ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО ИЗ МОРСКИХ ВОДОРОСЛЕЙ Российский патент 2014 года по МПК A61K35/02 A61P1/16 

Изобретение относится к биологическим составам на основе экстрактов растительного происхождения и может быть использовано в качестве гепатопротектора, а также средства, повышающего сопротивляемость организма к воздействию химических веществ техногенного происхождения, отравлениям промышленными ядами и лекарствами.

В связи с прогрессирующим ухудшением экологической обстановки человек все более активно подвергается воздействию различных веществ техногенного происхождения. В нашей стране гигиеническое регламентирование охватывает в настоящее время около 2 тыс. вредных химических веществ, для которых установлено более 3 тыс. гигиенических нормативов предельно допустимого содержания в различных объектах окружающей среды. Влияние стрессовых ситуаций (гипо- и гипертермия, высокая физическая нагрузка, дыхание гипоксическими смесями, нахождение в зоне техногенных катастроф и др.), несбалансированное питание, алкоголизм настоятельно требуют поиска нетрадиционных подходов к фармакопрофилактике возникающих нарушений в организме. Известно, что основным барьером, нейтрализующим токсические загрязнения в организме человека и животных, является печень. Заболевания печени и билиарной системы составляют 40% в группе нозологических форм, относящихся к патологии пищеварительной системы.

Таким образом, лечение и профилактика заболеваний печени являются одной из наиболее актуальных проблем современной фармакологии. В настоящее время ведется активный поиск средств, повышающих устойчивость печени к патологическим воздействиям, усиливающих ее обезвреживающие функции путем повышения активности ферментной системы, а также способствующих восстановлению ее функций при различных повреждениях, в том числе при отравлении промышленными ядами.

В настоящее время разработано несколько групп гепатопротекторов, которые принято подразделять по происхождению на:

• растительные полифенолы;

• синтетические препараты;

• фосфолипидные препараты;

• органопрепараты.

Далеко не все гепатопротекторы изучены в адекватных клинических исследованиях, поэтому эффективность и безопасность многих из них остается недоказанной. К числу наиболее хорошо изученных препаратов этой группы относятся фосфолипидные гепатопротекторы.

Известны препараты, обладающие гепатопротекторным действием, содержащие в качестве активного начала комплексы фосфолипидов. Это ряд лекарственных препаратов, близких по составу и действию, которые производятся в разных странах под различными названиями: «Эссенциале» и целый ряд его разновидностей (Эссенциале-Н, Эссенциале-Форте и т.д.), «Резалют», «Эссливер», «Фосфоглив», «Гепагард» и т.д.

В качестве средств, обладающих гепатопротекторным эффектом за счет содержащихся в их составе фосфолипидов, известен также экстракт из асцидии пурпурной (п.РФ №1522487, оп.10.08.1999 г.), «Эплир» (Венгеровский А.И., Головина Е.Я., Коваленко М.Ю. и др. Совместное применение преднизолона и гепатопротекторов, содержащих фосфолипиды, при экспериментальном хроническом гепатите // Эксперим. и клин, фармакология. 1999. №2. С.28-30.).

Наиболее близким к заявляемому средству является известный, широко применяемый в медицине препарат «Эссенциале», содержащий в своем составе в качестве активного агента полиненасыщенный фосфатидилхолин - 1,2-дилинолеилфосфатидилхолин - фосфолипид, выделенный из соевых бобов. Препарат «Эссенциале» (далее эссенциале) считается эталонным гепатопротектором фосфолипидной природы.

Механизм действия эссенциале связан, главным образом, с его способностью оказывать мембраностабилизирующее и мембрановосстанавливающее действие. Оно достигается путем непосредственного встраивания молекул эссенциальных фосфолипидов (ЭФЛ) в фосфолипидную структуру поврежденных печеночных клеток, замещения дефектов и восстановления барьерной функции липидного бислоя мембран. Ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов способствуют повышению активности и текучести мембран, уменьшают плотность фосфолипидных структур, нормализуют проницаемость. Экзогенные ЭФЛ способствуют активации расположенных в мембране фосфолипидзависимых ферментов и транспортных белков, что, в свою очередь, оказывает поддерживающее влияние на обменные процессы в клетках печени, способствует повышению ее детоксикационного и экскреторного потенциала.

Задачей изобретения является расширение арсенала гепатопротекторных средств. Поставленная задача решается гепатопротекторным средством на основе липидной фракции из спиртового экстракта таллома ульвы продырявленной - Ulva fenestrate P. et R. (отдел Chlorophyta - зеленые водоросли, класс Ulotrichophyceae, порядок Ulvales - ульвовые), содержащей до 70% мембраноактивных липидных компонентов, включая не менее 20% эссенциальных фосфолипидов с содержанием полиненасыщенных жирных кислот семейства n-3 не менее 55%.

Технический результат заключается в проявлении выраженного гепатопротекторного эффекта липидного экстракта таллома ульвы продырявленной - Ulva fenestrate P. et R. (отдел Chlorophyta - зеленые водоросли, класс Ulotrichophyceae, порядок Ulvales - ульвовые).

Многокомпонентный фосфолипидный комплекс, составляющий активное начало заявляемого средства - экстракта из ульвы продырявленной, характеризуется наличием в своем составе практически всех известных классов фосфолипидов морского происхождения, обладающих репаративными свойствами. Химическая структура фосфолипидов, содержащихся в экстракте таллома ульвы аналогична структуре эндогенных фосфолипидов прототипа, однако, благодаря высокому содержанию в них полиненасыщенных (эссенциальных) жирных кислот, фосфолипиды в составе экстракта ульвы продырявленной более активны. Встраивание этих высокоэнергетических молекул в мембраны клеток облегчает процесс регенерации мембран гепатоцитов. Жирно-кислотный состав фракции общих липидов заявленного средства отличается высокой степенью ненасыщенности и содержит в своем составе весь ряд полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейства n-3, необходимых для преобразования лизофосфолипидов в основные структурные компоненты мембран - фосфатидилхолин (ФХ) и фосфатидилэтаноламин (ФЭ), а также метаболически активные фракции - фосфатидилсерин (ФС), фосфатидную кислоту (ФК), фосфатидилинозит (ФИ) и дифосфатидилглицерин (ДФГ).

При этом необходимо отметить, что биологическая активность липидного комплекса ульвы продырявленной Ulva fenestrate P. et R. ранее не изучалась.

В качестве сырья для получения средства используют таллом ульвы продырявленной. Ульва продырявленная Ulva fenestrate P. et R. относится к отделу зеленых водорослей. Широко распространена в морях Дальнего Востока и часто является ценозообразующим видом, является наиболее важным в хозяйственном отношении видом зеленых водорослей. Она богата углеводами, азотистыми веществами и липидами и широко используется как пищевой продукт высокой биологической ценности.

Использование таллома, по мнению заявителя, связано с тем, что он является той частью растения, которая в процессе жизнедеятельности характеризуется максимальной скоростью роста, что требует постоянного биосинтеза мембраноактивных липидов для построения клеточных и субклеточных мембран вновь образующихся клеток. Это определяет максимальное содержание липидов в талломе в период вегетации.

Липидную фракцию из спиртового экстракта получают способом, обычным для выделения липидов из растительного и животного сырья (Folch J., Less М., Sloane-Stanley G.H., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.//J. Biol. Chem. 1957. 226, N 1. P.497-509).

Образцы водоросли Ulva fenestrate P. et. R. (тип Chlorophyta, класс Ulotrichophyceae, отряд Ulvales) собирали летом в заливе Петра Великого Японского моря. Собранные водоросли тщательно очищали от эпифитов, небольших беспозвоночных и частиц песка. Водоросли промывали морской водой и затем нагревали 2 мин в кипящей воде для инактивации ферментов. Обработанные таким способом водоросли сушили до суховоздушного состояния. Высушенный таллом измельчали с помощью лабораторной мельницы до размеров частиц 0,5-1 мм и экстрагировали 96% этиловым спиртом в соотношении сырье - экстрагент 1:2 в течение 8 часов при непрерывном перемешивании. Экстракт отделяли на воронке Бюхнера под вакуумом. Жмых заливали новой порцией спирта до образования зеркала и реэкстрагировали при перемешивании в течение двух часов. Экстракты объединяли, затем упаривали спирт под вакуумом при температуре менее 37°C. Полученную маслообразную массу экстрагировали смесью хлороформ: этанол (2:1). Для разделения фаз к экстракту добавляли 20% по объему 0,73% раствора хлористого натрия. После разделения фаз хлороформный слой, содержащий липиды, отделяли на делительной воронке и упаривали на роторном испарителе (T <37°C) до отсутствия запаха хлороформа. Липидный экстракт представляет из себя маслообразную массу зеленовато-болотного цвета. Экстракт для фармакологического тестирования предварительно растворяли в вазелиновом масле 1:2.

Выход липидного экстракта составил 3,5% от массы сухой водоросли. При изучении состава полученного извлечения было выявлено, что 80% составляют общие липиды, из которых 70% относятся к категории мембраноактивных компонентов. В качестве мембраноактивной фракции принимали сумму эссенциальных фосфолипидов и нейтральных липидов, за вычетом триацилглицеринов, которые, по мнению ряда авторов непосредственно не входят в состав биологических мембран (Kostetsky E.Y., Goncharova S.N., Sanina N.M., Shnyrov V.L., Season influence on lipid composition of marine macrofites // Botanica Marina. - 2004. - Vol.47, No 2. - P.134-139). Эссенциальные фосфолипиды составляли 20% мембраноактивной фракции липидов. Важным элементом этой композиции является высокое содержание в составе фосфолипидов ПНЖК семейства n-3 - предшественниц биологически активных эйкозаноидов. Известно, что именно содержание n-3 ПНЖК в морских организмах в большинстве случаев определяет ценность последних в качестве лекарственного сырья. Подробный состав липидной фракции, выделенной из таллома Ulva fenestrata, представлен в таблице №1.

Нетоксичность (ЛД₅₀ составляет более 5000 мг/кг) и безопасность при длительных введениях в желудок и парэнтерально позволили провести экспериментальные исследования, которые выявили выраженное гепатопротекторное действие экстракта на модели интоксикации четыреххлористым углеродом (ЧХУ). В качестве сравнения использовали препарат «Эссенциале»® («Рон-Пуленк Рорер», Германия), являющийся полиненасыщенным фосфатидилхолином соевых бобов. Эссенциале, как эталонный гепатопротектор, рекомендован официальными изданиями Фармакопейного комитета в качестве препарата сравнения при испытании новых средств, обладающих гепатопротекторными свойствами, содержащими фосфолипиды (Венгеровский А.И., Маркова И.В. и др., Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. 2000. С.228-231).

Эксперимент проводили на крысах-самцах Вистар массой тела 130-180 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Экспериментальную модель острого токсического гепатита (интоксикация четыреххлористым углеродом-ЧХУ) на животных (крысах) и введение препаратов осуществляли согласно руководству для проведения доклинических испытаний (Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета. 1999. №1. С.9-12). Для создания острого гепатита животным вводили подкожно (в дорзальную шейную складку) 2 мл/кг ЧХУ в 50% масляном растворе (оливковое масло) ежедневно в течение 4 дней. С 5-го дня эксперимента крысы получали в течение 7-и дней внтурижелудочно 80 мг/кг эссенциале (в вазелиновом масле) (Саратиков А.С, Ратькин А.В., Фролов В.Н., Чучалин B.C. Влияние гепатопротекторов фосфолипидной природы на токсичность циклофосфана // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2004. №2. С.43-47) или липидный экстракт таллома ульвы продырявленной в дозе 80 мг/кг мембраноактивной фракции (в форме масляного раствора). Животным контрольных групп вводили эквиобъемное количество вазелинового масла. Через сутки после последнего введения препаратов крыс декапитировали под эфирным наркозом.

Терапевтическую эффективность гепатопротекторов оценивали по их влиянию на выживаемость животных, весовые характеристики и биохимические показатели печени. В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и содержание малонового диальдегида (МДА), в печени определяли показатели липидного обмена.

Животные были разделены на следующие группы: 1-я - контрольная (интактные); 2-я - введение ЧХУ в течение 4 дней; 3-я - введение ЧХУ с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я - ведение экстракта из ульвы в период депривации в течение 7 дней; 5-я - введение эссенциале в период депривации в течение 7 дней.

В процессе эксперимента после 4-дневного введения ЧХУ масса животных снизилась на 21% (p<0,001), а масса печени животных увеличилась на 19% (p<0,05) (Таблица 2).

При внешнем осмотре у животных шерсть была тусклой, слипшейся в отдельные образования. Животные были слабо подвижны, плохо ели корм. В печени отмечалась сплошная зернистость жировых включений, то есть проявлялась выраженная жировая инфильтрация, характерная при интоксикации ЧХУ. Это подтверждается тем фактом, что количество общих липидов в печени превышало контрольный уровень в 3,5 раза (Таблица 3).

О развитии токсического гепатита в данной экспериментальной модели свидетельствует повышение активности в крови маркерного фермента печени АлАТ в 7 раз (p<0,001), обусловленное выходом фермента из гепатоцитов в кровь в результате повышения проницаемости мембран. Одним из показателей токсического гепатита является активация перекисного окисления липидов. Увеличением количества малонового диальдегида (МДА) в 2 раза (p<0,001) при введении ЧХУ характеризует высокую активность перекисного окисления жирных кислот, входящих в состав мембранных фосфолипидов, что сопровождается повышением проницаемости мембран гепатоцитов.

Развитие токсического гепатита сопровождается увеличением количества триацил глицеринов (ТАГ), свободных жирных кислот (СЖК) и холестерина (ХС) при одновременном снижении их этерифицированных форм (ЭЖК и ЭХС) в связи с угнетением этерифицирующей функции печени (Таблица 4).

Как видно из таблицы 4, после интоксикации ЧХУ в печени крыс на 11% (p<0,01) увеличилось количество ТАГ, на 15-16% (p<0,01-0,001) увеличилось количество СЖК и ХС, при одновременном снижении ЭЖК на 16% (p<0,01) и ЭХС на 25% (p<0,01). Механизм данных нарушений обусловлен распадом триацилглицеринов в жировой ткани (химический стресс), выходом жирных кислот и глицерина в кровь и их ресинтезом в триацилглицерины в печени. Так как синтез фосфолипидов из триацилглицеринов нарушен, то жирные кислоты и ТАГ накапливаются в гепатоцитах, что обусловливает развитие жировой инфильтрации. Факт низкого уровня ЭХС (снижение на 25%, p<0,001) свидетельствует о нарушении этерифицирующей функции печени в связи с ингибированием фермента АХАТ (ацил-КоА: холестерин-ацилтрансфераза) при интоксикации ЧХУ.

В фосфолипидном спектре печени следует отметить среди холиносодержащих фракций достоверное снижение ФХ на 7% (p<0,01) при одновременном увеличении ЛФХ на 36% (p<0,001) и СМ на 26% (p<0,05) (Таблица 5).

ФХ входит в структуру наружного монослоя мембран и является преобладающим по количеству фосфолипидом. Известно, что при активации свободнорадикальных процессов, в первую очередь, подвергаются окислению полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) фосфолипидов мембран, что и вызывает уменьшение содержания их основных структурных компонентов, в частности, ФХ. Среди этаноламиновых фракций следует отметить снижение количества ФЭ на 10% (p<0,05), ФС на 23% (p<0,01) и увеличение ЛФЭ на 50% (p<0,001). Факт роста лизофракций фосфолипидов (ЛФХ и ЛФЭ) обусловлен повышением активности фосфолипазы A₂. Накопление лизофракций фосфолипидов в мембране гепатоцитов способствует повышению проницаемости их мембран. Компенсаторным механизмом на повышение проницаемости мембран является увеличение количества СМ, являющегося совместно с холестерином ее стабилизатором.

Подтверждением высокой активности фосфолипаз при интоксикации ЧХУ является увеличение количества фосфатидной кислоты (ФК), которая является основой в структуре фосфолипидов. Снижение количества дифосфатидилглицерина (ДФГ) на 24% (p<0,001) определяет нарушение в системе фосфорилирования и синтеза АТФ, так как этот фосфолипид является маркером митохондрий и необходим для функционирования ферментов дыхательной цепи.

На основании вышеизложенного следует отметить, что выполненная экспериментальная модель интоксикации ЧХУ действительно способствовала развитию токсического гепатита с нарушением метаболических реакций печени. Это проявлялось:

• в увеличении массы печени за счет жировой инфильтрации гепатоцитов;

• в нарушении проницаемости мембран и выходе маркеров цитолиза в кровь (АлАТ);

• в активации перекисного окисления липидов;

• в увеличении интенсивности липолитических процессов;

• в нарушении этерифицирующей функции печени.

Через 7 дней после отмены ЧХУ (период депривации) в печени подопытных животных (3-я группа) большинство изученных параметров не нормализовалось, что свидетельствовало о продолжающемся токсическом стрессе и недостаточности собственных защитных сил организма противостоять развитию токсической патологии.

Масса животных в период депривации (Таблица 2) изменилась незначительно относительно 2-й группы (ЧХУ) (увеличение на 8%), тогда как относительно контроля сохранялась достоверно низкой (на 15%, p<0,001). Масса печени животных понизилась на 6% (p<0,05) относительно 2-й группы (ЧХУ), но в то же время, еще достоверно превышала контрольный уровень на 12%. В печени при вскрытии имелись зернистые включения липидов. Животные при внешнем осмотре были слабо подвижны, плохо ели корм, шерсть была тусклой. Количество общих липидов (Таблица 3) в печени относительно 2-й группы снизилось на 15%, тогда как относительно контрольного уровня их величина превышала в 3 раза (p<0,001). О сохранении токсического гепатита в данной группе животных свидетельствует достоверно высокая относительно контроля (на 32%, p<0,05) активность маркерного фермента печени АлАТ. Также сохранялся высокий уровень МДА (на 64%, p<0,001), что определяет продолжающийся процесс перекисного окисления липидов. То есть, в период депривации токсический стресс продолжается из-за присутствия продуктов метаболизма ксенобиотика, а также из-за истощения антиоксидантной защиты.

В период депривации количество ТАГ стало еще выше, чем во 2-й группе (увеличение на 22%, p<0,001) (Таблица 4). Также увеличилось количество СЖК (на 26%, p<0,001). В то же время величины ЭЖК и ЭХС остались на уровне таковых, зарегистрированных во 2-й группе (интоксикация ЧХУ). То есть, этерифицирующая функция печени не восстановилась и процесс развития жировой инфильтрации продолжился.

Анализ фракционного состава фосфолипидов печени в период отмены ЧХУ показал, что содержание ЛФХ и ЛФЭ стало еще выше (в 2 раза превысило контрольный уровень). Это свидетельствует о дальнейшем усилении перекисного окисления липидов и активности фосфолипаз. Содержание основных структурных компонентов мембран гепатоцитов - ФХ и ФЭ претерпело дальнейшее снижение по сравнению со 2-й группой, а по сравнению с контролем достоверно снизилось в среднем на 9-12% (p<0,01-0,001). Также еще ниже, чем во 2-й группе, было количество ФИ, ФС и ДФГ, необходимых для функционирования мембраносвязанных ферментов. Обращает на себя внимание тот факт, что количество СМ стало еще выше (на 48% по сравнению с контролем; p<0,001), обусловленное компенсаторной реакцией на нарушение проницаемости мембран.

Таким образом, данные по анализу исследованных биохимических параметров печени указывают на продолжающиеся и углубляющиеся нарушения метаболических реакций даже в отсутствие токсического агента (период депривации).

Исследования по применению известного гепатопротектора эссенциале и экстракта из ульвы в период отмены ЧХУ показали, что полученный биологический эффект влияния был, в общем, идентичен, но в ряде случаев имел разную степень выраженности (таблицы 1-4; 4-я и 5-я группы). При действии обоих препаратов отмечалась выраженная тенденция к нормализации исследуемых показателей. Так, отмечалось восстановление весовых характеристик животных (увеличение веса относительно 3-й группы), в среднем, на 19% (p<0,001) в 4-й группе (экстракт таллома ульвы) и 9% (p<0,01) в 5-й группе (эссенциале). Обращает на себя внимание факт соответствия массы печени животных контрольным значениям. У животных шерсть стала гладкой, пушистой, они начали хорошо есть и активно двигаться. В то же время при введении экстракта из ульвы количество общих липидов в печени относительно контроля полностью нормализовалось, тогда как при введении эссенциале эта величина была на 20% (p<0,05) выше. Однако при сравнении с группой депривации (3 группа) величины были снижены почти в 3 раза.

Тот факт, что активность маркерного фермента токсического гепатита АлАТ достоверно не отличалась от контрольных значений при введении экстракта из ульвы, свидетельствует о его мембраностабилизирующих свойствах. В то же время при введении эссенциале активность АлАТ была достоверно выше контрольного уровня на 23% (p<0,05), что свидетельствует о не полном восстановлении структуры мембран гепатоцитов. При сравнении показателей перекисного окисления липидов мембран (МДА) следует отметить, что в 4-й группе (экстракт ульвы) произошло восстановление этого показателя до контрольных величин. В то же время в группе животных с введением эссенциале величина МДА была на 20% (p<0,05) выше контроля. Однако относительно 3-й группы (депривация) значение МДА было снижено при введении обоих препаратов, соответственно, на 40 и 26% (p<0,001).

При исследовании показателей нейтральных липидов печени после введения препаратов обращает на себя внимание выраженное снижение количества ТАГ, СЖК и ХС при одновременном увеличении ЭЖК и ЭХС относительно 3-й группы (Таблица 4). По сравнению с контролем достоверные различия имеются в 5-й группе (эссенциале). Так, количество ТАГ оставалось повышенным на 7% (p<0,01), количество СЖК - на 11% (p<0,05), ХС - на 7% (p<0,05). При этом количество ЭЖК было снижено на 13% (p<0,01), а ЭХС - на 12% (p<0,001). Таким образом, эссенциале не полностью снял жировую инфильтрацию и не окончательно восстановил этерифицирующую функцию печени. Экстракт таллома ульвы полностью нормализовал исследованные биохимические параметры нейтральных липидов и показал более высокую эффективность в восстановлении функции печени.

При сравнении показателей фосфолипидных фракций в ткани печени 4-й группы с таковыми в контроле следует отметить, что введение экстракта таллома ульвы полностью нормализовало исследуемые параметры (Таблица 5). При введении эссенциале отмечались достоверные отличия показателей фосфолипидного обмена от контрольных величин: содержание ЛФХ превышало на 20% (p<0,01), а количество ЛФЭ - на 35% (p<0,001). Особенно значимые отличия наблюдались в содержании метаболически активных фракций: количество ФС было ниже контрольного уровня на 14% (p<0,05), ФИ - на 20% (p<0,001), ФК - на 29% (p<0,001), ДФГ - на 31% (p<0,001).

При сравнении исследованных показателей между 4-й и 5-й группами (экстракт таллома ульвы с эссенциале) отмечались выраженные достоверные различия. Так, при введении эссенциале масса животных после интоксикации ЧХУ была на 8% (p<0,01) меньше, а масса печени на 7% (p<0,01) больше, чем таковые показатели при введении экстракта таллома ульвы. Количество общих липидов печени было выше на 18% (p<0,05), активность АлАТ - на 15% (p<0,05), а количество МДА - на 22% (p<0,001). Среди нейтральных липидов обращает на себя внимание более высокий уровень холестерина (на 4%, p<0,05) и низкий - эфиров холестерина (на 9%, p<0,01). Различия отмечались и в содержании фракций фосфолипидов: количество ЛФХ было выше на 37% (p<0,001), ЛФЭ - на 30% (p<0,001). Одновременно отмечалось более низкое содержание ФС (на 20%, p<0,001), ФИ (на 15%, p<0,05), ФК (на 32%, p<0,001), ДФГ (на 33%, p<0,001).

Преимущества введения экстракта таллома ульвы продырявленной в период депривации по сравнению с эссенциале были следующими:

• масса животных и печени, активность АлАТ, величина МДА полностью восстановились;

• величина ХС ниже (на 4%, р<0,05), ЭХС выше (на 9%, p<0,01);

• количество лизофракций фосфолипидов ниже на 20-30% (p<0,001);

• количество метаболически активных фракций (ФС, ФИ, ФК, ДФГ) выше на 15-33% (p<0,001).

Введение экстракта таллома ульвы и эссенциале способствовало коррекции нарушений, вызванных интоксикацией ЧХУ, однако восстановление измененных параметров под действием экстракта таллома ульвы оказалось более эффективным.

По-видимому, основной причиной наблюдаемого различия является то, что биологической активности полиненасыщенного фосфатидилхолина соевых бобов, входящего в состав эссенциале, противопоставлен многокомпонентный комплекс экстракта таллома ульвы продырявленной. Большая эффективность экстракта, по мнению заявителя, обусловлена наличием в его составе практически всех известных классов фосфолипидов морского происхождения, обладающих репаративными свойствами. При этом их жирно-кислотный состав отличается высокой степенью ненасыщенности и содержит в своем составе ПНЖК семейства n-3, необходимые для преобразования лизофосфолипидов в основные структурные компоненты мембран - ФХ и ФЭ, а также метаболически активные фракции - ФС, ФК, ФИ и ДФГ.

Кроме того, n-3 ПНЖК метаболиты, входящие в состав фосфолипидов заявляемого средства, проявляют противоспалительное действие, в отличие жирных кислот семейства n-6, входящих в состав активного агента Эссенциале.

Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует:

1. Экстракт таллома ульвы продырявленной обладает выраженным гепатозащитным действием при поражении печени четыреххлористым углеродом.

2. Механизм терапевтического действия экстракта таллома ульвы продырявленной обусловлен восстановлением нарушенных токсикантом метаболических реакций печени:

• Стабилизирует мембраны гепатоцитов за счет встраивания фосфолипидов в пределах липидного бислоя плазматической мембраны;

• Нормализует структуру мембран гепатоцитов и тормозит выход в кровь печеночных ферментов (АлАТ);

• Снимает жировую инфильтрацию печени;

• Активирует этерифицирующую функцию печени, что способствует синтезу фосфолипидов из триацилглицеринов.

3. По исследованным показателям экстракт таллома ульвы продырявленной показывает более высокую биологическую активность, чем эссенциале.

Таблица 1 Химический состав липидной фракции таллома ульвы продырявленной (Ulva fenestrate) Биохимические параметры Показатели Общие липиды 28,05 мг на 1 г сухой ткани Общие фосфолипиды 3,41 мг на 1 г сухой ткани Общие нейтральные липиды 24,64 мг на 1 г сухой ткани Фракции нейтральных липидов (в % от суммы всех фракций) Диацилглицерины 12,16±0,54 Холестерин 13,32±1,19 Свободные жирные кислоты 11,11±1,02 Триацилглицерины 33,49±1,39 Эфиры жирных кислот 9,24±0,81 Эфиры холестерина 8,75±0,62 Остаточная фракция 11,93±1,00 Фракции фосфолипидов (в % от суммы всех фракций) Дифосфатидилглицерин 6,61±0,40 Фосфатидилглицерин 8,03±0,38 Фосфатидилэтаноламин 28,59±0,52 Фосфатидилхолин 7,95±0,57 Лизофосфатидилэтаноламин 7,62±0,53 Лизофосфатидилхолин 8,71±0,38 Фосфатидилинозит 12,91±0,47 Фосфатидилсерин 11,34±0,50 Фосфатидная кислота 8,24±0,38 Жирные кислоты (в % от суммы всех фракций) 14:0 2,00±0,22 16:0 16,16±0,34 16:1 n-7 3,60±0,07 16:4 n-3 14,24±0,85 18:1 n-9 7,00±0,14 18:2 n-6 7,40±0,22 18:3 n-3 19,80±0,36 18:4 n-3 21,20±1,15 20:4 n-6 5,00±1,08 20:5 n-3 3,60±0,43

Таблица 2 Весовые характеристики крыс после поражения четыреххлористым углеродом и введения экстракта таллома ульвы и эссенциале (г; M±m) Группы животных Масса животных Масса печени 1 группа 246,67±4,91 7,72±0,45 Контроль     2 группа 195,83±4,36*** 9,21±0,44* ЧХУ     3 группа 210,83±4,90*** 8,62±0,23 Депривация (ЧХУ)     4 группа ***250,00±4,13 *7,47±0,12 Депривация + экстракт таллома     ульвы     5 группа **230,00±4,00**^{, 2} *8,00±0,13² Депривация + эссенциале     Примечание: различия статистически достоверны при *^{., 1}-p<0,05;**^{, 2}-p<0,01; ***^,3-p<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация), цифры справа - сравнение с 4-й группой.

Таблица 2 Биохимические показатели печени крыс после поражения четыреххлористым углеродом и введении экстракта таллома ульвы и эссенциале (M±m) Группы животных Общие липиды (мг/г ткани) Активность АлАТ (Ед/л) МДА (нмоль/мл плазмы) 1 группа Контроль (интактные) 42,17±1,97 43,80±4,25 3,43±0,30 2 группа ЧХУ 142,09±7,22*** 307,71±65,30*** 7,27±0,15*** 3 группа Депривация (ЧХУ) 120,46±12,33*** 58,03±1,75*** 5,61±0,19*** 4 группа Депривация+экстракт таллома ульвы ***42,87±2,20 ***46,79±2,54 ***3,38±0,10 5 группа Депривация + эссенциале ***50,68±2,51*^{, 1} 53,77±2,51*^{, 1} ***4l3±0,11*^{, 3} Примечание: различия статистически достоверны при *^{, 1}-p<0,05; **-p<0,01; ***-p<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация), цифры справа - сравнение с 4-й группой.

Таблица 4 Содержание фракций нейтральных липидов в печени крыс после поражения четыреххлористым углеродом и введении экстракта таллома ульвы и эссенциале (M±m) Пара-метры 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа Контроль (интактные) ЧХУ Депривация Депривация + экстракт таллома ульвы Депривация + эссенциале ТАГ 23,84 26,51** 29,18*** ***24,90 **25,57**   ±0,33 ±0,68** ±0,96 ±0,43 ±0,32 СЖК 14,26 16,55** 17,90*** **15,42 *15,87*   ±0,44 ±0,53 ±0,54 ±0,41 ±0,56 ЭЖК 16,16 13,55** 13,19** *14,91 14,00**   ±0,51 ±0,52 ±0,62 ±0,48 ±0,50 ХС 17,55 20,16*** 19,54** *18,00 18,80*^{, 1}   ±0,48 ±0,40 ±0,55 ±0,46 ±0,34 эхе 17,24 12,89*** 13,14*** ***16,69 *15,24***^{, 2}   ±0,33 ±0,59 ±0,68 ±0,34 ±0,35 Оста- 10,95 10,34 7,05 10,08 10,52 точная ±0,23 ±0,51 ±0,89 ±0,70 ±0,44 фракция           Примечание: различия статистически достоверны при *^,-p<0,05;**-p<0,01;***-p<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация), цифры справа - сравнение с 4-й группой.
Сокращения: ТАГ - триацилглицерины, СЖК - свободные жирные кислоты, ЭЖК - эфиры жирных кислот, ХС - холестерин, ЭХС - эфиры холестерина.

Таблица 5 Содержание фракций фосфолипидов в печени крыс после поражения четыреххлористым углеродом и введении экстракта таллома ульвы и эссенциале (M±m) Показа-тели 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа Контроль ЧХУ Депривация Депривация Депривация (интактные)     +экстракт +эссенциале       таллома         ульвы   ФХ 45,14 42,31** 41,19 **45,92 **45,80   ±0,57 ±0,79 ±0,82 ±0,93 ±0,92 ЛФХ 4,61 6,28*** 7,40 ***4,02 ***5,51**^,3   ±0,20 ±0,27 ±0,15 ±0,25 ±0,18 см 7,70 *
9,67 ***
11,43 ***7,00 ***8,72³   ±0,46 ±0,69 ±0,56 ±0,16 ±0,22 ФЭ 22,57 20,23" 19,90 *22,63 **22,55   ±0,73 ±0,73 ±0,54 ±0,88 ±0,71 ЛФЭ 3,41 5,1 Г" 5,80"" ***3,55 ***4,60***^{, 3}   ±0,14 ±0,13 ±0,22 ±0,17 ±0,11 ФС 4,28 3,28" 3,40 ***4,63 3,70*^{, 3}   ±0,23 ±0,13 ±0,10 ±0,30 ±0,17 ФИ 4,86 3,86*" ***
3,44 ***4,60 *3,91***^{, 1}   ±0,11 ±0,11 ±0,08 ±0,27 ±0,14 ФК 2,99 5,89""" 4,21 ***3,11 ***2,13***^{, 3}   ±0,09 ±0,18 ±0,07 ±0,17 ±0,10 ДФГ 4,44 3,37 жжж
3,23 ***4,54 3,08***^{, 3}   ±0,14 ±0,07 ±0,12 ±0,21 ±0,06 Примечание: различия статистически достоверны при *^{, 1}-p<0,05; **^, 2-р<0,01; ***^{, 3}-р<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева -сравнение с 3-й группой (депривация), цифры справа - сравнение с 4-й группой.
Сокращения: ФХ - фосфатидилхолин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, СМ - сфингомиелин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин, ФС - фосфатидилсерин, ФИ - фосфатидилинозит, ФК - фосфатидная кислота, ДФГ - дифосфатидилглицерин.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к гепатопротекторному средству. Гепатопротекторное средство на основе липидной фракции из спиртового экстракта таллома ульвы продырявленной - Ulva fenestrate P. et R., содержащей до 70% мембраноактивных липидных компонентов, включая не менее 20% эссенциальных фосфолипидов с содержанием полиненасыщенных жирных кислот семейства n-3 не менее 55%. Вышеописанное средство обладает эффективным гепатопротекторным действием, способствует ускоренному восстановлению каскадов метаболических реакций, обеспечивая нормализацию биохимических показателей углеводного и липидного обмена. 5 табл.

Гепатопротекторное средство на основе липидной фракции из спиртового экстракта таллома ульвы продырявленной - Ulva fenestrate P. et R. (отдел Chlorophyta - зеленые водоросли, класс Ulotrichophyceae, порядок Ulvales - ульвовые), содержащей до 70% мембраноактивных липидных компонентов, включая не менее 20% эссенциальных фосфолипидов с содержанием полиненасыщенных жирных кислот семейства n-3 не менее 55%.