СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ - ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМОВ 1-ГО, 4-ГО, 16-ГО СЕРОТИПОВ ВИРУСА БЛЮТАНГА МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 C12N15/58 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам генетического типирования вирусов.

Блютанг - инфекционная, неконтагиозная вирусная болезнь широкого спектра домашних и диких жвачных, в настоящее время определенная МЭБ как значительная социально-экономическая проблема, создающая большие трудности для международной торговли животными и продуктами животноводства [1].

Предварительный диагноз на блютанг основывается на клинических и патологоанатомических признаках. Для окончательного диагноза необходимо лабораторное подтверждение. В настоящее время система лабораторной диагностики блютанга, как совокупность связанных между собой вирусологических и серологических методов, основана на выделении вируса (используются куриные эмбрионы или культуры клеток), обнаружении антигена блютанга иммунофлюоресценцией, с последующим типированием выделенного вируса реакцией нейтрализации (РН) с типоспецифическими сыворотками, обнаружении РНК вируса блютанга методом ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в режиме реального времени; обнаружении группоспецифических антител к вирусу блютанга в сыворотках крови реакцией длительного связывания комплемента (РДСК), а также конкурентный ELISA, непрямой ELISA. Чувствительность тестов может варьировать между лабораториями, но в общем геном вируса может быть обнаружен в образцах крови, начиная с 3-го дня после заражения и далее (данные согласно результатам ОТ-ПЦР в режиме реального времени) и обнаружение антител ELISA может быть ожидаемо, начиная с 5-7 суток после инфекции.

В настоящее время известно о существовании 26-ти серотипов вируса и данные молекулярной эпидемиологии говорят о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. Уже известно более 300 вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга. В июле 2011 г. Великобритания объявила себя свободной от заболевания, однако на Средиземноморском континенте вспышки до сих пор продолжают регистрироваться. По данным, размещенным на сайте eubtnet.org с мая 2010 г. по июль 2011 г. были зарегистрированы следующие вспышки в Алжире, Франции, Италии, Португалии и Испании 1-го серотипа - всего 108 вспышек, в Италии и Испании - 10 вспышек 4-го серотипа, в Италии и Испании - 4 вспышки 8-го и на Кипре, в Греции и Турции - 23 вспышки 16-го серотипа. По молекулярно-эпидемиологическим данным все изоляты вирусов блютанга относились к европейским линиям/группам и соответствовали 1-й серотип - западному топотипу, 4-й серотип - западному топотипу, 8-й серотип - западному топотипу и 16-й серотип - восточному топотипу.

Заболевание вызывается вирусом блютанга, который является одним из видов рода Orbivirus, семейства Reoviridae [2]. Геном вируса состоит из 10-ти сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [3]. Внешний слой капсида представлен двумя белками VP2 и VP5, которые имеют высокую степень гетерологии аминокислотной последовательности, одинаково как между, так и внутри каждого серотипа [4]. Серотип вируса детерминирован VP2 белком, который имеет нейтрализующие эпитопы вируса [5].

Необходимость совершенствования средств и методов лабораторной диагностики с учетом новых достижений науки и постановки диагноза при бессимптомном течении болезни поставила перед нами задачу разработки ПНР в режиме реального времени для обнаружения геномов 1-го, 4-го, 16-го серотипов вируса блютанга. Трудности в ее разработке обусловлены несколькими факторами: во-первых, это структура генома, так как он представлен 10-ю сегментами дцРНК, и как результат - это известный на данный момент факт частой реассортации вирусов, как полевых вариантов, так и полевых с вакцинными, не только внутри одного серотипа, но и между серотипами.

Известен количественный метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вакцинных и/или полевых штаммов ВБ. С того момента, как обнаружение ПЦР-продуктов стало основано на флюоресцентной интенсивности, это значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. Были разработаны два универсальных теста, основанных на ОТ-ПЦР в режиме реального времени, они позволили обнаруживать все серотипы ВБ [6, 7]. Кроме того, в настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения отдельных серотипов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип вируса [8; 9]. Все существующие способы и основанные на них тест-системы были разработаны за рубежом, поэтому существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в нашу страну.

Целью данного изобретения является разработка способа дифференциации 1-го, 4-го, 16-го серотипов вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, основанной на использовании специфичных для каждого серотипа систем «олигонуклеотидные праймеры-зонд».

Поставленная цель достигается специфическими системами «олигонуклеотидные праймеры - зонд» для обнаружения 1-го, 4-го, 16-го серотипов вируса блютанга, которые в дальнейшем используются в полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени. Данная процедура включает следующие этапы.

1. Денатурация дцРНК вируса блютанга.

2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.

3. Собственно ПЦР в режиме реального времени.

Денатурацию дцРНК осуществляют при температуре 95°С в течение 5 минут в реакционной смеси с серотип-специфической парой олигонуклеотидных праймеров. Далее денатурированную РНК ВБ необходимо зафиксировать путем замораживания. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°С в течение 30 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). Затем реакцию терминируют при 95°С в течение 5 минут. Полученную кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Готовят стандартную смесь для ПЦР в режиме реального времени, включающую буфер для ПЦР, dNTP, пару олигонуклеотидных серотип-специфических праймеров и соответствующий зонд и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 94°С - 3 мин; циклирование: 94°С - 10 с, 60°С - 20 с, 72°С - 15 с. Цикл повторить 45 раз.

В основе разработанного способа - ПЦР в режиме реального времени, технология гибридизационных зондов TaqMan, контролирующая кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Выбор и анализ серотип-специфических праймеров (табл.1, 2, 3) и зондов проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit 7.0.8», «Oligo 6.0» и на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента 120-ти изолятов 1-го, 4-го и 16-го серотипов, основных генетических представителей европейских штаммов вируса блютанга. Нуклеотидные последовательности были взяты из GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ1.

Таблица 1 Серотип-специфические праймеры и проба для выявления генома 1-го серотипа вируса блютанга. Наименование праймера/зонда Нуклеотидная последовательность, 5'-3' Позиция на нуклеотидной последовательности сегмента l/2/qf CGA ATT ТАС GGT GTA TAG С 2756 l/2/probe TGG ТАА CGA CGA GAT GCT GAC АА 2864 1/2/qr АТА CGT TGA GAA GTT TTG Т 2906

Таблица 2 Серотип-специфические праймеры и проба для выявления генома 4-го серотипа вируса блютанга. Наименование праймера/зонда Нуклеотидная последовательность, 5'-3' Позиция на нуклеотидной последовательности сегмента 4/2/qf ATG CAT AAA GAG ТАС GGY GT 2429 4/2/probe GAA CAC GAA GAT АТС GCA GGG 2470 4/2/qr ACT TGG ACG TCA CAA CAG G 2523

Таблица 3 Серотип-специфические праймеры и проба для выявления генома 16-го серотипа вируса блютанга. Наименование праймера/зонда Нуклеотидная последовательность, 5'-3' Позиция на нуклеотидной последовательности сегмента 16/2/qf CGC GTA ТАА TCA АТТ CAT GAA 708 16/2/probe GAT ACG AGA GGA AAT GGC CGC 771 16/2/qr GAT GTG TGT TCG CTC GAA G 846

Техническим результатом изобретения является возможность определения серотипа вируса блютанга с помощью ПЦР с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, сокращение времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных серотип-специфических олигонуклеотидных праймеров и проб проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить геномы 1-го, 4-го, 16-го серотипов ВБ. Использование данной методики позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.

Пример конкретного выполнения

Обнаружение геномов вируса блютанга 1-го, 4-го и 16-го серотипов в образцах биологического материала (кровь от инфицированных блютангом животных, культуральный материал вируса, лиофилизированный культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также в образцах интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов).

1. Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот были использованы в реакции: 8 мкл образца было добавлено к реакционной смеси для денатурации. В пробирку с денатурированной НК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препараты полученных комплементарных ДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР в режиме реального времени (результаты представлены в таблице 4). ПЦР может быть проведена, например, на приборе Rotor gene 6000 (Corbett Research, Австралия).

Таблица 4 Результаты использования предлагаемого изобретения для обнаружения геномов 1-го, 4-го и 16-го серотипов вируса блютанга. №№ проб Характеристика биоматериала Результат ПЦР 1-й серотип 4-й серотип 16-й серотип 1. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-1 референтный штамм + - - 2. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-2 референтный штамм - - - 3. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-4 референтный штамм - + - 4. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-8 референтный штамм - - - 5. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-10 референтный штамм - - - 6. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-11 референтный штамм - - - 7. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-13 референтный штамм - - - 8. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-16 референтный штамм - - + 9. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-17 референтный штамм - - - 10. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-18 референтный штамм - - - 11. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-20 референтный штамм - - - 12. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-23 референтный штамм - - - 13. лиофилизированный культуральный, вирус блютанга, BTV-24 референтный штамм - - - 14. кровь ягненка №4, инфицированного 4-ым серотипом вируса блютанга (шт.BTV-4, Испания), 15-е сутки после заражения, инфекционная активность 3,75 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл - + - 15. кровь ягненка №20, инфицированного 1-ым серотипом вируса блютанга (шт.BTV-1, Испания), 21-е сутки после заражения, инфекционная активность 3,0 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл + - - 16. кровь теленка №50, инфицированного вирусом блютанга 8-го серотипа (полевой изолят ФКл/4-09, РФ), 4-е сутки после заражения, инфекционная активность 4,5 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл - - - 17. кровь теленка №464, инфицированного 1-ым серотипом вируса блютанга (шт-BTV-1, Испания), 7-е сутки после заражения, инфекционная активность 5,0 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл + - - 18. кровь теленка от 01.02.10 г., инфицированного вирусом блютанга 1-го серотипа (штамм BTV-1 Spain) и 8-го серотипа (штамм BTV-8 Denmark) одновременно + - - 19. кровь оленя №2, инфицированного 16-ым серотипом вируса блютанга (шт.Тапхар), 15-е сутки после заражения, инфекционная активность 2,0 lg ЭЛД₅₀/0,1 мл - - + 20. лиофилизированный культуральный, вирус ЭГБО штамм Нью-Джерси, 1-ый серотип - - - 21. лиофилизированный культуральный, вирус АЧЛ шт.18/60-100, 9-ый серотип - - - 22. интактная культура клеток Vero, 32 пасс - - - 23. интактная культура клеток ВНК-21,1 пасс - - - 24. кровь от интактного животного (крс - коровы) - - - 25. кровь от интактного животного (мрс - овцы) - - -

Проведение реакции обратной транскрипции.

1. В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации, далее вносят 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенной РНК. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°С в течение 5 минут. Далее необходимо поместить пробирки в условия с отрицательной температурой, для этого используют штатив с хладагентом.

2. Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,5 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 9,7 мкл смеси для обратной транскрипции. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 30-ти минут. После окончания реакции кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

1. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 8 мкл смеси для ПЦР, 7 мкл смеси праймеров и 0,15 мкл Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см³, на поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.

2. В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.

Профиль реакции:   1. Удержание температуры 94°С - 3 мин 2. Циклирование 94°С - 10 с   60°С - 20 с   72°С - 15 с Цикл повторить 5 раз   3. Циклирование 2     94°С - 10 с   60°С -20 с - Детекция   72°С -15 с Цикл повторить - 40 раз  

Флуоресценцию измеряют по каналу Fam/Green при температуре 60°С.

Значения пороговых циклов определяются автоматически прибором.

Учет и интерпретация результатов амплификации.

На приборе Rotor gene 6000 устанавливают параметры оптимизация детекции флюоресценции для обоих каналов. Минимальный сигнал - 15F, максимальный сигнал - 25 F.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения графика флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии.

При анализе результатов амплификации специфического участка кДНК вируса блютанга (канал Fam/Green) уровень пороговой линии R=0,01.

Образец считают положительным на наличие РНК вируса блютанга, если значение Ct на канале Fam менее 31. Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале Fam отсутствует.

Таким образом, впервые подобраны специфические системы «олигонуклеотидные праймеры - зонд» и разработан способ, позволяющий с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием данных систем обнаруживать 1-й, 4-й и 16-й серотипы вируса блютанга.

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

- высокая надежность способа, благодаря избирательному выявлению уникальных последовательностей трех серотипов вируса блютанга;

- быстрота проведения анализа, благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПЦР;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения серотипов.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды для выявления геномов 1-го, 4-го и 16-го серотипов вируса блютанга. Также описан способ выявления геномов 1-го, 4-го и 16-го серотипов вируса блютанга с использованием таких синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов. Способ позволяет проводить определение серотипа вируса блютанга с помощью ПЦР с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени, а также повысить специфичность и чувствительность, сократить время проведения работы по определению серотина вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала. 4 н.п. ф-лы, 4 табл.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд для выявления геномов 1-го серотипа вируса блютанга, отличающиеся тем, что они комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента 1-го серотипа вируса блютанга, используемые для выявления генома 1-го серотипа вируса блютанга, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):
1/2/qf CGA ATT TAC GGT GTA TAG С 1/2/probe TGG TAA CGA CGA GAT GCT GAC AA 1/2/qr ATA CGT TGA GAA GTT TTG T

2. Синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд для выявления геномов 4-го серотипа вируса блютанга, отличающиеся тем, что они комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента 4-го серотипа вируса блютанга, используемые для выявления генома 4-го серотипа вируса блютанга, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):
4/2/qf ATG CAT AAA GAG TAC GGY GT 4/2/probe GAA CAC GAA GAT АТС GCA GGG 4/2/qr ACT TGG ACG TCA CAA CAG G

3. Синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд для выявления геномов 16-го серотипа вируса блютанга, отличающиеся тем, что они комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента 16-го серотипа вируса блютанга, используемые для выявления генома 16-го серотипа вируса блютанга, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):
16/2/qf CGC GTA TAA TCA ATT CAT GAA 16/2/probe GAT ACG AGA GGA AAT GGC CGC 16/2/qr GAT GTG TGT TCG CTC GAA G

4. Способ выявления геномов 1-го, 4-го, 16-го серотипов вируса блютанга, включающий проведение обратной транскрипции полимеразной цепной реакции, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров по пп.1-3, амплификацию РНК вируса, оценку проведения реакции, отличающийся тем, что осуществляют реакцию амплификации PHK с этапом синтеза кДНК, который в свою очередь состоит из денатурации дцРНК вируса блютанга и реакции обратной транскрипции, затем интерпретируют результаты на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной пороговой линией.