СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2010 года по МПК A61K36/03 A61P1/16 

Изобретение относится к биологическим составам на основе экстрактов растительного происхождения и может быть использовано в качестве гепатопротектора, а также средства, повышающего сопротивляемость организма к воздействию химических веществ техногенного происхождения, отравлениям промышленными ядами и лекарствами.

В связи с прогрессирующим ухудшением экологической обстановки человек все более активно подвергается воздействию различных веществ техногенного происхождения. В нашей стране гигиеническое регламентирование охватывает в настоящее время около 2 тыс. вредных химических веществ, для которых установлено более 3 тыс. гигиенических нормативов предельно допустимого содержания в различных объектах окружающей среды. Влияние стрессовых ситуаций (гипо- и гипертермия, высокая физическая нагрузка, дыхание гипоксическими смесями, нахождение в зоне техногенных катастроф и др.), несбалансированное питание, алкоголизм настоятельно требуют поиска нетрадиционных подходов к фармакопрофилактике возникающих нарушений в организме. Известно, что основным барьером, нейтрализующим токсические загрязнения в организме человека и животных, является печень. Заболевания печени и билиарной системы составляют 40% в группе нозологических форм, относящихся к патологии пищеварительной системы.

В настоящее время ведется активный поиск гепатопротекторных средств, повышающих устойчивость печени к патологическим воздействиям, усиливающих ее обезвреживающие функции путем повышения активности ферментной системы, а также способствующих восстановлению ее функций при различных повреждениях, в том числе при отравлении промышленными ядами.

Известны препараты, обладающие гепатопротекторным действием, относящиеся к классу растительных полифенольных соединений. Это ряд лекарственных препаратов, близких по составу и действию, которые производятся в разных странах под различными названиями: "Силимарин", "Силибор", "Силибинин", "Карсил" и др.

В качестве средств, обладающих гепатопротекторным эффектом, известны также экстракты из гребней калины (п. РФ №2177330, опубл. 27.12.2001 г.), лимонника китайского (п. РФ №2179031, опубл. 10.02.2002 г.) и экстракт биомассы Maackia amurensis Rupr.et Maxim (п. РФ №2244553, опубл. 20.01.2005), экстракт из гребней аралии маньчжурской (п. РФ №23299056, опубл. 20.07.2008)

Наиболее близким к заявляемому средству является известный, широко применяемый в медицине препарат "Легалон", содержащий в своем составе в качестве активного агента группу растительных полифенолов-флавоноидов, выделенных из плодов расторопши пятнистой. Препарат «Легалон» (далее легалон) является эталонным гепатопротектором, который рекомендован официальными изданиями Фармакопейного комитета в качестве препарата сравнения при испытании новых средств, обладающих гепатопротекторными свойствами растительной природы (Венгеровский А.И., Маркова И.В. и др. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. 2000. С.228-231). Препарат выпускается в виде драже, капсул и суспензий.

Легалон обладает гепатопротекторным и антитоксическим действием. Механизм действия связан с ингибированием перекисного окисления липидов, вследствие чего предотвращается разрушение клеточных мембран. В поврежденных гепатоцитах препарат стимулирует синтез белков и фосфолипидов, в результате чего происходит стабилизация клеточных мембран, предотвращается потеря компонентов клетки, например трансаминаз. Препарат препятствует проникновению в клетку некоторых гепатотоксических веществ. (Лекарственные препараты зарубежных фирм в России, М., - Астрафармсервис, 1993, с.350).

Задачей изобретения является расширение ассортимента гепатопротекторных средств.

Поставленная задача решается средством, обладающим гепатопротекторным действием, на основе продукта экстракции этанолом слоевищ ламинарии японской - Laminaria japonica Aresch., семейства ламинариевых - Laminariaceae, содержащего до 30% полифенольных соединений.

Технический результат заключается в проявлении выраженного гепатопротекторного эффекта экстракта слоевищ ламинарии японской - Laminaria japonica Aresch, семейства аралиевых - Laminariaceae.

В качестве сырья для получения заявляемого средства используют слоевище ламинарии японской. Ламинария японская Laminaria japonica Aresch (далее ламинария) относится к отряду бурых водорослей. Она традиционно широко используется не только как пищевой продукта высокой биологической ценности, но как сырье для получения препаратов альгиновой кислоты (полисахаридный комплекс), применяющиеся в качестве энтеросорбентов. При этом известно, что бурые водоросли содержат значимые количества полифенольных соединений, доминирующей группой которых являются флоротаннины. Флоротаннины представляют собой полимеры флороглюцинола (1,3,5-тригидроксибензола) и могут составлять по литературным данным до 15% от сухого веса бурых водорослей (Ragan М.А., Golombitza R-W Phlorotannins, brow algal polyphenols. Progr. Phycol.Res. Vol.4, P.129-241, 1986). Однако нужно отметить, что биологическая активность полифенольного комплекса ламинарии японской Laminaria japonica Aresch подробно не изучена.

Авторы считают, что использование слоевищ ламинарии связано с тем, что именно они являются той частью растения, которая в процессе жизнедеятельности наиболее подвергается комплексному воздействию света, кислорода и токсичных веществ, растворенных в воде, что неизбежно приводит к образованию свободных радикалов и других активных оксидантов. При этом отсутствие явного оксидативного повреждения структурных компонентов предполагает наличие систем антиоксидантной защиты в их клетках. По мнению авторов, одним из компонентов такой защиты являются полифенольные соединения, содержащиеся в ламинарии. Они выступают в качестве акцепторов активной формы кислорода (АФК), хелаторов металлов, модуляторов ферментативной активности и ингибиторов перекисного окисления липидов и способны предохранять клетки слоевища от факторов неблагоприятного воздействия со стороны окружающей среды.

Экстракт из ламинарии получают одним из приведенных ниже способов:

- экстрагируют 95% этанолом свежие или замороженные слоевища ламинарии таким образом, чтобы концентрация этилового спирта в конечном экстракте составляла порядка 70%, как правило, при соотношении сырья к экстрагенту 1:2. Для этого свежие или замороженные слоевища ламинарии измельчают до размеров частиц, равных 0,1-0,5 см, и заливают этиловым спиртом. Экстракцию проводят методом мацерации при перемешивании в течение 48 часов. Выход экстракта 2 л на 1 кг исходного сырья.

- экстрагируют лиофилизованые и измельченные слоевища ламинарии 70% этиловым спиртом. Экстракцию проводят методом реперколяции. Выход экстракта составляет 1 л на 1 кг исходного сырья.

- экстрагируют суховоздушные и измельченные слоевища ламинарии 70% этиловым спиртом. Экстракцию проводят методом реперколяции. Выход экстракта составляет 1 л на 1 кг исходного сырья.

Такие параметры являются оптимальными, но не единственно возможными, поскольку экстракцию можно осуществлять этанолом с другой процентной концентрацией и при других соотношениях экстрагента и сырья, получая тот же качественный набор экстрактивных веществ, который и определяет гепатопротекторное действие средства. Сама же гепатопротекторная активность средства, в свою очередь, является суммарным действием как полифенольных соединений, так и других компонент, образующихся при экстракции заявляемого растительного сырья. Данные параметры определяют только количество перешедших в экстракт активных компонент сырья.

Сухой остаток полученного экстракта по данным колориметрического метода с использованием реактива Фолина-Дениса содержит до 30% полифенольных соединений. Кроме этого, в состав экстракта входят полисахариды: высокомолекулярный ламинарин, маннит, фруктоза, йодиды, витамины (B1, B2, B12, A, C, D, E, каротиноиды), соли калия, натрия, магния, брома, кобальта, железо, марганец, соединения серы и фосфора, азотсодержащие вещества, белки, углеводы, жиры и ряд других органических соединений.

Готовое средство на основе продукта экстракции слоевищ ламинарии обладает низкой токсичностью (ЛД₅₀ составляет 36 мл/кг) и не оказывает вредного действия при длительных введениях в желудок и парэнтерально, что позволяет провести экспериментальные исследования, которые выявили выраженнное гепатопротекторное действие экстракта на модели интоксикации четыреххлористым углеродом (CCl₄). В качестве сравнения использовали растительный полифенольный препарат «Легалон», выбранный в качестве прототипа.

Модель экспериментального гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом, CCl₄, считается эталоном поражения печени с проявлениями дисфункции органа (Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета. 1999. №1. С.9-12.). Действие яда обусловлено поражением эндоплазматического ретикулума, лизосом и других мембранных структур радикалами трихлорметина и хлорина, образующихся при метаболизме ксенобиотика в системе цитохрома Р-450. Кроме того, при функционировании этой системы образуются супероксиданионы, которые вызывают перекисное окисление липидов в мембранах (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. Л.: Медицина, 1986. 280 с.).

Эксперимент проводили на крысах-самцах Вистар массой тела 130-180 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Экспериментальную модель острого токсического гепатита (интоксикация CCl₄) на животных (крысах) и введение препаратов осуществляли согласно руководству для проведения доклинических испытаний (Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета. 1999. №1. С.9-12.). Крысам вводили подкожно (в дорзальную шейную складку) на протяжении 4 дней CCl₄ (50% раствор на оливковом масле) в дозе 2 мл/кг. Экстракт из ламинарии животным вводили перорально после последнего дня введения CCl₄ в дозе 0,2 мл на 100 г массы ежедневно в течение 7 дней.

Экстракт получали из слоевищ ламинарии способом, обычным для приготовления экстрактов из растительного сырья (Муравьев И.А. Технология лекарств: Учебник в 2-х томах. Москва. Медицина. 1980. 704 с.) Для этого слоевища ламинарии 1 кг высушивали при температуре, не превышающей 40°C, и измельчали для ускорения и улучшения процесса экстракции. Измельченное сырье экстрагировали методом реперколяции 70% спиртом. Выход экстракта составлял 1 л на 1 кг исходного сырья.

Для исключения влияния этанола исходный экстракт слоевищ ламинарии упаривали в вакуумном испарителе при температуре не выше 37°C до 1/3 объема, а затем доводили дистиллированной водой до первоначального объема. Обработанный таким способом экстракт слоевищ ламинарии использовали в эксперименте.

Легалон, препарат сравнения, вводили по этой же схеме в виде взвеси в 1% крахмальном клейстере в дозе 100 мг/кг массы тела. Выбор дозы для препарата сравнения осуществляли на основе литературных данных (Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета. 1999. №1. С.9-12.).

Животные были разделены на следующие группы: 1-я - контрольная (интактные); 2-я - введение CCl₄ в течение 4 дней; 3-я - введение CCl₄ с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я - ведение экстракта из ламинарии в период депривации в течение 7 дней; 5-я - введение легалона в период депривации в течение 7 дней.

Анализ полученных экспериментальных данных после 4-дневного введения CCl₄ показывает, что масса животных снизилась по сравнению с интактными на 21% (195,83±4,91 г против 246,67±4,91 в контроле, P<0,001), а относительная масса печени (г на 100 г массы тела) увеличилась на 50% (4,72±0,24 г против 3,14±0,15 в контроле, P<0,001) (Таблица 1).

При внешнем осмотре у животных шерсть была тусклой, слипшейся в отдельные образования. Животные были слабо подвижны, плохо ели корм. В печени отмечалась сплошная зернистость жировых включений, то есть проявлялась выраженная жировая инфильтрация, характерная при интоксикации CCl₄. Количество общих липидов в печени составляло 142,09 мг/г ткани, что превышало контрольный уровень (42,17 мг/г) в 3,5 раза (P<0,001) (Таблица 2).

О развитии токсического гепатита в данной экспериментальной модели свидетельствует повышение активности в крови маркерного фермента печени АлАТ в 7 раз (307,71±65,30 Ед/л против 43,80 Ед/л в контроле, P<0,001), обусловленное выходом фермента из гепатоцитов в кровь в результате повышения проницаемости мембран (Таблица 3).

Активность супероксиддисмутазы (СОД), ключевого фермента антиокислительной защитной системы, была в 2,5 раза ниже контрольного уровня (264,96±4,5 Усл.ед. против 669,17±4,48 Усл.ед в контроле, P<0,001) (Таблица 4).

Также отмечалось снижение активности глутатионпероксидазы (ГП) на 22% (0,750±0,062 мкмоль НАДФН/мин/мл плазмы против 0,961±0,024 мкмоль НАДФН/мин/мл плазмы в контроле, P<0,01) и глутатионредуктазы (ГР) на 38% (12.65±1.15 нмоль/мин/мл плазмы P<0,001) при одновременном снижении концентрации восстановленного глутатиона (Г-SH) на 18% (4.76±0.39 мкмоль/г Hb против 5,82±0,23 мкмоль/г Hb в контроле, P<0,05). Такие нарушения в показателях системы антиоксидантной защиты можно определить как ее истощение. Кроме того, выражено истощение антирадикальной защиты организма, что подтверждается снижением величины антирадикальной активности плазмы крови (АРА) на 45% (6,49±0,11 мкмоль Тролокса/л плазмы против 11,70±0,16 мкмоль Тролокса/л плазмы P<0,001),

Нарушения защитной системы печени сопровождались увеличением количества малонового диальдегида (МДА) в 2 раза (7,27 нмоль/мл плазмы против 3,43±0,3 нмоль/мл плазмы в контроле, P<0,001). Данный показатель характеризует высокую активность перекисного окисления жирных кислот, входящих в состав мембранных фосфолипидов, что сопровождается повышением проницаемости мембран гепатоцитов.

При исследовании показателей углеводного обмена после интоксикации CCl₄ отмечалось значительное снижение уровня глюкозы крови, которое составляло 2,954±0,14 ммоль/л, что на 36% ниже интактного контроля значений (4,61±0,25 ммоль/л, P<0,001), что обусловлено истощением гликогена (Таблица 5). Известно, что при токсическом поражении печени (химический стресс) активируется гликогенолиз для восполнения субстратов (глюкуроновая кислота) 2-й фазы системы детоксикации ксенобиотиков (Костюк В.А., Потапович А.А. Биорадикалы и биоантиоксиданты. - Минск: БГУ. 2004. - 174 с).

Снижение содержания окисленной формы НАД⁺ в печени по сравнению с контролем на 30% (0,244±0,018 мкмоль/г против 0,348±0,013 мкмоль/г в контроле, P<0,001) свидетельствует о нарушении протекания аэробных процессов, в частности реакций цикла Кребса. Наблюдаемое двукратное увеличение содержания лактата до 4,69±0,22 мкмоль/г (2,46±0,27 мкмоль/г в контроле) при одновременном снижении содержания пировиноградной кислоты на 28% (0,127±0,0133 мкмоль/г против 0,176±0,009 мкмоль/г в контроле, P<0,01) является результатом высокой интенсивности анаэробного гликолиза. Данный феномен обусловлен активацией пируват-лактатного челночного механизма для восстановления пула окисленной формы НАД⁺ из НАДН. Уменьшение соотношения НАД⁺/НАДН (по ЛДГ-реакции) до 244 (645 в контроле) указывает на сдвиг баланса окислительно-восстановительной системы в сторону образования восстановленных эквивалентов, что приводит к снижению НАД⁺-зависимых дегидрогеназ, блокированию аэробных процессов гликолиза, ингибированию глюконеогенеза и развитию в организме тканевой гипоксии (Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. - Новосибирск, 1983).

Таким образом, полученные результаты по воздействию CCl₄ на организм экспериментальных животных подтверждают развитие токсического гепатита.

Через 7 дней после отмены CCl₄ (период депривации) в печени подопытных животных (3-я группа) большинство исследуемых параметров не нормализовалось, что свидетельствовало о продолжающемся токсическом стрессе и недостаточности собственных защитных сил организма противостоять развитию токсической патологии.

Масса животных в период депривации изменилась незначительно относительно 2-й группы (CCl₄) (увеличение на 8%), тогда как относительно контроля сохранялась достоверно низкой (на 15%, P<0,001). Масса печени животных понизилась на 8% (P<0,05) относительно 2-й группы (CCl₄), но в то же время еще достоверно превышала контрольный уровень на 12% (P<0,05). В печени при вскрытии имелись зернистые включения липидов. Животные при внешнем осмотре были слабо подвижны, плохо ели корм, шерсть была тусклой. Количество общих липидов (Таблица 2) в печени относительно 2-й группы снизилось на 15%, тогда как относительно контрольного уровня их величина была превышена в 3 раза (P<0,001).

О сохранении токсического гепатита в данной группе животных свидетельствует достоверно высокая (на 32%, P<0,05) активность маркерного фермента печени АлАТ (Таблица 3).

При анализе показателей антиоксидантной защитной системы в период депривации (Таблица 4) следует отметить тенденцию к восстановлению, однако по сравнению с таковыми показателями в контроле были выявлены статистически достоверные различия: это низкая активность СОД (на 34%, P<0,001), ГП (на 17%, P<0,05). Отмечалось увеличение величины АРА относительно 2-й группы (на 32%, P<0,001), однако при сравнении с контролем ее величина была достоверно снижена на 27% (P<0,001). Также сохранялся высокий уровень МДА относительно контроля (на 63%, P<0,001), что определяет продолжающуюся высокую активность перекисного окисления липидов. То есть, в период депривации токсический стресс продолжается из-за присутствия продуктов метаболизма ксенобиотика, а также из-за истощения антиоксидантной защиты.

Исследование параметров углеводного обмена в период депривации (Таблица 5) показало восстановление до контрольного уровня глюкозы крови и пирувата. Однако относительно контроля сохранялся повышенный уровень лактата (на 41%, P<0,05) и низкий уровень НАД⁺(на 31%, P<0,001). В связи с этим коэффициент соотношения НАД⁺/НАДН был ниже контроля на 35% и составлял 422 (в контроле 645).

Таким образом, полученные экспериментальные данные указывают на продолжающиеся нарушения метаболических реакций даже в отсутствие токсического агента (в период депривации).

Исследования по применению экстракта из ламинарии в период отмены CCl₄ показали, что полученный биологический эффект влияния был в общем идентичен таковому при применении эталонного гепатопротектора легалона, но в ряде случаев имел разную степень выраженности (Таблицы 1-5; 4-я и 5-я группы).

Так, при действии обоих препаратов отмечалась тенденция к восстановлению весовых характеристик животных, которая была более выражена, чем у животных в группе с чистой депривацией. Для животных из группы, получавшей ламинарию, средняя масса животных составила 226,66±4,43 г, в группе, получавшей легалон, этот показатель был равен 225,00±4,40 г, что в среднем превышало таковую в 3-й группе (210,83±4,90 г) на 8% (P<0,05) (Таблица 1). Обращает на себя внимание факт снижения относительной массы печени (ОМП) до уровня контрольных значений. У животных 4-й (ламинария) и 5-й (легалон) групп ОМП составила 3,40±0,18 и 3,54±0,16 г/100 г массы тела соответственно, что было на 8-12% меньше (P<0.05), чем у животных из 3-й группы (4,10±0,13 г/100 г массы тела). При этом показатели 4-й и 5-й группы достоверно не отличались от интактного контроля (3,14±0,15 г/100 г массы тела). У животных шерсть стала гладкой, блестящей, они начали хорошо есть и активно двигаться. Количество общих липидов в печени также полностью нормализовалось относительно контроля и составило для 4-й группы (ламинария) 45,95±4,26 мг/г печени, для 5-й (легалон) 46,16±3,44 мг/г печени (Таблица 2), в контроле 42,17±1,97 мг/г печени. При этом в группе депривации этот показатель был почти в 3 раза выше, составлял 120,46±12,33 мг/г печени. То есть, оба препарата обладают выраженным гепатопротекторным эффектом, проявляющимся в снятии жирового перерождения печени.

Активность маркерного фермента токсического гепатита АлАТ в крови 4-й и 5-й групп крыс достоверно не отличалась от контрольных значений и составляла 47,77±2,51 и 43,79±2,54 Ед/л, соответственно (в контроле 43,80±4,25 Ед/л), что свидетельствует о мембраностабилизирующих свойствах исследуемых препаратов (Таблица 3). Данное явление, по мнению авторов, обусловлено локализацией мономеров и низкомолекулярных олигомеров флоротаннинов в пределах липидного бислоя плазматических мембран [Афанасьева Ю.Г., Фахретдинова Е.Р., Спирихин Л.В., Насибуллин Р.С. О механизме взаимодействия некоторых флавоноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран // Хим.-фарм. Журнал. 2007. №7. С.12-14.], следствием чего и является снижение ее проницаемости.

Исследование величин антирадикальной активности плазмы крови и биохимических показателей эндогенной системы антиоксидантной защиты при введении экстракта ламинарии показало, что относительно 3-й группы (депривация) произошло достоверное изменение биохимических показателей в сторону нормализации (Таблица 4). Активность СОД в 4-й группе (ламинария) составляла 649,65±6,80 усл., что на 48% превышало таковую в 3-й группе (438,40±1,76 усл.ед., P<0,001) и не имело достоверных отличий от показателей животных в контрольной группе (669,17±4,48 усл.ед.). Активность ферментов системы по наработке пула восстановленного глутатиона ГР и ГП в печени животных 4-й группы (ламинария) составила 21,08±1,01 нмоль/мин/мл плазмы и 0,974±0,66 мкмоль НАДФН/мин/мл плазмы, что соответствовало аналогичным показателям у животных контрольной группы (20,50±1,16 нмоль/мин/мл плазмы и 0,961±0,024 мкмоль НАДФН/мин/мл плазмы для ГР и ГП соответственно). У животных 3-й группы (чистая депривация) активность ГР была на 20% (17,53±2,24 нмоль/мин/мл плазмы), а ГП на 22% (0,797±0,062 мкмоль НАДФН/мин/мл плазмы) ниже, чем соответствующие показатели у животных, получавших экстракт ламинарии. Более низкая активность ферментов регенерации глутатиона сопровождалась тенденцией к его более низкому содержанию в печени животных 3-й группы (5,45±0,25 мкмоль/г Hb) по сравнению с аналогичным показателем у животных 4-й группы (5,85±0,46 мкмоль/г Нb), у которых она не отличалась от контрольных показателей (5,82±0,23 мкмоль/г Hb). В 5-й группе (легалон) все вышеупомянутые показатели достоверно не отличались от таковых у животных в контрольной группе.

Показатели уровня свободнорадикальных процессов (АРА) и перекисного окисления липидов (МДА) в плазме крови животных 4-й группы (ламинария) имели выраженную тенденцию к нормализации в отличие от аналогичных показателей животных 3-й группы (чистая депривация). Так АРА активность составляла 11,23 мкмоль Тролокса/л плазмы, что было на 31% (8,56±0,04 мкмоль Тролокса/л плазмы, P<0,001), чем у животных 3-й группы. Содержание МДА было на 29% (3,96±0,16 нмоль/мл плазмы, P<0,001) соответствующего показателя плазмы крови у животных 3-й группы (5,61±0,19 нмоль/мл плазмы). При этом значения указанных биохимических показателей у животных 4-й группы достоверно не отличались от контрольных (11,70±0,16 мкмоль Тролокса/л плазмы и 3,43±0,3 нмоль/мл плазмы) и показателей у животных, получавших эталонный гепатопротектор легалон (11,42±0,12 мкмоль Тролокса/л плазмы и 3,43±0,11 нмоль/мл плазмы). По мнению авторов, антиоксидантную и антирадикальную функцию берут на себя полифенольные соединения, входящие в состав растительных препаратов как «ловушки» свободных радикалов (Skottova, N., L. Kazdova, et al. (2004). "Phenolics-rich extracts from Silybum marianum and Prunella vulgaris reduce a high-sucrose diet induced oxidative stress in hereditary hypertriglyceridemic rats." Pharmacol Res 50 (2): 123-30).

Введение экстракта ламинарии после интоксикации CCl4 способствовало нормализации биохимических параметров углеводного обмена (Таблица 5). Отмечали достоверное снижение уровня лактата до 2,60±77 мкмоль/г против такового у животных 3-й группы (3,46±0,29 мкмоль/г, P<0,05) и увеличение содержания НАД⁺ до 0,304±0,019 мкмоль/г (в 3-й группе 0,241±0,017 мкмоль/г, P<0,05). Такое изменение биохимических показателей сопровождалось увеличением индекса НАД⁺/НАДН (ЛДГ реакция), который составил 613, что на 45% выше соответствующего показателя животных 3-й группы (422), что говорит о нормализации аэробного гликолиза и снятии тканевой гипоксии. Указанные значения биохимических показателей у животных 4-й группы не имели достоверного отличия от аналогичных у животных из группы интактного контроля.

Факт восстановления уровня антирадикальной активности печени, активности ферментов эндогенной системы антиоксидантной защиты (СОД, ГР, ГП), пула восстановленного глутатиона, концентрации лактата и более высокого содержания НАД+ свидетельствует о регуляции окислительно-восстановительного баланса в организме под действием полифенолов ламинарии, которые эффективно инактивируют свободные радикалы.

Полученные авторами экспериментальные результаты определенно свидетельствуют о том, что экстракт из ламинарии, содержащий полифенольный комплекс, проявляет выраженное антитоксическое действие при поражении CCl₄, способствует ускоренному восстановлению каскадов метаболических реакций, обеспечивая нормализацию биохимических показателей углеводного и липидного обмена, а также эндогенной системы антиоксидантной защиты.

Механизм терапевтического действия заявляемого средства обусловлен благоприятным влиянием полифенолов на нарушение токсикантом метаболизма и функций печени, что выражается в восстановлении активности ферментов системы антиоксидантной защиты (СОД, ГР, ГП), ингибировании свободнорадикальных реакций и уменьшении образования токсических продуктов липопероксидации; поддержании уровня восстановленного глутатиона и антирадикальной активности печени; восстановлении пула НАД+, снижении ацидоза и тканевой гипоксии; стабилизации мембран гепатоцитов.

В качестве факторов химической природы был избран, помимо CCl₄, тиопенталовый наркоз. Тиопентал вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 60 мг на кг массы тела через 2 часа после внутрижелудочного введения легалона (100 мг на кг массы тела) или экстракта из ламинарии (100 мг ОПФ на кг массы тела). Ни в одной из групп гибели не было. Время бокового положения у крыс при введении тиопентала составляло 56,2±2,21 мин. Предварительное введение препаратов сопровождается снижением времени бокового положения, которое составило для животных, получавших экстракт ламинарии японской 43,8±2,45 мин (P<0,05), для группы легалона 45,2±2,35 мин (P<0,05), что указывает на активацию монооксигеназной системы, осуществляющей биотрансформацию ксенобиотиков.

Следует отметить, что заявляемое средство не только не уступает эталонному гепатопротектору легалону по способности увеличивать антирадикальную активность печени, образование НАД⁺ и нормализации пула восстановленного глутатиона, но и более эффективно способствует восстановлению целостности клеточных мембран. Так, если активность АлАт в плазме крови животных, получавших экстракт ламинарии, не отличалась от интактного контроля, то таковая в группе с введением легалона была на 9% выше (Таблица 3). Данный факт имеет важное значение, так как именно при токсическом поражении CCl₄ основной мишенью являются мембраны, в частности, эндоплазматического ретикулума - места локализации цитохромов Р450. Цитохромы Р450 представляют собой интегральные мембранные белки эндоплазматического ретикулума, ответственные у млекопитающих за окисление лекарств, канцерогенов и токсичных веществ. Следовательно, более эффективное восстановление клеточных и субклеточных мембран обеспечивает более высокую активность системы детоксикации ксенобиотиков, что и наблюдалось в модели тиопенталового наркоза. Продолжительность тиопенталового сна у животных, получавших экстракт ламинарии, была короче, чем таковая в группе с введением легалона (Таблица 6).

Таким образом, исходя из полученных экспериментальных данных, следует:

1. Экстракт из ламинарии обладает выраженным гепатопротекторным действием как при поражении печени CCl₄, так и при введении тиопентала.

2. Механизм терапевтического действия экстракта из ламинарии обусловлен его благоприятным влиянием на нарушения метаболизма и функции печени под действием токсиканта:

- восстанавливает активность ферментов эндогенной системы антиоксидантной защиты СОД, ГП, ГР;

- сохраняет пул восстановленного глутатиона в системе антиоксидантной защиты печени за счет протонофорных свойств содержащихся в нем флоротаннинов;

- ингибирует свободнорадикальные реакции, повышает интегральную антирадикальную активность печени и уменьшает образование токсических продуктов липопероксидации;

- стабилизирует мембраны гепатоцитов за счет встраивания флоротаннинов ламинарии в пределах липидного би-слоя плазматической мембраны, нормализуя их структуру, и тормозит выход в плазму крови печеночных ферментов (АлАТ);

- снимает жировую инфильтрацию печени.

- восстанавливает пул окисленного НАД*, снижая ацидоз и повышая активность процессов энергообеспечения за счет активации аэробного гликолиза.

3. Исследованный экстракт из ламинарии не уступает выбранному в качестве сравнения эталонному гепатопротектору «легалон» по способности восстанавливать активность системы антиоксидантной защиты, увеличивать образование НАД⁺, нормализации пула восстановленного глутатиона, увеличивать антирадикальную активность печени, а по способности восстанавливать целостность клеточных мембран даже превосходит его.

Таким образом, заявляемое средство позволяет расширить ассортимент гепатопротекторных средств, при этом находят применение новые источники полифенольных соединений, не применяющиеся ранее для этих целей, в частности водоросли пищевого назначения (ламинария японская) из морей Дальнего Востока.

Таблица 1 Влияние растительных проепаратов на массу животных и печени после поражения четыреххлористым углеродом и введения экстракта из ламинарии (M±m) Группы животных Масса животных (г) Масса печени (г) 1 группа Контроль 246,67±4,91 7,72±0,35 2 группа Четыреххлористый углерод 195,83±4,36^*** 9,21±0,44^* 3 группа Депривация (CCl₄) 210,83±4,90^*** 8,62±0,23^* 4 группа Депривация+экстракт ламинарии ^*226,66±4,43" ^*7,68±0,28 5 группа Депривация+легалон ^*225,00±4,4^{** *}7,97±0,16 Примечание: различия статистически достоверны при ^* - P<0,05; ^** - P<0,01;^*** - P<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация).

Таблица 2 Влияние растительных препаратов на содержание общих липидов в печени крыс (M±m) Группы животных Общие липиды (мг/г ткани) 1 группа Контроль (интактные) 42,17±1,97 2 группа CCl₄ 142,09±7,22^*** 3 группа Депривация (CCl₄) 120,46±12,33^*** 4 группа Депривация (CCl₄)+экстракт ламинарии ^***45,95±4,26 5 группа Депривация (CCl₄)+Легалон ^***46,16±3,44 Примечание: различия статистически достоверны при ^* - P<0,05; ^** - P<0,01; ^*** - P<0,001, Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация).

Таблица 3 Влияние растительных препаратов на активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) в крови крыс после поражения четыреххлористым углеродом (M±m) Группы животных Активность АлАТ (Ед/л) 1 группа Контроль (интактные) 43,80±4,25 2 группа CCl₄ 307,71±65,30^*** 3 группа Депривация (CCl₄) 58,03±1,75^* 4 группа Депривация (CCl₄+Легалон ^***47,77±2,51 5 группа Депривация (CCl₄+экстракт ламинарии ^***43,79±2,54 Примечание: различия статистически достоверны при ^* - P<0,05; ^** - P<0,01; ^*** - P<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой, (депривация).

Таблица 4 Влияние растительных препаратов на показатели системы «Перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» в печени крыс после поражения четыреххлористым углеродом (M±m) Группы животных АРА (Ед. тролокса/мл плазмы) МДА (Нмоль/мл плазмы) СОД (Усл. Ед) ГПО (мкмоль НАДФН/мин/мл плазмы) ГР (нмоль/ мин/мл плазмы Г-SH (мкмоль/г Hg) 1 группа Контроль 11,70±0,16 3,43±0,3 669,17±4,48 0,961±0,024 20,50±1,16 5,82±0,23 2 группа CCl₄ 6,49±0,11^*** 7,27±0,15^*** 264,96±4,5^*** 0,750±0,062^** 12,65±10,15^*** 4,76±0,39^* 3 группа Депривация (CCl₄) 8,56±0,04^*** 5,61±0,19^*** 438,40±1,76^*** 0,797±0,062^* 17,53±2,24 5,45±0,25 4 группа Депривация + экстракт ламинарии ^***11,23±0,19 ^***3,96±0,16 ^***649,65±6,80 0,974±0,66 21,08±1,01 5,85±0,46 5 группа Депривация + легалон ^***11,42±0,12 ^***3,43±0,11 653,47±4,74 0,979±0,044 20,29±2,01 5,96±0,53 Примечание: различия статистически достоверны при ^* - P<0,05; ^** - P<0,01; ^*** - P<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация).

Таблица 5 Влияние растительных препаратов на содержание метаболитов углеводного обмена в печени и крови крыс после поражения четыреххлористым углеродом (M±m)   Глюкоза крови (ммоль/ л) Пируват (мкмоль/г) Лактат (мкмоль/г) НАД^* (мкмоль/г) НАД⁺/НАДН (ЛДГ-реакция) 1 группа Контроль (интактные) 4,61±0,25 0,176±0,009 2,46±0,27 0,348±0,013 645 2 группа CCl₄ 2,95±0,14^*** 0,127±0,013^** 4,69±0,22^*** 0,244±0,018^*** 244 3 группа Депривация (CCl₄) 4,21±0,34 0,162±0,008 3,46±0,29^* 0,241±0,017^*** 422 4 группа Депривация (CCl₄) + экстракт ламинарии 4,36±0,12 0,177±0,011 ^*2,60±0,17 ^*0,304±0,019 613 5 группа Депривация (CCl₄) + легалон 4,67±0,19 0,180±0,008 ^*2,60±0,21 ^***0,353±0,008 624 Примечание: различия статистически достоверны при ^* - P<0,05; ^** - P<0,01; ^*** - Р<0,001. Звездочки справа - сравнение с контрольной группой, звездочки слева - сравнение с 3-й группой (депривация).

Таблица 6 Влияние исследуемых препаратов на величину времени тиопенталового наркоза (мин; M±m). 1-я (контроль) 2-я (легалон) 3-я (экстракт из слоевищ ламинарии японской) 56,2±2,21 43,8±2,44^* 45,2±2,35^* Примечание. Достоверные различия с контролем: ^* - P<0,05;

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к гепатопротекторному средству. Средство, обладающее гепатопротекторным действием, представляет собой продукт экстракции этанолом слоевищ ламинарии японской - Laminaria japonica Aresch., семейства ламинариевых - Laminariaceae, содержащий до 30% полифенольных соединений. Вышеописанное средство обладает эффективным гепатопротекторным действием, способствует ускоренному восстановлению каскадов метаболических реакций, обеспечивая нормализацию биохимических показателей углеводного и липидного обмена, а также эндогенной системы антиоксидантной защиты. 6 табл.

Средство, обладающее гепатопротекторным действием, на основе экстракта растительного происхождения, отличающееся тем, что средство представляет собой содержащий до 30% полифенольных соединений продукт экстракции этанолом слоевищ ламинарии японской - Laminaria japonica Aresch., семейства ламинариевых - Laminariaceae.