РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ШТАММА Trichoderma harzianum Rifai Российский патент 2014 года по МПК C12N1/14 A61K39/02 A61P17/02 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, ветеринарии, косметологии и предназначено для заживления раневых повреждений кожи.

Известен ранозаживляющий пробиотический препарат, включающий культуры бактерий Bacillus subtilis и Lactobacterium plantarum (Патент РФ №2401116). Недостатком препарата является многокомпонентность используемых культур и сложность приготовления средства.

Известен ингибитор вируса герпеса простого 1-ного типа (Патент РФ №2022012, 1994), известен ингибитор вируса иммунодефицита человека (Патент РФ №2022011,1994). В качестве ингибиторов использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - ВКПМ F-180-гомогенный фермент L-лизин-а-оксидаза (Патент РФ №2022011, 1994). Сведения о ранозаживляющем свойстве данного препарата отсутствуют.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для заживления ран, возникающих при повреждении кожного покрова.

Технический результат достигается тем, что в качестве ранозаживляющего средства при повреждении кожного покрова, применяют концентрат культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180.

Данный штамм является известным (Авторское свидетельство №1044043, 1991 г.), однако впервые обнаружено неизвестное из уровня техники свойство, обеспечивающее применение концентрата культуральной жидкости данного штамма в качестве средства для заживления раневых повреждений кожи.

Например, возможно создание мазевой композиции как ранозаживляющего средства, предназначенного для лечения раневых повреждений кожи.

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 и получение концентрата культуральной жидкости.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г.Пущино). Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г.Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и pH. Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение pH 5.8-6,0 устанавливали 10% раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при температуре +125°C.

Подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°C, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину pH в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания 94-98 часов, конечные значения pH от 5,3 до 7.5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об./мин, в течение часа при температуре +2-4°C. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Полученный концентрат культуральной жидкости с активностью L-лизин-α-оксидазы 5,4 Ед/мл представляет собой непрозрачную жидкость светло-желтого цвета со слабым грибным запахом, стабильную при хранении. L-лизин-α-оксидаза, белок, ненасыщенные жирные кислоты, моно- и дисахара, крахмал, клетчатка, органические кислоты, витамин B1, витамин B2 (придает окраску), витамин PP, железо, калий, кальций, магний, натрий, фосфор, нитрат натрия.

Условия создания ранозаживляющего средства

Выбор оптимального количества концентрата культуральной жидкости штамма, обеспечивающей достаточный противовоспалительный и ранозаживляющий эффекты, основывался на проведенных ранее исследованиях, целью которых являлось определение активности фермента L-лизин-α-оксидазы на животных (лабораторные морские свинки). Для разработки состава и технологии геля изготовлены модельные образцы с 1%-концентрацией фермента.

Выбор структурообразующих компонентов для изготовления геля осуществлен с учетом терапевтических, технологических и потребительских требований, предъявляемых к препаратам этой группы (Семкина О.А., Джавахян М.А., Левчук Т.А., Охотникова В.Ф. Вспомогательные вещества, используемые в технологии мягких лекарственных форм (мазей, гелей, линиментов, кремов) // Химико-фармацевтический журнал, Т.39, №9, 2005. - С.45-48; Семкина О.А., Суслина С.Н. Краснюк И.И. Обоснование состава геля Эвкалимина на основе сравнительного изучения реологических параметров редкосшитых акриловых полимеров. // Вестник Российского университета дружбы народов, серия "Медицина", специальность "Фармация", №4 (28), 2004. С.216-222). В качестве основ для геля выбраны гидрофильные основы редкосшитых акриловых полимеров (мАРС и Карбопол) и производных метилцеллюлозы (МЦ).

Таким образом, в результате комплекса физико-химических, биологических и реологических исследований разработан следующий состав геля с L-лизин-α-оксидазой. Состав ранозаживляющего средства, мас.%:

Пример №1

Карбопол (974 Р NF)

Европейская фармакопея 2001 г. ст.«Carbomers» 0,8 Концентрат культуральной жидкости с   L-лизин-α-оксидазной активностью 5,4 Ед/мл 0,8 Раствор натрия гидроксида (30%) (ГОСТ 4328-77) до pH 6,0-6,5 Вода очищенная (ФС 42-2619-97) до 100,0

Пример №2

Карбопол (974 Р NF)

Европейская фармакопея 2001 г. ст.«Carbomers» 1,2 Концентрат культуральной жидкости с   L-лизин-α-оксидазной активностью 5,4 Ед/мл 1,2 Раствор натрия гидроксида (30%) (ГОСТ 4328-77) до pH 6,0-6,5 Вода очищенная (ФС 42-2619-97) до 100,0

Изготовление геля начинают с подготовки ранозаживляющего вещества и основы. В операцию подготовки основы входит процесс растворения и набухания, а также регулирование значения pH с помощью гидроксида натрия.

Изготовление основы “РАП: вода”. В производственную емкость отмеривают рассчитанное количество воды очищенной. Порошок РАПа (карбопол) наслаивают на поверхность воды и оставляют набухать в течение 1 часа, затем систему перемешивают с помощью механической мешалки (ЭКРОС-8100) со скоростью 100-120 об./мин до получения гомогенного геля. После этого при постоянном перемешивании добавляют рассчитанное количество натрия гидроксид, для получения заданного значения pH среды (5,5-6,5). Введение нейтрализующего агента приводит к загущению системы и повышает уровень вязкости. Ингредиенты тщательно перемешивают с помощью высокоскоростной мешалки (ЭКРОС-8100). Полученный гель оставляют до полного завершения структурообразования в течение 4-6 ч.

Изготовление геля с концентратом культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai-F-180 и исследование ранозаживляющего средства.

Культуральную жидкость (концентрат к.ж.) вносят в полученную основу геля и гомогенизируют на лопастной мешалке (ЭКРОС-8100, 120 об./мин) в течение 10 минут. Проведен опыт на 20 морских свинках, самцах, массой 320±15 г (табл.). Установлено, что гель с концентратом культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai-F-180 (1%) оказывает ранозаживляющее действие, сокращая средние сроки заживления ран у животных на 5,4 дня по сравнению с контрольной группой (без лечения) и на 4,2 дня по сравнению с плацебо геля соответственно.

Из данных таблицы видно, что разница в сроках излечения животных, относящихся к разным опытным группам, достоверна.

Таблица Сроки заживления ран (в сутках) Форма препарата Животных в группе Время заживления раны, (сутки) t₁ t₂ t_п t_к Контроль без лечения (к) 5 12,0±0,4 (11,6÷12,4) 5,4 3,4 1,2 - Гель с L-лизин-α-оксидазой 1% на карбополе(1) 5 6,60±0,48 (6,12÷7,08) - -2 -4,2 -5,4 Гель с L-лизин-α-оксидазой 1% на фосфолипидной основе (2) 5 8,60±0,48 (8,12÷9,02) 2 - -2,2 -3,4 Гель карбопола (без добавления L-лизин-α-оксидазы)(п) 5 10,80±0,32 (10,48÷11, 12) 4,2 2,2 - -1,2

Примечание: t₁ - время заживления ран с использованием геля с 1% L-лизин-α-оксидазой на карбополе;

t₂ - время заживления ран с использованием геля с 1% L-лизин-α-оксидазой на фосфолипидной основе;

t_п - время заживления ран на карбополе без L-лизин-α-оксидазы;

t_к - время заживления ран (контроль) без лечения.

Полученные результаты экспериментальных исследований показали высокую ранозаживляющую активность геля с 1% концентратом культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai-F-180.

Предлагаемое ранозаживляющее средство оказывает выраженный ранозаживляющий эффект, способствует более раннему заживлению раны у животных и может применяться при наличии гнойно-некротических масс в ране в ветеринарии.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при заживлении раневых повреждений кожного покрова. Ранозаживляющее средство представляет собой концентрат культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ: F-180, в качестве продуцента L-лизин-альфа-оксидазы и может быть применен как ранозаживляющее средство при повреждении кожного покрова. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, обеспечивающих заживление раневых повреждений кожи. 1 табл., 2 пр.

Применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве ранозаживляющего средства при повреждении кожного покрова.