СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА БЛЮТАНГА НУКЛЕОТИПА В (3, 13 И 16 СЕРОТИПЫ) МЕТОДОМ ОТ-ПЦР Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК вируса блютанга генетической группы (нуклеотипа В), объединяющей 3, 13 и 16 серотипы.

Известно, что вирус блютанга (ВБ) генетически высоко гетерогенен, по данным на 2012 г. выделяют 25 (1-24, 26) серотипов [9] и один генетический вариант, так называемый «25 серотип» - Toggenburg orbivirus [7, 8]. Детерминирует серотип в основном VP2 белок, который содержит большинство нейтрализующих эпитопов вируса [1, 2, 4].

С 2009 г. за рубежом для идентификации серотипа ВБ начали широко применять средства, основанные на ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ОТ-ПЦР РВ), что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип [6].

Целью являлась разработка пары олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга нуклеотипа B методом ОТ-ПЦР.

Изобретение - олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа B, а именно участка нуклеотидной последовательности 2 сегмента генома вируса блютанга 3, 13 и 16 серотипов методом ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Процедура анализа включает следующие этапы:

1. Денатурация дцРНК вируса блютанга.

2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.

3. ПЦР.

4. Электрофоретическая детекция продуктов амплификации.

Денатурацию дцРНК осуществляют при температуре 95°C в течение 5 минут в реакционной смеси с нуклеотипспецифической парой олигонуклеотидных праймеров, фиксируют денатурированную РНК путем замораживания. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 30 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). Затем реакцию терминируют при 88°C в течение 5-ти минут. Полученную кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, пару олигонуклеотидных нуклеотипспецефических праймеров, и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 95°C - 3 мин; циклирование: 95°C - 15 с, 58°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 45 раз. Анализ результатов ПЦР проводят методом электрофореза в агарозном геле. Готовят 2% ТАЕ-гель с добавлением бромистого этидия - 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Результаты электрофореза учитывают с помощью трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся оранжевых полос, на уровне 134 п.о. относительно маркера молекулярного веса. Для сохранения результатов реакции используются гельдокументирующие системы.

Выбор и анализ нуклеотипспецифических праймеров (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «BioEdit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank.

Нуклеотипспецифические праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы).

Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа B вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных нуклеотипспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР, позволяющую выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы).

Выявление РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) в образцах биологического материала: культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, образцы интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов.

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации дцРНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).

Таблица 1 ПЦР-мишень праймер нуклеотидная последовательность, 5'-3' локализация (RSArrrr/3, AJ585124), (RSArrrr/13, AJ585134), (RSArrrr/16, AJ585137) 2 сегмент прямой CKCgYATYTTRgATATgTCW 239-258 обратный CARWggYTgYACRTCCATSg 353-372

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации дцРНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°C в течение 5 минут. Далее необходимо поместить пробирки в условия с отрицательной температурой, для этого используют штатив с хладагентом.

Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 30-ти минут. После окончания реакции кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,6 или 0,2 см³, на поверхность смеси вносят воск в объеме 25 мкл. В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.

Профиль реакции:

1. Удержание температуры - 94°C - 3 мин.

2. Циклирование: 94°C - 15 с, 58°C - 15 с,72°C - 15 с.

Цикл повторить 40 раз.

3. Хранение - 4°C.

Анализ продуктов амплификации ПЦР методом электрофореза

Приготовление геля агарозы: взвешивают 2,0 г агарозы, помещают в стеклянную посуду, заливают 100 мл рабочего 1ХТАЕ - буфера и доводят до кипения в микроволновой печи для полного растворения агарозы. Охлаждают раствор агарозы до температуры примерно 60-65°C и заливают в специальную форму с гребенкой, дают гелю затвердеть. После этого гребенку осторожно вынимают и форму с агарозным гелем переносят в камеру для горизонтального электрофореза. Заливают в камеру рабочий 1XTAE-буфер так, чтобы он покрывал гель на 5-10 мм.

Проведение электрофореза: из пробирок с исследуемыми образцами после завершения ПЦР отбирают из-под масла по 12 мкл реакционной смеси и вносят в лунки агарозного геля, в последнюю лунку вносят 5 мкл маркера молекулярной массы. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Направление движения образцов в геле от ”-” к ”+”. Длину амплифицированного фрагмента определяют в соответствии с маркером молекулярной массы (100-1000 пар оснований) и положительным контролем.

Результаты электрофореза учитывают на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся полос. Для сохранения результатов реакции используются гельдокументирующие системы. Положительными считаются пробы, полосы в которых располагаются в геле на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. Размер фрагмента, синтезируемого в ПЦР, составляет 134 пар оснований. Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагмента в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). Результаты ОТ-ПЦР с использованием разработанной нуклеотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа В (3, 13 и 16 серотипы) методом ОТ-ПЦР с использованием разработанной нуклеотипспецифической системы олигонуклеотидов № проб Характеристика биоматериала Результаты 1 культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSAnrr/01 (AJ585122) референтный штамм - 2 культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм - 3 культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм + 4 культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм - 5 культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм - 6 культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127) референтный штамм - 7 культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128) референтный штамм - 8 культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129) референтный штамм - 9 культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130) референтный штамм - 10 культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм - 11 культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм - 12 культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм - 13 культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм + 14 культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм - 15 культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ585136) референтный штамм - 16 культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137) референтный штамм + 17 культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ585138) референтный штамм - 18 культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ58519) референтный штамм - 19 культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140) референтный штамм - 20 культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (AJ585141) референтный штамм - 21 культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142)референтный штамм - 22 культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (А1585143)референтный штамм - 23 культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (AJ585144)референтный штамм - 24 культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145)рефереренторный штамм - 25 культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (НМ590642) - 26 интактная культура клеток Vero - 27 интактная культура клеток ВНК-21 - 28 кровь от интактного животного (корова) - 29 кровь от интактного животного (овца) - 30 культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси», 1 серотип -

Таким образом, разработана нуклеотипспецифическая пара олигонуклеотидных праймеров, позволяющая с помощью классической ОТ-ПЦР выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы).

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

- специфичность и чувствительность способа выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) с помощью ОТ-ПЦР, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга группы серотипов;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода благодаря использованию ОТ-ПЦР для идентификации нуклеотипа.

Источники информации

1. Clinical aspects linked with the emergence of bluetongue in cattle in northern Europe: results of a two month longitudinal study / C. Saegerman, A. Mauroy, H. Guyot // Renc. Rech. Ruminants. -2007. - Vol.l4. - P.215.

2. The dsRNA viruses / P.P.C. Mertens // Virus Res. - 2004. - Vol.101. - P.3-13.

3. Bluetongue virus assembly and morphogenesis / P. Roy, R. Noad // Curr Top MicrobiolImmunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

4. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens // J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 621-630.

5. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode / P.P.C. Mertens, F. Brown, D.V. Sangar // Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-217.

6. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments / J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq // J. Virol. Methods. - 2007. - Vol.140. - P.115-123.

7. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens // Journal of Virological Methods. - 2007. - Vol.145. - P.115-126.

8. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1 : Description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11/ F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq // TransboundEmerg Dis. - 2009. - Vol.56(9-10). - P.346-54.

9. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ B. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer // Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P. 2992-2994.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа B вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала. Предложенные праймеры используются для идентификации вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) методом ОТ-ПЦР. 2 табл.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) для идентификации вируса блютанга нуклеотипа B, используемые для выявления генома вируса блютанга нуклеотипа B, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):
прямой: CKC-GYA-TYT-TRG-ATA-TGT-CW,
обратный: CAR-WGG-YTG-YAC-RTC-CAT-SG.