАП).

6. Способ получения комбинированного костного аллогенного трансплантата, включающий изготовление недеминерализованного костного блока из губчатой кости донора, пропитку костного блока раствором коллагена 1 типа человека с последующей лиофилизацией при условиях, обеспечивающих превращение раствора коллагена в губку с мелкоячеистой структурой по всему объему костного блока.

7. Способ по п.6, в котором изготавливают костные блоки размером 3,0×3,0×1,0 см.

8. Способ по п.6, в котором изготавливают костные блоки размером 2,0×2,0×1,0 см.

9. Способ по п.п.6-8, в котором лиофилизация представляет последовательное прохождение следующих этапов: замораживание образцов до температуры -40°C, создание вакуума, поддержание данной температуры в течение 1 часа, повышение температуры до +36°C и выдержка образцов в течение 2 часов при данной температуре.

10. Способ по п.6, в котором пропитку костного блока раствором коллагена осуществляют путем высверливания сквозных отверстий диаметром 2 мм в различных направлениях костного блока с последующим погружением его в 10% раствор коллагена 1 типа человека и прокачивания шприцем, без использования иглы, раствора коллагена сквозь указанные отверстия.

11. Способ по п.6, в котором после пропитки костного блока раствором коллагена осуществляют дополнительную обработку блока 10% суспензией аллогенной костной крошки размером 75-80 мкм в физиологическом растворе при помощи шприца без использования иглы поступательно-возвратными движениями.

12. Способ по п.6, в котором после пропитки костного блока раствором коллагена осуществляют дополнительную обработку блока фибринолитически активной плазмой (ФАП) из расчета 0,5 см³ плазмы на 1 см³ костного блока.