Способ прогнозирования развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано для прогноза риска развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника у мужчин старше 45 лет, проживающих в Волго-Уральском регионе России.

Остеопороз - заболевание опорно-двигательной системы, характеризуемое таким состоянием, при котором происходит снижение уровня минеральной плотности костной ткани (МПКТ) и повышение риска переломов [Osterhoff, G. Bone mechanical properties and changes with osteoporosis / G, Osterhoff, E.F. Morgan, S.J. Shefelbine et al. // Injury. - 2016. - V. 47. - P. S11-S20]. У взрослого населения мужского пола остеопороз диагностируют в 20-30% случаев [Sozen, Т. An overview and management of osteoporosis / T. Sozen, L. Ozisik, N.C. Basaran // European Journal of Rheumatology. - 2017. - V. 4. - №1. - P. 46-56].

При остеопорозе нарушается баланс костного ремоделирования в сторону резобрции, снижается скорость остеобластогенеза, что сопровождается постепенным снижением минеральной плотности, а также нарушением пространственной структуры губчатой и кортикальной кости. Это обусловлено неблагоприятными наследственными факторами [Ralston, S. Н. Genetics of osteoporosis / S.H. Ralston, A.G. Uitterlinden // Endocrine Reviews. - 2010. - V. 31. - №5. - P. 629-662] и факторами окружающей среды, образом жизни, этнической принадлежностью и спецификой питания [Souza, G.D. Orthopedist in the osteoporosis diagnosis and treatment / G.D. Souza, M. Passini // Revista Brasileira de Ortopedia. - 2010. - V. 45. - №3. - P. 220-229].

Для диагностики остеопороза используют двухэнергетическую рентгеновскую абсорбциометрию; для расчета 10-летней вероятности перелома - FRAX (Fracture Risk Assessment Tool), Garvan и QFracture [Blake, G. The role of DXA bone density scans in the diagnosis and treatment of osteoporosis / G. Blake, I. Fogelman // Postgraduate Medical Journal. - 2007. - V. 83. - P. 509-51]. Однако, эти диагностические инструменты не эффективны для прогнозирования остеопороза до появления переломов или задолго до начала его манифестации, также, как и не эффективны с точки зрения Прогнозирования переломов отдельных локализаций, что особенно актуально с учетом разной частоты переломов в позвоночнике и шейке бедра, а так высокой зависимости от тендера.

Задачей изобретения является разработка объективного, высокоинформативного метода прогнозирования риска развития переломов позвоночника на основании молекулярно-генетического метода.

Технический результат изобретения - повышение точности прогноза.

Предлагаемый способ прогнозирования развития переломов у мужчин старше 45 лет лиц осуществляется следующим образом.

Выделение геномной ДНК

ДНК из периферической крови выделяют методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, С.G.P. The Isolation of High Molecular Weight Eukaryotic DNA / C.G.P. Mathew // Nucleic Acids. - 1984. - P. 31-34].

Кровь для исследования набирают в пробирки, содержащие антикоагулянт - К2 или К3 соль ЭДТА, и хранят при температуре 4°С не более одной недели.

Для лизиса клеточных мембран и осаждения лейкоцитов к 5 мл крови добавляют 30 мл лизирующего буфера (320 мМ сахарозы, 1% тритон X-100, 5 мМ MDBPl₂, 10 мМ трис-HCl, рН 7,6) и центрифугируют при 4000 об./мин. и 4°С в течение 20 минут.

Надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 20 мл лизирующего буфера и центрифугируют при тех же условиях в течение 10 мин.

К полученному осадку добавляют 800 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl), 80 мкл 10% SDS, 40 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 16 часов.

ДНК экстрагируют в эппендорфах на 2 мл смесью фенол-хлороформа в три этапа, с использованием забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCI, рН 7,8), и хлороформ-изоамилового спирта (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа).

Далее смешивают лизат и растворитель до образования однородной эмульсии, разделение фаз осуществляют центрифугированием при 5000 об./мин в течение 10 мин с последующим отбором водной фазы после каждого этапа.

ДНК осаждают 96% этанолом. Осадок промывают 70% этанолом, подсушивают при комнатной температуре, затем растворяют в 300 мкл деионизированной воды и хранят при температуре -20°С.

Полученный раствор ДНК аликвотируют объемом до 100 мкл в новые пробирки типа эппендорф (600 мкл), и разводят деионизованной водой до концентрации равной 30 нг/мкл.

Концентрацию ДНК и качество полученного раствора оценивают с помощью спектрофотометра NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Проводят генотипирование rs3102734 и rs2073617 гена OPG (остеопротегерина) и rs1712 гена FBXO5 (белка ингибитора митоза). При выявлении полиморфного варианта Т rs3102734 и Т rs2073617 гена OPG, а также уровне минеральной плотности костной ткани в поясничном отделе позвоночника с диагнозом «остеопороз» <2,5 согласно Т-критерию прогнозируется риск развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника с вероятностью в 93,2%.

Для генотипирования rs3102734 и rs2073617 гена OPG и rs1712 гена FBXO5 используют конкурентную аллель-специфичную ПЦР - KASP™

KASP™ является флуоресцентной методикой для точной идентификации биаллельных полиморфизмов типа SNP, вставок/делеций (от 20-200.000 п.о.).

В реакции KASP™ применяют аллель-специфичные праймеры с заданной концевой последовательностью, каждая из которых соответствуют одной из двух FRET (fluorescence resonance energy transfer) - кассет, меченных красителем FAM, или HEX. Распознавание SNP полиморфизма осуществляется за счет конкурентного связывания двух аллель-специфичных прямых праймеров. Использование репортерной системы на основе FRET-кассет исключает применение дорогостоящих меченых зондов и праймеров. Реагенты KASP™ совместимы с любым амплификатором, обеспечивающим детекцию флуоресцентных красителей FAM и HEX, как в режиме реального времени, так и по конечной точке.

Амплификация фрагментов, содержащих полиморфизм осуществляют за счет конкурентного связывания одного или двух аллель-специфичных праймеров, с целевой последовательностью и синтеза новых комплементарных последовательностей за счет универсального обратного праймера.

ПЦР с использованием KASP™ технологии происходит в несколько этапов. В ходе первого цикла аллель-специфичный праймер связывается с комплементарной последовательностью ДНК с целевым SNP - например G. При помощи обратного праймера осуществляют амплификация целевого участка ДНК. В ходе второго цикла обратный праймер связывается, удлиняется и образует комплементарную копию хвостовой последовательности аллеля - 1. В ходе третьего цикла ПЦР FAM-меченный олигонуклеотид связывается с новой хвостовой последовательностью и освобождается от гасителя. В ходе следующих циклов ПЦР увеличивается количество аллель-специфических концевых последовательностей. Флуоресцентно-меченная часть FRET-кассеты комплементарная новой концевой последовательности связывается, высвобождая краситель от гасителя для генерации флуоресцентного сигнала.

На основании независимых оценок точность методики оценивают >99.8%, а наличие двух видов мастер-микса с низким и стандартным количеством флуоресцентных красителей позволяет использовать стандартные приборы для проведения реал-тайм ПЦР, так и более чувствительные - QuantStudio™ 12K Flex.

В качестве приборной базы для KASP™ и TaqMan™ технологии используют амплификатор CFX96 «Termal Cycler 1000» с функцией регистрации продуктов реакции в режиме реального времени, который обладает шестиканальной системой детекции (BioRad) и система для проведения ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific).

Для проведения реакции с использованием реагентов KASP™ используют унифицированный протокол для любого дизайна праймеров, что позволяет стандартизировать используемую методику для работы как с 96 луночными планшетами, так с микро-чипами.

Условия амплификации KASP (BioRad/Quant Studio 12К Flex):

Помимо стандартных красителей FAM и HEX, в реакционной смеси также используют калибровочный краситель ROX, который не ингибирует ПЦР и не влияет на ее специфичность. Использование данного калибровочного красителя позволяет автоматически нормализовать данные, корректируя погрешности, связанные с ошибкой автоматического дозатора и флуктуацией флуоресценции.

Статистическую обработку данных проводят на основании общепринятых методов вариационной статистики с использованием стандартных пакетов Microsoft Excel 2022 и пакет программ PLINK. Для выявления вклада клинических предикторов и взаимосвязи клинических и генетических факторов использован логистический регрессиионный анализ и ROC-анализа для оценки прогностической мощности полученной модели. В качестве клинических предикторов для женщин использованы: индекс массы тела (ИМТ), возраст наступления менопаузы, длительность менопаузы, МПКТ шейки бедра и поясничного отдела позвоночника. В качестве клинических предикторов для мужчин - ИМТ, МПКТ шейки бедра и поясничного отдела позвоночника. Методом пошагового включения в модели клинических предикторов и исключения были отобраны статистически значимые предикторы (р<0,05).

Нами были обследованы ДНК 476 мужчин старше 45 лет (средний возраст 62±10,8). Согласно регрессионной модели, в группе опыта с переломами поясничного отдела позвоночника было обнаружена более высокая частота встречаемости полиморфного варианта Т rs3102734 (k=5,3, р=0,014), Т rs2073617 (k=4,17 р=0,047) гена OPG, Т rs1712 гена FBXO5 (k=-2,9 р=0,023), а также частота низкого уровня МПКТ поясничного отдела позвоночника. Полученные показатели ROC-модели представлены на рисунке 1.

Изобретения иллюстрируются следующим примером.

Пример 1. Пациент Л., 50 лет, проживающий в г. Уфа (Республика Башкортостан, Волго-Уральский регион России) обратился к ортопеду-травматологу с болями в позвоночнике. Диагностирована остеопения, калькулятор FRAX на основе истории семейного анамнеза показывает небольшой 10-летний риск переломов, не было случаев переломов.

Результаты генотипирования: у пациента Л. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенол-хлороформной экстракции, генотипирование локуса rs3102734 и rs2073617 гена OPG и rs1712 гена FBX05 осуществлялось с применением технологии KASP™ на амплификаторе фирмы BioRad. Был выявлен генотип T rs3102734, Т rs2073617 гена OPG и Т rs1712 гена FBXO5, которые, при сочетании с низким уровнем МПКТ поясничного отдела позвоночника, прогнозируют риск переломов поясничного отдела позвоночника у мужчин старше 45 лет с эффективностью в 93,2%. В дальнейшем у пациента был диагностирован низкотравматический перелом L5 (пятого поясничного позвонка) путем проведения компьютерной томографии поясничного отдела позвоночника.

Вывод: учитывая высокий генетический риск плоскостопия у пациента, были предложены превентивные мероприятия, включающие терапию аминобисфосфонатами, уменьшение нагрузки на позвоночник, индивидуальный комплекс упражнений и скорректированный рацион.

Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано для прогнозирования риска развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника у мужчин старше 45 лет, проживающих в Волго-Уральском регионе. Из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК. Проводят генотипирование полиморфных вариантов rs3102734 и rs2073617 гена OPG и rs1712 гена FBXO5 методом полимеразной цепной реакции. Измеряют уровень минеральной плотности костной ткани в поясничном отделе позвоночника. При выявлении полиморфных вариантов Т rs3102734, Т rs2073617 гена OPG, Т rs1712 гена FBXO5 и уровня минеральной плотности костной ткани в поясничном отделе позвоночника <2,5 согласно Т-критерию прогнозируют риск развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника. Способ обеспечивает повышение точности прогноза риска развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника за счет генотипирования полиморфных вариантов генов OPG и FBXO5 и измерения уровня минеральной плотности костной ткани в поясничном отделе позвоночника мужчин старше 45 лет. 1 ил., 1 пр.

Способ прогнозирования риска развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника у мужчин старше 45 лет, проживающих в Волго-Уральском регионе, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование полиморфных вариантов rs3102734 и rs2073617 гена OPG и rs1712 гена FBXO5 методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, измерение уровня минеральной плотности костной ткани в поясничном отделе позвоночника, и при выявлении полиморфных вариантов Т rs3102734, Т rs2073617 гена OPG, Т rs1712 гена FBXO5 и уровня минеральной плотности костной ткани в поясничном отделе позвоночника <2,5 согласно Т-критерию прогнозируют риск развития остеопоретических переломов поясничного отдела позвоночника у мужчин старше 45 лет.