ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА ВОЗБУДИТЕЛЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЯТНИСТОСТИ ТЫКВЕННЫХ КУЛЬТУР (Acidovorax citrulli) Российский патент 2014 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12R1/885 

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в агробиотехнологии, микробиологии и растениеводстве.

Известен ингибитор вируса герпеса простого I-ого типа (Ингибитор вируса герпеса простого I-го типа. Патент РФ №2022012, 1994.), ингибитор вируса клещевого энцефалита (Ингибитор вируса клещевого энцефалита. Патент на изобретение №2473689, 2013), вируса некротической пятнистости бальзамина (Продуцент ингибитора вируса некротической пятнистости бальзамина. Патент на изобретение №24813923, 2013). В качестве ингибитора использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - экстракт культуральной жидкости продуцента фермента L-лизин-а-оксидаза.

В последние годы фитосанитарные службы разных стран обеспокоены появлением и быстрым распространением опасного заболевания - бактериальной пятнистости тыквенных культур, вызываемого бактерией Acidovorax citrulli. Карантинный статус данного возбудителя для Российской Федерации не определен, но в связи с опасностью его завоза с семенным материалом, большими потерями урожая в странах распространения и широким кругом поражаемых культур, возделываемых на территории нашей страны, он представляет определенный интерес. Данный возбудитель приводит к значительным потерям урожая. При раннем заражении растений потери могут составлять до 100% (Feng, J.J., Li, J.Q., Walcott, R.R., Zhang, G.M., Luo, L.X., Kang, L., Zheng, Y. and Schaad, N.W. (2013). Seed Sci. & Technol., 41, 1-15).

Наиболее чувствительными к возбудителю бактериальной пятнистости являются арбуз (Citrullus lanatus) и дыня (Cucumis melo). Бактериоз также поражает огурцы (Cucumis sativus), разные виды тыкв (Cucurbita pepo, С. moschata), патиссоны (Cucurbita pepo var. patisoniana), кабачки (Cucurbita pepo var. giromontina), бетель (Piper betle - семейство перечные).

Искусственно могли быть заражены растения семейства пасленовые: перец (Capsicum spp.), томаты (Lycopersicon esculentum), баклажан (Solanum melongena) (EPPO (2011a). Acidovorax citrulli- Bacterial fruit blotch of cucurbits. EPPO Alert list).

Возбудитель заболевания попадает в поле с зараженными семенами, из которых получают рассаду с характерными повреждениями на семядольных листьях. В случае скрытой зараженности растения могут оставаться незамеченными в поле. Влажная и теплая погода, орошение дождеванием, травмирование растений, несоблюдение фитосанитарных условий в поле или теплице способствуют развитию болезни и переносу возбудителя на соседние здоровые растения. Бактерии Acidovorax citrulli с листьев попадают на формирующиеся плоды, которые могут поражаться на ранней стадии развития. Плоды наиболее чувствительны к возбудителю в возрасте 2-3 недель, до образования воскового слоя. Через несколько дней повреждения на плодах становятся видимыми и на их поверхности появляются трещины. Пораженные плоды гниют в поле, в результате чего их зараженные семена, которые являются источником заболевания, попадают в почву (Каримова Е.В. Новое бактериальное заболевание тыквенных культур - Защита и Карантин растений, 2012 №6, С.35-36).

Техническим результатом изобретения является снижение потерь тыквенных культур, вызванных возбудителем бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli.

Технический результат достигается тем, что в качестве продуцента ингибитора возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli используют штамм Trichoderma harzianum Rifai. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1 Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Морфолого-биохимическая характеристика штамм

Штамм Trichoderma harzianum Rifai на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный, распростертый. На 4-е - 5-е сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желто- или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12µ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5µ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные.

На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агаре. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует. Аэробный гриб. Температурный оптимум +28 - +29°С. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при pH 4-6, однако, может расти и при pH от 1,5 до 9.

Trichoderma harzianum Rifai в одинаковой степени усваивает как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, дает положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai обладает L-лизин-α-оксидазной активностью. Активность L-лизин-α-оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai рассчитывали по приросту H₂O₂, количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазидиновым микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции Н₂О₂ с O-дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг O-дианизидингидрохлорида и 0,1-0,5 мг белка в 1 мл конечного объема. После 20 минут инкубирования в термостате при температуре +37°С пробы охлаждали до +4°С. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мл культуральной жидкости.

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г. Пущине).

Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г. Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и pH.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате по технологии, разработанной ранее (Смирнова И.П., и др. Технология выделения и очистки L-лизин-α-оксидазы, Биотехнология, 2010, №6, с.52-60). Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор-0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение pH 5.8-6,0 устанавливали 10%-ным раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t° +125°C. Затем подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину pH в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения pH от 5,3 до 7,5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин. в течение часа при температуре +2 - +4°С. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Активность полученного экстракта из культуры Trichoderma harzianum Rifai составляла 5,4 Ед/мл.

Возбудитель бактериальной пятнистости тыквенных культур - бактерия Acidovorax citrulli, была получена в виде чистой культуры из бактериологической коллекции Института сельскохозяйственных исследований (Ivia), Испания, Валенсия. После чего для идентификации полученной культуры проводили секвенирование участка гена 16S рРНК длиной 500 п.н., амплифицируемого универсальными праймерами 8UA_519B.

Для постановки опыта по определению ингибирующего действия экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai на бактерию Acidovorax citrulli использовали метод диффузии в агар. В качестве питательной среды использовали среду Кинг В.

Среда Кинга В (по данным King et al., 1954)

Пептон 20 г Глицерин 10 мл K2HPO4 1,5 г MgSO4×7H2O 1,5 г Агар 15-20 г Дистиллированная вода До 1 л pH 7,0-7,2  

Стерилизовали автоклавированием при температуре +121°С в течение 15 минут.

В чашки Петри наливали питательную агаровую среду в количестве 20-30 мл и давали ей застыть. Посев культур на чашки Петри проводили путем нанесения одной петли чистой культуры бактерий на питательную среду и равномерного ее распределения растиранием по поверхности агаровой среды с помощью стеклянного шпателя Дригальского.

Для размещения экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai готовили лунки, для чего в застывшей среде с поверхностно нанесенной культурой стерильным сверлом диаметром 10 мм просверливали необходимое количество лунок глубиной около 5 мм, после чего вносили экстракт в лунки на 1 мм ниже уровня среды (по 200 мкл в лунку). В лунки контрольных чашек вносили стерильную дистиллированную воду.

Приготовленные чашки Петри с образцами и контрольные чашки Петри помещали в термостат (температура +37°С). Образцы выдерживали в термостате 1-3 суток, отмечая интенсивность роста бактерий на чашках, замеряя зоны угнетения их роста и делая записи в журнале.

Ингибирующее действие экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai против Acidovorax citrulli определялась по степени подавления роста чистой культуры возбудителя на питательной среде.

Измерение зоны подавления роста культуры проводили через 24 часа после постановки опыта и далее наблюдали изменения в течение 3-х суток.

Ингибирующее действие экстракта штамма Trichoderma harzianum Rifai определяли по степени подавления роста чистой культуры возбудителя на питательной среде. Опыт проводили в трех повторениях: в опытные чашки в лунки вносили экстракт штамма Trichoderma harzianum Rifai. В контрольную чашку в лунки вносили стерильную дистиллированную воду. Через 24 часа после поверхностного посева культуры Acidovorax citrulli на питательную среду и внесения экстракта в лунки в опытных чашках наблюдали зоны подавления роста культуры возбудителя вокруг лунок. Радиус зон подавления составлял 5-8 мм. На остальной поверхности чашки наблюдался рост культуры возбудителя без признаков угнетения. На контрольной чашке, на всей поверхности среды наблюдался активный рост культуры возбудителя заболевания, без признаков подавления. Это указывает на то, что экстракт штамма Trichoderma harzianum Rifai оказывает ингибирующее действие на возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Штамм Trichoderma harzianum Rifai депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-180. Штамм обладает способностью продуцировать L-лизин-альфа-оксидазу и может быть использован, в частности, в качестве ингибитора возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур, вызываемых бактериями Acidovorax citrulli. Изобретение позволяет снизить потери тыквенных культур.

Применение штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве продуцента ингибитора возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур (Acidovorax citrulli).