ИНГИБИТОР АНДИЙСКОГО ВИРУСА КРАПЧАТОСТИ КАРТОФЕЛЯ Российский патент 2014 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N9/02 

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в агробиотехнологии, микробиологии и растениеводстве.

Известен ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа (1), известен ингибитор вируса иммунодефицита человека (2). В качестве ингибитора использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - гомогенный фермент L-лизин-α-оксидаза.

В связи с ввозом в Россию большого количества импортного материала картофеля, существует опасность заражения здоровых растений картофеля Андийским вирусом крапчатости картофеля. Также большой риск распространения зараженного картофеля связан с увеличением международного обмена семенным и генетическим материалом как в форме клубней, так и в культуре in vitro и истинных семенах (3, 4).

Андийский вирус крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) широко распространен в высокогорье Анд в Чили, Эквадоре и Перу, а также в Бразилии. Он поражает главным образом картофель, однако может встречаться на баклажанах и некоторых других пасленовых культурах (3, 5).

Описание ингибиторов Андийского вируса крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) не обнаружено.

Техническим результатом изобретения является снижение потерь от заражения растений картофеля Андийским вирусом крапчатости картофеля.

Технический результат достигается тем, что предлагается применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.

Штамм является известным (6), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1. Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г.Пущино).

Использовали ферментёр типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г. Кириши, объёмом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментёр оснащён магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор-0,1 %, 1,3% сульфата аммония, значение рН 5,8-6,0 устанавливали 10% раствором НСl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t° +125°C. Затем подготовленный ферментёр засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину рН в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения рН от 5,3 до 7,5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин, в течение часа при температуре +2 - +4°С. Затем нативный раствор в объёме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Рибонуклеиновую кислоту (РНК) Андийского вируса крапчатости картофеля выделяли из положительного контроля (фирма DSMZ, Германия). Образцы растирали в фарфоровой ступке до гомогенного состояния с добавлением лизирующего буфера из набора «Проба НК», фирма OOO «Агродиагностика». Из предварительно приготовленных образцов выделяли РНК с использованием наборов «Проба НК», фирмы OOO «Агродиагностика», по протоколу из набора.

Для постановки обратной транскрипции (ОТ) в пробирки была добавлена следующая смесь для ОТ: ОТ-буфер AMV фирмы «Promega» (250 mM Трис-HCl, 250 mM KCl, 50 mM MgCl₂ 2,5 mM spermidine, 50 mM DTT) - 5 µl смесь дНТФ фирмы ЗАО «Диалат ЛТД» (дА, дТ, дГ, дЦ - по 200 µМ каждого) - 2,5 µl, РНазин - 40 ед. (1 µl), ревертаза AMV фирмы «Promega» (10 U/µl) - 3 µl, вода до общего объема 20 µl, РНК образца - 5 µl. Реакция обратной транскрипции (процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК) происходил при t° +42°С в течение 1 часа, при t° +95°С - 5 минут.

На этапе обратной транскрипции к выделенной и очищенной РНК вируса Андийского вируса крапчатости картофеля был добавлен концентрат культуральной жидкости в разных разведениях (от 5 до 0,025 Ед/мл). Далее для реакции амплификации готовили следующую смесь: 10x MagMIX - 2025 фирмы ЗАО «Диалат-ЛТД» - 2,5 µl на образец, праймеры АРМУ прямые и обратные - по 2 µl (10 ρmol/µl) на образец, кДНК - 5 µl, вода до 25 µl, минеральное масло. В результате выделена комплементарная-дезоксирибонуклеиновая кислота (кДНК). Для получения продуктов реакции (ампликонов) проводили нагревание смеси по следующей схеме: один цикл при t° +96°С в течение 15 минут, 30 циклов при t° +96°С в течение 30 секунд, при t° +65°С в течение 30 секунд и при t° +72°С в течение 30 секунд; один цикл при t° +72°С в течение 10 минут. Хранение осуществляли при t° +4°С. Полученные ампликоны (многократно увеличенное число копий изучаемого участка кДНК) вносили в 1,5% агарозный гель, после чего получали электрофореграммы и оценивали полученные результаты.

Пример 1.

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в концентрациях 1 Ед/мл, 2,5 Ед/мл и 5 Ед/мл. Также был взят контрольный образец кДНК, в который не был добавлен фермент. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации 1 Ед/мл и более кДНК вируса разрушается, при этом не наблюдается образования темной полосы.

Пример 2.

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в разных концентрациях (1, 0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл). Также был взят контрольный образец кДНК без добавления фермента. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации более 1 Ед/мл кДНК вируса разрушалось, при этом не наблюдалось образования темной полосы. При большем разведении фермента (0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл) вирусная кДНК сохраняется и наблюдается темная полоса.

Источники информации

1. Ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа. Патент РФ № 2022012, 1994. Алексеев С.Б., Берёзов Т.Т., Анджапаридзе О.Г. и другие.

2. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2022011, 1994. Алексеев С.Б., Веса B.C., Смирнова И.П. и другие.

3. ЕРРО. Phytosanitary procedures PM 3/21 (2). Post-entry quarantine for potato // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2004, vol.34, p.443-454.

4. Fribourg, C.E.; Jones, R.A.C.; Koenig, R. (1979) Andean potato mottle virus. CMI / AAB Descriptions of Plant Viruses No.203. Association of Applied Biologists, Wellesboume, UK.

5. Salazar, L.F.; Harrison, B.D. Particle properties and strains of Andean potato mottle virus. Journal of General Virology, 1978, 39, 171-178.

6. Смирнова И.П., Берёзов Т.Т., Чекунова Л.Н. Штамм Trichoderma harzianum Rifai продуцент L - лизино-α-оксидазы. Авторское свидетельство. 1991 г., №1044043.

Изобретение относится к области биохимии и касается применения концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля. Изобретение позволяет снизить потери картофеля от заражения растений Андийским вирусом крапчатости. 2 пр.

Применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.