ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА МИКОПЛАЗМЫ (Mycoplasma hominis) Российский патент 2015 года по МПК C12N1/14 A61K36/06 C12R1/85 

Изобретение относится к медицине, биохимии, фармакологии и может найти применение в биотехнологии, микробиологии.

Mycoplasma hominis является условно-патогенным микроорганизмом, обитает в урогенитальном тракте (УГТ) человека, причастна, по данным ряда авторов, к развитию хориоамнионита, внутриутробной патологии плода, развитию бактериального вагиноза и других патологических состояний УГТ. Описаны случаи выделения этой микоплазмы из абсцесса головного мозга, при пневмонии, при перикардите, эндокардите, раневой инфекции (Раковская И.В. Микоплазмы - возбудители микоплазменных инфекций человека. В кн. Руководство по медицинской микробиологии / Под ред. А.С. Лабинской и др. М.: БИНОМ, 2010, с. 964-993).

Для лечения микоплазменных инфекций используют антибиотики широкого спектра действия: чаще всего антибиотики тетрациклинового ряда (диоксициклин, миноциклин) и макролиды (джозамицин, клиндомицин, мидекамицин, рокситромицин). Однако известно, что многие штаммы микоплазм, обитающие в урогенитальном тракте, резистентны к тетрациклинам и макролидам. В таких случаях рекомендуется использовать хинолоны: левофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксанцин. Но в настоящее время от пациентов выделяют штаммы, устойчивые и к хинолонам. Показано также, что эффективность антибиотиков зависит от состояния иммунной системы. Для пациентов с иммунодефицитом рекомендуют вводить антибиотики внутривенно и обязательно после определения чувствительности к ним выделенной микоплазмы. Часто требуется продолжительная терапия. В связи с этим ведущие микоплазмологи считают, что радикальных средств для лечения микоплазменных инфекций в настоящее время нет (Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: Sophisticated, Reemerging, and Burdened by Their Notoriety. Emerging Infect. Diseases. 1997, Vol 3, №1, P. 21-32.).

Известен штамм Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 (патент RU 2493247). Сведения о применении штамма в качестве продуцента ингибитора роста Mycoplasma hominis отсутствуют.

Техническим результатом изобретения является подавление роста Mycoplasma hominis.

Технический результат достигается тем, что в качестве продуцента ингибитора роста Mycoplasma hominis применяют штамм Trichoderma harzianum Rifai. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д. 1 Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Морфолого-биохимическая характеристика штамма.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai на среде сусло-агар образует колонии быстрорастущие. Мицелий гриба бесцветный, септированный, распростертый. На 4-е - 5-е сутки роста появляются дерновинки с конидиеносцами, подушковидные, сначала белые, со временем желто- или темно-зеленого цвета. Фиалиды бутыльчатые /9-12µ/, расположены мутовками по 3 и более. На каждой фиалиде образуются конидии, склеенные в головку. Конидии гриба округлые, гладкие, мелкие /3-5µ/, в проходящем свете бледно-зеленые, а в массе - темные.

На агаризованной среде Чапека колонии штамма-продуцента быстрорастущие, но слабо спороносящие. Штамм хорошо растет на среде Чапека, однако лучший рост наблюдается на среде сусло-агар. Агар и желатину не разжижает, молоко не пептонизирует. Аэробный гриб. Температурный оптимум +28-+29°C. На картофельно-декстрозном агаре наблюдается снижение интенсивности роста, образование воздушного мицелия и спороношения. Оптимальные условия роста гриба при pH 4-6, однако, может расти и при pH от 1,5 до 9.

Trichoderma harzianum Rifai в одинаковой степени усваивает как аммонийные, так и азотнокислые соли. Лучшим источником азота из органических соединений является пептон. Хорошо растет на средах с аспарагином и с глутаминовой кислотой. Лучшими источниками углерода являются ксилоза, глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, маннит, крахмал. На средах с этими сахарами наблюдается интенсивный рост. Слабо усваиваются спирты - метиловый, этиловый, дульцит. Хорошо усваивает в качестве источника углерода пшеничные отруби. Инокулят гриба, выросший на среде с пшеничными отрубями, дает положительный результат при использовании его при ферментации на средах разного состава.

Штамм Trichoderma harzianum Rifai обладает L-лизин-α-оксидазной активностью. Активность L-лизин-α-оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai рассчитывали по приросту H₂O₂, количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазидиновым микрометодом. Сущность метода заключается во взаимодействии всей образующейся в реакции H₂O₂ с О-дианизидингидрохлоридом. Инкубационная смесь содержала 20 мкг пероксидазы, 250 мкг О-дианизидингидрохлорида и 0.1-0,5 мг белка в 1 мл конечного объема. После 20 минут инкубирования в термостате при температуре +37°C пробы охлаждали до +4°C. Оптическую плотность окрашенных растворов опытной и контрольной (без субстрата) проб измеряли на спектрофотометре СФ-16 при 540 нм против второй контрольной пробы (без пероксидазы).

Активность L-лизин-α-оксидазы рассчитывали по приросту H₂O₂ и выражали на 1 мл культуральной жидкости.

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г. Пущино).

Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г. Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и pH.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение pH 5.8-6,0 устанавливали 10%-ным раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t°+125°C. Затем подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°C, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину pH в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения pH от 5,3 до 7.5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин в течение часа при температуре +(2-4)°C. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Активность полученного концентрата культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai составляла 0,54 Ед/мл.

В работе использовали вид микроорганизма класса Mollicutes:

Mycoplasma hominis (Mh). Штамм M.hominis H-34 был получен в 1967 г. из коллекции доктора Lemke R.M. (Lister Inst. Preventive medicine, London S.W.I.). Штамм хранится и поддерживается в лаборатории микоплазм и L-форм бактерий ФГБУ НИИЭМ имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи.

Для выращивания штамма Mycoplasma hominis использовали бульон (Difco PPLOBroth, Becton, Dickinson, USA) с 20% сыворотки крови лошади, 2% свежего дрожжевого экстракта, 1% аргинина или 1% глюкозы (в зависимости от пищевых потребностей вида микоплазм) и 0,005% индикатора фенолово-красного. Для титрования культур делали серийные десятикратные разведения пробы в физиологическом растворе с высевом материала из всех разведений на 0,3% агар (BBL Mycoplasma Agar Base, Becton, Dickinson, USA) с такими же добавками, как в бульоне. Спустя трое суток подсчитывали число колоний в двух последних пробирках из ряда разведений и высчитывали средний показатель числа колоний. Титр культур выражали средним числом выросших колоний, помноженным на разведение культуры. В опыт брали культуры с установленным ранее титром.

Опыты по определению чувствительности микоплазм к концентрату культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai проводили по следующей схеме. В пробирки вносили 1 мл бульонной культуры микоплазм с известным титром, затем соединяли с 1 мл культуральной жидкости с активностью L-лизин-α-оксидазы 0,54 Ед/мл в разведениях 1:10 и 1:100 и 0,1 мл культуры микоплазмы с известным титром. Смеси выдерживали в течение 45 мин при комнатной температуре, затем заливали жидкой питательной средой и культивировали в течении 3 суток, наблюдая за скоростью и интенсивностью роста по изменению цвета культуральной среды. Титр клеток микоплазмы в опытной и контрольной пробирке определяли описанным выше способом.

Из данных таблицы видно, что в присутствии культуральной жидкости продуцента L-лизин-α-оксидазы скорость роста Mycoplasma hominis, регистрируемая по изменению цвета среды, была снижена, особенно при низкой посевной дозе. При определении титра КОЕ/мл наблюдали полное подавление роста при контакте клеток микоплазмы с неразведенной культуральной жидкостью триходермы с активностью L-лизин-α-оксидазы 0,54-0,56 Ед/мл даже при высокой посевной дозе. Десятикратное разведение исходной культуральной жидкости триходермы также подавляло рост микоплазм, но в меньшей степени - на 3 Lg. При использовании меньшей посевной дозы микоплазм рост также был подавлен полностью при контакте с культуральной жидкостью продуцента

фермента. Использование десятикратного разведения ее в опытных пробирках приводило к росту лишь единичных колоний.

Титр КОЕ/мл культур Mh был ниже в сравнении с контролем на 3 Lg и 1 Lg (соответственно) при высокой посевной дозе культуры и разных концентрациях культуральной жидкости продуцента L-лизин-α-оксидазы. При более низкой посевной дозе и разных концентрациях культуральной жидкости исследуемого штамма -продуцента фермента титр КОЕ выросшей культуры различался на 3 и 2 Lg соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований, полученные данные свидетельствуют о том, что культуральная жидкость Trichoderma harzianum Rifai F-180 способна ингибировать рост Mycoplasma hominis, которая наглядно проявляется после предварительного контакта микоплазм и культуральной жидкости триходермы. Степень подавления роста зависит от посевной дозы микоплазм и используемой концентрации культуральной жидкости триходермы.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Штамм Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 применяется в качестве продуцента ингибитора Mycoplasma hominis и может быть использован при лечении микоплазменных инфекций. Изобретение позволяет ингибировать рост Mycoplasma hominis. 1 табл.

Применение штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 в качестве продуцента ингибитора микоплазмы Mycoplasma hominis.