ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, СПОСОБ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ВИРУСА БЛЮТАНГА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ФОРМАТЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики и специфической профилактики.

Блютанг (катаральная лихорадка овец) - инфекционная вирусная болезнь овец, коз, крупного рогатого скота (КРС), передающаяся кровососущими насекомыми рода Culicoides, протекающая эпизоотически. У КРС болезнь протекает как латентные инфекции, особенно в эпизоотических зонах, и только у 5% инфицированных животных болезнь клинически выражена. Поэтому для выявления латентной формы болезни нужно иметь экспресс-метод обнаружения вируса у клинически здоровых животных.

В настоящее время для диагностики вирусных и бактериальных болезней используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Известен способ обнаружения вируса блютанга с помощью ПЦР, который включает три отдельные процедуры. На первой стадии РНК вируса блютанга экстрагируют из крови с использованием вызывающего диссоциацию агента, второй процедурой является денатурирование вирусной РНК и обратная транскрипция с целью синтеза кДНК, которая амплифицируется при постановке ПЦР, при этом в качестве мишени использован ген NS1, третьей процедурой - анализ ПЦР-продукта методом гель-электрофореза [1].

МЭБ (Международное эпизоотическое бюро) регламентирует правила постановки ПЦР при выявлении генома вируса блютанга. Эти правила предусматривают для денатурации двухцепочечной РНК применение в реакции метилгидроксид ртути, который, встраиваясь между ними, разрывает водородную связь.

Вторым недостатком данных способов является то, что перед постановкой реакции требуется предварительное выделение форменных элементов из крови, что достаточно трудоемко и требует специальных навыков.

Целью изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров и более общедоступного, безопасного и быстрого способа и соответствующей тест-системы для обнаружения РНК вируса блютанга методом ПЦР в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации.

Поставленная цель достигается тем, что для постановки ПЦР подобраны и синтезированы две пары олигонуклеотидных праймеров:

5'-gttaaaaatctatagagatg-3'

5'-gtaagtgtaatctaagaga-3'

5'-acaactgatgctgcgaatga-3'

5'-aacccacacccgtgctaagtgg-3'

Праймеры комплементарны консервативной области генома NS1 вируса блютанга с предварительным циклом денатурации 94°С 3 мин, с последующими 30 циклами амплификации при температуре денатурации 94°С 10 с, отжига 55°С 20 с, элонгации при 72°С 15 с, с завершающим циклом элонгации 72°С в течение 1 мин, затем проводят оценку результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта. Способ выявления РНК вируса катаральной лихорадки овец в образцах крови, пробах органов латентно инфицированных, больных и павших животных и/или в инфицированной культуре клеток включает предварительную денатурацию вирусной РНК при 88°С в течение 5 мин с последующей ее инкубацией в охлажденном при -40°С - -70°С песке в течение 1 мин. Синтез кДНК проводится при 42°С в течение 20 мин.

Тест-система состоит из трех отдельных наборов с пластиковыми флаконами и пробирками.

Набор 1 - для выделения нуклеиновых кислот, содержащий нуклеосорбент с отмывочным буфером на основе гуанидинтиоционата, буфер для реакции, отрицательный контроль.

Набор 2 - для постановки ПЦР, включающий пластиковые пробирки, содержащие олигонуклеотидные праймеры, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный контроль.

Набор 3 - для проведения электрофореза, содержащий агарозу, буфер для электрофореза.

Первый набор позволяет быстро и качественно выделить РНК вируса блютанга без предварительной подготовки суспензии из органов и выделения форменных элементов из крови.

При постановке ПЦР во втором наборе производится денатурация сегментированной двухцепочечной РНК предварительным прогревом ее до 88°С с последующей инкубацией в охлажденном при -40°С - -70°С песке и одновременной гибридизацией праймеров, что заменяет использование метилгидроксида ртути. В процессе амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа при проведении электрофоретического разделения продуктов амплификации в агарозном геле (третий набор).

Оценку результатов реакции проводят без предварительной рестрикции полученного продукта. Результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 800 пар оснований.

Техническим результатом изобретения является общедоступность, безопасность, чувствительность, а также сокращение времени проведения диагностической работы с пробами органов и крови от больных и латентно инфицированных животных.

Сущность изобретения заключается в том, что выявление вируса блютанга проводят методом полимеразной цепной реакции, предусматривающим амплификацию кДНК вируса, перенос продукта амплификации на гель и оценку результатов амплификации. Синтезируется фрагмент, который в геле агарозы соответствует размеру 800 п.о. Для определения размера фрагмента вносится маркер молекулярного веса.

Существенным отличием заявляемого способа является следующее:

1. Анализ можно проводить из стабилизированной крови, при этом не требуется предварительного выделения из нее форменных элементов, как это делалось в известном способе. Таким образом, значительно сокращается время постановки реакции.

2. При постановке реакции не используется метилгидроксид ртути, а проводится денатурация сегментированной двухцепочечной РНК предварительным прогревом ее до 88°С с одновременной гибридизацией праймеров путем инкубации в охлажденном при -40°С - -70°С песке для предотвращения соединения цепей РНК

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Тест-система укомплектована пластиковыми флаконами и пробирками.

Пример 1. Набор 1 для выявления нуклеиновых кислоты используют для работы с пробами органов, культуральным вируссодержащим материалом и кровью.

Исследуемый материал (кровь, смывы, мазки, 10% суспензия органов) в объеме 25-100 микролитров (далее мкл) вносят в 1,5 см³ пробирку и добавляют лизирующий буфер на основе гуанидинтиоцианата и 20 мкл нуклеосорбента. В течение 5 мин пробы инкубируют при 65°С. Пробирки центрифугируют при 5000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 200 мкл отмывочного буфера, встряхивают пробирки и центрифугируют при 5000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 500 мкл 70%-ного спирта. Пробирки встряхивают и центрифугируют при 12000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Пробирки инкубируют 5 мин при 56°С и вносят в пробирки 50 мкл бидистиллированной воды, тем самым эллюируя нуклеиновые кислоты с нуклеосорбента в воду. 5-10 мкл этого раствора используют для дальнейшего синтеза комплементарной ДНК.

Пример 2. Амплификация участка РНК (фрагмент гена NS1) вируса блютанга с применением набора 2 для проведения ПЦР и синтетическими олигонуклеотидами

Тест-система апробирована на различных серотипах вируса блютанга. В качестве отрицательных контролей использованы родственные орбивирусы - штаммы вируса АЧЛ, ЭГБО и Ибараки.

Подготавливают и подписывают пробирки объемом 0,5 см³ для N-количества образцов, в число которых входят анализируемые пробы. В каждую пробирку добавляют 3,0 мкл праймеров.

В пробирки вносят 5,0 мкл исследуемой РНК. Проводят предварительный отжиг праймеров, прогревая смесь на амплификаторе с температурным режимом:

денатурация 88°С - 5 мин 1 цикл

Затем пробирки немедленно помещают в ледяную баню (-70°С) на 2 мин.

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N-количество образцов, состоящую из буфера для ревертазы, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 2 ед. ревертазы. Реакционную смесь быстро добавляют в охлажденные пробирки и пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом:

синтез кДНК 42°С - 30 мин 1 цикл

Затем пробирки инкубируют в охлажденном песке (-40 - -70°С) на 2 мин.

Инкубационная смесь для ПЦР с конечным объемом 25 мкл содержит:

буфер для Taq-полимеразы с 15 mM MgCl₂, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 5 ед. Taq-полимеразы. Реакционную смесь быстро добавляют в охлажденные пробирки.

Температурный режим проведения ПЦР показан в таблице 1.

Таблица 1 Процесс Температура Время Циклов Денатурация 94°С 3 мин 1 Денатурация 94°С 10 с 30 Отжиг 55°С 20 с Элонгация 72°С 15 с Элонгация 72°С 1 мин 1

Проведение второго раунда ПЦР:

Проводят с аналогичной ПЦР-смесью в том же режиме.

Пример 3. Определение размера продуктов ПЦР с использованием набора 3 для проведения электрофореза

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-борном буфере.

10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента 800 пар оснований.

С применением тест-системы и указанных праймеров выявлялись все исследуемые образцы вируса блютанга. Отрицательные контроли не амплифицировались.

Пример 4. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических праймеров, синтезированных на район гена NS1

Определение чувствительности разработанного метода ПЦР показало, что с помощью подобранных праймеров можно выявить наличие возбудителя, когда титр инфекционности не превышает значений 5,5-6,0 lg ТЦД 50/мл (табл.2).

Таблица 2 Результаты проведения ПЦР с праймерами, комплементарными гену NS1 вируса блютанга № Наименование препаратов Титр вируса
ТЦД_50/мл Шифр Ожидаемый результат 1 вирус блютанга штамм 608 (тип 4), 22.02.2002, лиоф. высуш. 5,5 12 + 2 вирус блютанга штамм 636 (тип 9), 01.03.2002, лиоф. высуш. 4,5 2 + 3 вирус блютанга штамм 617 (тип 14), 01.03.2002, лиоф. высуш. 6,0 13 + 4 вирус блютанга штамм 874 (тип 2), 01.03.2002, культура клеток 6,0 4 + 5 вирус блютанга штамм «Ильичевский» (не типирован), 01.03.2002, культура клеток 5,0 14 + 6 вирус блютанга штамм «Нахичевань» (не типирован), 04.07.1971, культура клеток - 6 + 7 вирус АЧЛ серотип 2, 23.04.2001, лиоф. высуш. 5,25 7 - 8 вирус АЧЛ серотип 3, 10.04.2001, лиоф. высуш. 5,0 8 - 9 вирус АЧЛ серотип 4, 16.11.2000, лиоф, высуш. 4,75 9 - 10 вирус АЧЛ серотип 6, 16.11.2000, лиоф, высуш. 5,25 10 - 11 вирус ЭГБО штамм «Нью-Джерси», 22.02.1987, лиоф. высуш. 6,0 11 - 12 вирус Ибараки штамм Са саки, 05.06.1991, лиоф. высуш. 6,0 1 - 13 Проба головного мозга интактной мыши - 3 - 14 Проба головного мозга здоровой овцы - 5 -

Тест-система и синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует РНК других бактерий и вирусов.

Пример 5. Выявление РНК вируса блютанга с применением предлагаемой тест-системы и синтетических олигонуклеотидов в пробах биологического материала, полученного от больных животных

При исследовании более 1000 полевых образцов крови и органов, поступавших из различных регионов страны с подозрением на вирус блютанга, были специфично обнаружены все инфицированные пробы.

Каждая проба после проведения ПЦР была секвинирована и тем самым были

подтверждены результаты.

Таким образом, предлагаемые тест-система и способ позволяют достичь высокого уровня общедоступности, безопасности, чувствительности с помощью двух пар праймеров, провести идентификацию возбудителя в течение 4-6 часов.

С помощью разработанных способа и тест-системы можно выявить наличие вируса не только у больных и павших животных, но и при персистенции вакцинного вируса или у животных в латентной стадии заболевания.

Источники информации

1. Billinis С., Koumbati M., Spyrou V., Nomikou К., Mangana О., Panagiotidis С.А. & Papadopoulos О. (2001). Bluetongue virus diagnosis of clinical cases by a duplex reverse transcription-PCR: a comparison with conventional methods. J. Virol. Methods, 98, 77-89.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома NS1 вируса блютанга, имеющие следующий нуклеотидный состав:

5'-gttaaaaatctatagagatg-3'

5'-gtaagtgtaatctaagaga-3'

5'-acaactgatgctgcgaatga-3'

5'-aacccacacccgtgctaagtgg-3'.

Раскрыт также способ выявления вируса блютанга с использованием таких праймеров и тест-система для его проведения. Способ предусматривает проведение амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПНР). Для проведения ПЦР используют высококонсервативную область генома блютанга района NS1. Результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 800 пар оснований. Способ и тест-система могут быть использованы в ветеринарной вирусологии для выявления вируса блютанга. 3 н.п. ф-лы, 2 табл.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома NS1 вируса блютанга, используемые для выявления РНК вируса блютанга, имеющие следующий нуклеотидный состав:
5'-gttaaaaatctatagagatg-3',
5'-gtaagtgtaatctaagaga-3',
5'-acaactgatgctgcgaatga-3',
5'-aacccacacccgtgctaagtgg-3'.

2. Способ выявления РНК вируса катаральной лихорадки овец, включающий выделение РНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, амплификацию РНК вируса, оценку проведения реакции гель-электрофорезом в агарозе, отличающийся тем, что проводят предварительную денатурацию вирусной РНК при 88°С в течение 5 мин с последующей ее инкубацией в охлажденном при (-40)÷(-70)°С песке, синтез кДНК проводят при 42°С в течение 30 мин, а для постановки ПНР подобраны и синтезированы две пары олигонуклеотидных праймеров по п.1, с предварительным циклом денатурации 94°С 3 мин, с последующими 30 циклами амплификации при температуре денатурации 94°C 10 с, отжига 55°С 20 с, элонгации при 72°С 15 с, с завершающим циклом элонгации 72°С в течение 1 мин, затем проводят оценку результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта, при этом результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 800 пар оснований.

3. Тест-система для выявления РНК вируса катаральной лихорадки овец, включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный и отрицательный контроли, отличающаяся тем, что содержит три набора: 1. набор для выявления нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеосорбент с отмывочным буфером на основе гуанидинтиоционата, буфер для реакции, отрицательный контроль; 2. набор для проведения ПЦР, включающий пластиковые пробирки, содержащие синтетические праймеры по п.1; 3. набор для проведения электрофореза, содержащий агарозу, буфер для электрофореза.