ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ДНК-ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ МЕТОДОМ ПЦР ИЛИ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2548799C1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей.

Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) - вирусная болезнь однокопытных, характеризующаяся поражением органов кроветворения и проявляющаяся рецидивирующей или постоянной лихорадкой, анемией, явлениями геморрагического диатеза и нарушением функций сердечнососудистой системы, а также длительным вирусоносительством [1, 2, 5].

Возбудитель ИНАН лошадей - РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae, рода Lentivirus [1, 2, 4, 6].

С 2010 г. по 2013 г. по данным Международного эпизоотического бюро ИНАН лошадей регистрируется во многих странах мира. 2011 год - Франция, Германия, Греция, Япония - 42 вспышки. 2012 год - Бельгия, Германия, Франция, Греция, Великобритания - 24 вспышки. За полгода 2013 - Бельгия, Франция, Германия - 21 вспышка заболевания.

Также ИНАН регистрируется в странах ближнего зарубежья, например, таких, как Украина [3].

На период 2012 года в нашей стране выявили положительно реагирующих на ИНАН лошадей в Омской, Челябинской, Нижегородской, Кировской, Иркутской, Свердловской, Ленинградской, Курской и Томской областях, республике Бурятия и республике Коми, Приморском и Красноярском крае. За первое полугодие 2013 года выявлены больные животные в Нижегородской, Кировской, Омской, Томской областях, Красноярском крае, республике Коми и республике Хакасия.

Лабораторная диагностика ИНАН в Российской Федерации основана на серологических методах (РДП, ИФА), которые выявляют вирусспецифические антитела в сыворотке крови больных лошадей, начиная с 14-38 дня, и не дают возможности диагностировать заболевание на ранних стадиях болезни до образования антител, а также не позволяют определить статус жеребят, полученных от инфицированных кобыл [1, 2].

Разработка тест-системы для выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей в формате реального времени была обусловлена необходимостью раннего обнаружения болезни, повышения чувствительности диагностических тестов, сокращения времени анализа и трудозатрат.

Обнаружение ПЦР-продуктов основанное, на флуоресцентной регистрации накопления ДНК, значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения отдельных вирусов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае идентифицировать вирус [5, 6]. Все существующие способы и основанные на них тест-системы были разработаны за рубежом, поэтому существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в нашу страну.

Целью данного изобретения является разработка способа выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей с помощью ПНР в режиме реального времени с использованием пары синтезированных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда, комплементарных к консервативной области gag-гена вируса ИНАН.

Поставленная цель достигается за счет пары синтезированных олигонуклеотидных праймеров, ДНК-зонда и способа для обнаружения РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей в крови, пробах органов (селезенка, печень) от больных или погибших животных, при котором проводят амплификацию ДНК.

Специфические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд для обнаружения РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей используется в полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени. Данная процедура включает следующие этапы:

1. Денатурация РНК вируса ИНАН.

2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.

3. ПЦР РВ.

Денатурацию РНК осуществляют при температуре 94°C в течение 5 минут в реакционной смеси со специфической парой олигонуклеотидных праймеров. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 60 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). Полученную кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Или для постановки ПЦР можно использовать провирусную ДНК вируса ИНАН, то есть без этапов денатурации и обратной транскрипции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, Mg2+, пару спецефических олигонуклеотидных праймеров, ДНК-зонд и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 94°C - 4 мин; циклирование: 94°C - 10 с, 56°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 5 раз без детекции продуктов амплификации. Затем циклирование: 94°C - 10 с, 56°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 35 раз с детекцией продуктов амплификации.

В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, применение специфических олигонуклеотидов и технологии гибридизационных зондов TaqMan. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Выбор и анализ вирусспецифических праймеров и зондов (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей gag-гена, референтных штаммов и изолятов вируса ИНАН, опубликованных в информационной базе данных GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5′ конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3′ конце RTQ1.

Таблица 1 Специфические праймеры и ДНК-зонд для выявления РНК и пДНК вируса ИНАН ПЦР-мишень Праймеры /ДНК-зонд Нуклеотидная последовательность, 5′-3′ Локализация (NC_001450.1) gag-ген EIA/q2/F gTC-TTC-Tgg-Agg-TgT-TCC-T 480-498 EIA/q2/R CCg-TCA-CCT-TCT-CTA-ACT-TC 560-579 EIA/q2/Z FAM - Agg-ARg-ACA-ggT-ARg-ATg-ggR-gA - RTQ1 510-532

Техническим результатом изобретения является возможность обнаружения РНК и пДНК вируса ИНАН с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по выявлению генома вируса ИНАН в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных вирусспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить РНК и пДНК вируса ИНАН. Использование данной методики позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.

Пример конкретного выполнения

Выявление РНК и пДНК вируса ИНАН проводится в образцах биологического материала: кровь от инфицированных вирусом ИНАН животных, 10%-ная суспензия внутренних органов инфицированных животных, лиофилизированный культуральный материал, а также в образцах интактных культур клеток, крови от интактных животных и культуральном материале гетерологичных вирусов.

Из представленных образцов были выделены нуклеиновые кислоты с использованием следующей методики.

Исследуемый материал в объеме 100-200 микролитров (далее - мкл) вносят в 1,5 см3 пробирки, в которые предварительно внесено 800 мкл лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата. Пробирки перемешивают и инкубируют при температуре 56°C в течение 5-10 мин. Затем добавляют 35 мкл нуклеосорбента, который предварительно тщательно ресуспендируют. Смесь инкубируют в течение 7 мин при комнатной температуре с периодическим перемешиванием на смесителе типа «Vortex». Осаждают сорбент центрифугированием при 7 тыс об/мин - 15 сек. При помощи вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой отдельным для каждой пробы наконечником удаляют надосадок.

Затем к осадку добавляют 300 мкл отмывочного буфера и тщательно ресуспендируют сорбент. Центрифугируют пробу при 7 тыс об/мин - 30 сек. Удаляют, используя отдельный наконечник для каждой пробы, надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса с колбой-ловушкой.

Дважды промывают сорбент 75%-ным этиловым спиртом, в количестве 500 мкл на каждую пробу, тщательно ресуспендируют. Центрифугируют пробу при 13 тыс. об/мин - 30 сек. Надосадок удаляют при помощи вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой и отдельного наконечника для каждой пробы.

Осадок в пробирках подсушивают при 56°C в течение 5-10 мин, при этом крышки пробирок должны быть открыты.

К осадку добавляют 50 мкл элюирующего буфера. Перемешивают на смесителе типа «Vortex» и инкубируют 10 мин при 56°C в пробирках с закрытой крышкой.

Центрифугируют пробирки в течение 60 сек при 13 тыс об/мин и переносят надосадочную жидкость в новые пробирки.

Супернатант используют в дальнейшем в качестве матрицы для постановки реакции обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени.

Затем для выявления РНК вируса ИНАН препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции обратной транскрипции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации РНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК или пДНК (нуклеиновые кислоты после выделения без этапа обратной транскрипции) в количестве 8 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации РНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 94°C в течение 5 минут.

Готовят смесь для реакции обратной транскрипции, для этого в отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов. На одну пробу смешивают: 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 60 минут. После окончания реакции к ДНК используют для постановки ПНР.

Проведение ПЦР

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров, 0,3 мкл ДНК-зонда и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 16 мкл в пробирки объемом 0,2 см3. На поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.

В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 8 мкл кДНК или пДНК.

Помещают пробирки в амплификатор со следующей программой:

Профиль реакции:

1. Удержание температуры / Hold 94°C - 4 мин 2. Циклирование / Cycling (без детекции 94°C- 10 с продуктов амплификации) 56°C - 15 с 72°C - 15 с

Цикл повторить / Cycle repeats 5 раз (5 times)

3. Циклирование / Cycling (с 94°C - 10 с детекцией продуктов амплификации 56°C - 15 с - детекция! 72°C - 15 с

Цикл повторить / Cycle repeats 35 раз (35 times)

Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 56°C.

С помощью программы "BioEdit 7.0.8" выравнены доступные в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности полного генома и участков gag-гена вируса ИНАН. При анализе построенного элайнмента внутри gag-гена вируса ИНАН выбран консервативный участок, на который и были подобраны специфические олигонуклеотиды. С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома, размером 99 п.о. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров EIA/q2/F и EIA/q2/R.

С использованием программы "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

Свойства олигонуклеотидов, рассчитанные с помощью программы

"Oligo 6.0.

Название
олигонуклеотида
Температура
плавления, °С
AG гибридизации олигонуклеотида на матрицу, kcal/mol 3AG образования шпилечной структуры, kcal/mol Эффективность отжига олигонуклеотида на матрицу (Priming efficiency number)1
EIA/q2/F 57,5 -33,6 -8,2 365 EIA/q2/Z 68,2 -42,3 -7,9 417 EIA/q2/R 58,5 -35,1 -9,6 393

Примечание:

1- Priming efficiency number - это величина, определяющая эффективность гибридизации данного праймера (зонда) с заданным участком матрицы, рассчитывается по уникальному алгоритму, разработанному создателями программы "Oligo". Минимальное значение Priming efficiency number, при котором праймер (зонд) в ходе ПЦР эффективно гибридизуется со специфическим участком матрицы.

Определение аналитической чувствительности ПЦР в режиме реального времени при выявлении пДНК вируса ИНАН и ОТ-ПЦР в режиме реального времени при выявлении РНК вируса ИНАН.

Аналитическую чувствительность метода определяли с использованием рекомбинантной плазмиды со встройкой фрагмента генома вируса ИНАН и in vitro транскрипта, синтезированного на матрице рекомбинантной плазмиды со встройкой фрагмента генома вируса ИНАН. Концентрация очищенного препарата плазмидной ДНК измеренная спектрофотометрически составила 0,253*10 -6 г/мл, что соответствует 0,77×10 8 молекул ДНК/мкл. Спектрофотометрически измеренная концентрация in vitro транскрибированной РНК составила 1,593*10 -6 г/мл, что соответствует 1,18 ×10 9 молекул РНК /мкл.

Десятикратные разведения (в трех повторах) препарата рекомбинантной плазмиды и транскрибированной in vitro РНК известной концентрации использовали для определения аналитической чувствительности ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени составило 0,77*102 молекул ДНК /мкл, что соответствует 6,16×102 молекулам ДНК в реакционной смеси. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени составило 1,18*102 молекул РНК /мкл, что соответствует 9,44×102 молекулам ДНК в реакционной смеси.

Учет и интерпретация результатов амплификации

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результаты идентификации вируса ИНАН методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанных специфических олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты идентификации вируса ИНАН методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанных специфических олигонуклеотидов в различных образцах биологического материала. № проб Характеристика биологического материала Результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени 1 культура клеток синовиальной мембраны ягненка (СМЯ), зараженная вирусом висна-маеди, шт. «М-88» 3,5-4,5 lg ТЦД50/мл - 2 культура клеток синовиальной мембраны козленка (СМК), зараженная вирусом АЭК, шт. «75G-63» 5,0-5,5 lg ТЦД50/мл - 3 культура клеток CV, зараженная вирусом африканской чумы лошадей, штамм «452» (8 серотип) - 4 10% суспензия легкого овцы с клиническими и патологическими признаками аденоматоза легких овец №12 (г. Пермь) - 5 кровь от клинически здоровой лошади - 6 кровь от клинически здоровой овцы, искусственно контаминированная вирусом висна-маеди, шт. «М-88» в разведении 1:10 - 7 кровь от клинически здоровой козы, искусственно контаминированная вирусом АЭК, шт. «75G-63» в разведении 1:10 -

8 культура клеток лейкоцитов лошади, интактная - 9 10% суспензия печени лошади, серопозитивной по инфекционной анемии лошадей + 10 10% суспензия селезенки лошади, серопозитивной по инфекционной анемии лошадей + 11 антиген (штамм «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ») из «Набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) (организация-производитель ФГУП «Щелковский биокомбинат») + 12 кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 2 сутки наблюдения + 13 кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 14 сутки наблюдения + 14 кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 35 сутки наблюдения +

Синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность. Установлено, что тест-система не амплифицирует РНК и ДНК других вирусов.

Таким образом, подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, а также разработан способ, позволяющий с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием специфических олигонуклеотидов обнаруживать РНК и пДНК вируса ИНАН.

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

- высокая специфичность и чувствительность способа идентификации вируса ИНАН с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности gag-гена генома вируса ИНАН;

- быстрота и относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации вируса ИНАН, благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПНР;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала.

Источники информации

1. Архипов, Н.И. Медленные инфекции животных / Н.И Архипов, И.А. Бакулов, Л.И. Соковых. - М.: Агропромиздат, 1987. - 191 с.

2. Юров, К.П. Вирусные болезни лошадей / К.П. Юров, В.Т. Заблоцкий, Н.Е. Косминков. - М.: Зоомедлит, 2010. - 256 с.

3. Эпизоотологический мониторинг, лечение и профилактика заразных болезней лошадей в Украине / А.Е. Галатюк, В.Л. Бегас, А.И. Каневский [и др.] // Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития: материалы Международной научно-практической конференции. - Саратов, 2010. - С.109-113.

4. An EIAV field isolate reveals much higher levels of subtype variability than currently reported for the equine lentivirus family / J.K. Craigo, S. Barnes, B. Zhang [et al.] // J. Retrovirology. - 2009. - №6 - P 95.

5. Momtaz, H. Detection of proviral sequences of equine infectious anemia virus in peripheral blood cell of horses in Iran / H. Momtaz, S. Nejat // Bulgarian Journal of Veterinary Medicine. - 2010. - Vol.13, №1, P.18-22.

6. Nagarajan, M.M. Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction / M.M. Nagarajan, C. Simard // Journal of Virological Methods. - 2001. - Vol.94. - P.97-109.

Похожие патенты RU2548799C1

название год авторы номер документа
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА БОЛЕЗНИ ИБАРАКИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2013
  • Аронова Елена Владимировна
  • Калабеков Исмаил Мусаевич
  • Цыбанов Содном Жамьянович
  • Луницин Андрей Владимирович
RU2540142C2
СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ - ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМОВ 1-ГО, 4-ГО, 16-ГО СЕРОТИПОВ ВИРУСА БЛЮТАНГА МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2011
  • Панферова Агнеса Владимировна
  • Цыбанов Содном Жемьянович
  • Гузалова Анна Григорьевна
  • Луницин Андрей Владимирович
  • Колбасов Денис Владимирович
RU2481404C1
Способ выявления вируса Nipah методом ОТ-ПЦР в реальном времени 2022
  • Антонов Семён Анатольевич
  • Долгова Анна Сергеевна
  • Шабалина Анна Вячеславовна
  • Дедков Владимир Георгиевич
  • Милашенко Екатерина Николаевна
RU2816270C2
Способ выявления РНК вируса Хендра вида Hendra henipavirus методом ОТ-ПЦР в реальном времени 2023
  • Дедков Владимир Георгиевич
  • Долгова Анна Сергеевна
  • Широбокова Светлана Алексеевна
  • Шабалина Анна Вячеславовна
RU2822161C1
Способ выявления вируса клещевого энцефалита методом ОТ-ПЦР в реальном времени 2019
  • Дедков Владимир Георгиевич
  • Сафонова Марина Викторовна
  • Долгова Анна Сергеевна
  • Сюзюмова Елена Александровна
RU2744187C1
Способ выявления вируса кори методом ОТ-ПЦР в реальном времени 2023
  • Дедков Владимир Георгиевич
  • Долгова Анна Сергеевна
  • Милашенко Екатерина Николаевна
  • Шабалина Анна Вячеславовна
RU2822430C1
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА БЛЮТАНГА 14-ГО СЕРОТИПА МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ 2012
  • Панферова Агнеса Владимировна
  • Кольцов Андрей Юрьевич
  • Цыбанов Содном Жамьянович
  • Колбасов Денис Владимирович
RU2499054C1
Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени 2020
  • Дедков Владимир Георгиевич
  • Гончарова Екатерина Андреевна
  • Долгова Анна Сергеевна
  • Кассиров Илья Сергеевич
RU2744198C1
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА БОЛЕЗНИ ШМАЛЛЕНБЕРГ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ВИРУСА БОЛЕЗНИ ШМАЛЛЕНБЕРГ. 2012
  • Никитина Елена Григорьевна
  • Сальников Николай Игоревич
  • Гузалова Анна Григорьевна
  • Цыбанов Содном Жемьянович
  • Луницин Андрей Владимирович
  • Колбасов Денис Владимирович
RU2515916C2
Способ выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей 2018
  • Баннов Василий Александрович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Малышев Денис Владиславович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Донник Ирина Михайловна
  • Стекольников Анатолий Александрович
  • Уша Борис Вениаминович
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Иванов Аркадий Васильевич
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Калашникова Татьяна Валерьевна
  • Шевкопляс Владимир Николаевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Барашкин Михаил Иванович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Кузьминова Елена Васильевна
RU2700481C1

Реферат патента 2015 года ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ДНК-ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ МЕТОДОМ ПЦР ИЛИ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ выявления генома вируса инфекционной анемии лошадей предусматривает постановку полимеразной цепной реакции, амплификацию ДНК вируса, оценку проведения реакции. При этом при выявлении вирусной РНК предварительно проводят реакцию денатурации и обратной транскрипции, а идентификацию проводят с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени при выявлении РНК вируса ИНАН и ПЦР в реальном времени при выявлении пДНК вируса ИНАН. Для осуществления способа используют специфические праймеры и ДНК-зонд. При этом температурные режимы включают следующие этапы: 5 мин предварительной денатурации при 94°C, 5 циклов амплификации без детекции (94°C - 10 сек, 56°C - 15 сек, 72°C - 15 сек) и 35 циклов амплификации с детекцией (94°C - 10 сек, 56°C - 15 сек, 72°C - 15 сек). Интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold). Использование изобретений позволяет обнаружить РНК и пДНК вируса ИНАН с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, а также повысить специфичность и чувствительность способа. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 548 799 C1

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные консервативной области gag-гена вируса ИНАН, используемые для выявления генома вируса инфекционной анемии лошадей, имеющие следующий нуклеотидный состав (5′-3′):
EIA/q2/F gTC-TTC-Tgg-Agg-TgT-TCC-T
EIA/q2/Z FAM-Agg-ARg-ACA-ggT-ARg-ATg-ggR-gA-RTQ1
EIA/q2/R CCg-TCA-CCT-TCT-CTA-ACT-TC

2. Способ выявления генома вируса инфекционной анемии лошадей, включающий постановку полимеразной цепной реакции, амплификацию ДНК вируса, оценку проведения реакции, при этом при выявлении вирусной РНК предварительно проводят реакцию денатурации и обратной транскрипции, а идентификацию проводят с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени при выявлении РНК вируса ИНАН и ПЦР в реальном времени при выявлении пДНК вируса ИНАН, с использованием специфических праймеров и ДНК-зонда по п.1, при этом температурные режимы включают следующие этапы: 5 мин предварительной денатурации при 94°C, 5 циклов амплификации без детекции (94°C - 10 сек, 56°C - 15 сек, 72°C - 15 сек) и 35 циклов амплификации с детекцией (94°C - 10 сек, 56°C - 15 сек, 72°C - 15 сек), а интерпретацию результатов проводят на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (Threshold).

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2548799C1

NAGARAJAN M.M et al
Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction, Journal of Virological Methods, 2001, Vol.94, p.97-109
MOMTAZ H
et al, Detection of proviral sequences of equine infectious anemia virus in peripheral blood cell of horses in Iran, Bulgarian Journal of Veterinary

RU 2 548 799 C1

Авторы

Герасимова Надежда Николаевна

Панферова Агнеса Владимировна

Колбасова Ольга Львовна

Колбасов Денис Владимирович

Даты

2015-04-20Публикация

2013-11-06Подача