Гепатопротекторное средство из морских водорослей Российский патент 2018 года по МПК A61K36/04 A61P1/16 

Изобретение относится к биологическим составам на основе экстрактов растительного происхождения и может быть использовано в качестве гепатопротектора, а также средства, повышающего сопротивляемость организма к воздействию химических веществ техногенного происхождения, отравлениям промышленными ядами и лекарствами.

Известно, что основным барьером, нейтрализующим токсические загрязнения в организме человека и животных, является печень. На сегодняшний день хронические диффузные заболевания печени являются чрезвычайно актуальной и сложной проблемой. Заболевания печени и билиарной системы составляют более 40% в группе нозологических форм, относящихся к патологии пищеварительной системы. При этом согласно данным Всемирной организации здравоохранения, за последние 20 лет во всем мире отмечается отчетливая тенденция к росту числа заболеваний гепатобилиарной системы, а число людей, страдающих заболеваниями печени, превышает два миллиарда человек.

Таким образом, лечение и профилактика заболеваний печени являются одной из наиболее актуальных проблем современной фармакологии. В настоящее время ведется активный поиск средств, повышающих устойчивость печени к патологическим воздействиям, усиливающих ее обезвреживающие функции путем повышения активности ферментной системы, а также способствующих восстановлению ее функций при различных повреждениях, в том числе при отравлении промышленными ядами.

В принятой в настоящее время классификации гепатопротекторов обычно выделяют следующие группы:

- растительные полифенолы;

- синтетические препараты;

- фосфолипидные препараты;

- органопрепараты.

К числу из наиболее хорошо изученных препаратов этой группы относятся фосфолипидные гепатопротекторы.

Известны препараты, обладающие гепатопротекторным действием, содержащие в качестве активного начала комплексы фосфолипидов. Это ряд лекарственных препаратов, близких по составу и действию, которые производятся в разных странах под различными названиями: «Эссенциале» и целый ряд его разновидностей (Эссенциале-Н, Эссенциале-Форте и т.д.), «Резалют», Эссливер, Фосфоглив, Гепагард и т.д.

В качестве средств, обладающих гепатопротекторным эффектом за счет содержащихся в их составе фосфолипидов, известен также экстракт из асцидии пурпурной (п. РФ №1522487 опубл. 15.07.1989 г), эплир (Саратиков А.С, Буркова В.Н., Венгеровский А.И. et al. Новые гепатопротекторы лохеин, эплир, липроксол // Сибирский онкологический журнал. - 2002. - №1. - С. 70-73.), экстракт из таллома зеленой водоросли Ulva fenestrate P. et R. (п. РФ №2528898 опубл. 20.09.2014 г. ) и другие.

Наиболее близким к заявляемому средству является средство, обладающее гепатопротекторным действием, представляющее собой липидную фракцию из спиртового экстракта таллома ульвы продырявленной (Ulva fenestrate P. et R, содержащей до 70% мембраноактивных липидных компонентов, включая не менее 20% эссенциальных фосфолипидов с содержанием полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейства n-3 не менее 55% (п. РФ №2528898 опубл. 20.09.2014 г. )

Техническая проблема изобретения - расширение арсенала гепатопротекторных средств.

Проблема решается средством на основе липидной фракции, из спиртового экстракта таллома анфельции тобучинской - Ahnfeltia tobuchensis (Каппо et Matsubara) Makijenko (отдел Rodophyta, порядок Ahnfeltiales, семейства Ahnfeltiaceae), содержащим до 69% мембраноактивных липидных компонентов, включающих не менее 30% гликолипидов (источник полиненасыщенных жирных кислот семейств n-9, n-6 и n-3 в составе сухого остатка экстрактивных веществ) и не менее 26% эссенциальных фосфолипидов с содержанием полиненасыщенных жирных кислот семейства n-9, n-6 и n-3 (олеиновая, арахидоновая и эйкозапентаеновая) не менее 66% от общей суммы жирных кислот.

Заявляемый экстракт, в отличие от прототипа, содержит отличающийся по составу комплекс эссенциальных фосфолипидов и полиненасыщенных жирных кислот, что обусловлено видовым отличием используемого для экстракции исходного сырья, относящегося к отделу красных водорослей Rodophyta (Хотимченко, С.В. Липиды морских водорослей-макрофитов и трав: Структура, распределение, анализ. 2003. Владивосток Дальнаука. 230 с), поэтому с очевидностью нельзя было предположить наличия у липидной фракции, содержащейся в Ahnfeltia tobuchensis, гепатопротекторных свойств. При этом содержание эссенциальных липидов в заявляемом экстракте по сравнению с прототипом выше на 30%.

Технический результат заключается в проявлении выраженного гепатопротекторного эффекта нового, ранее не применяемого для этих целей продукта - липидного экстракта анфельции тобучинской - Ahnfeltia tobuchensis (Каппо et Matsubara) Makijenko, отдел Rodophyta, порядок Ahnfeltiales, семейства Ahnfeltiaceae.

Сложный липидный комплекс, составляющий активное начало заявляемого средства - липидной фракции спиртового экстракта таллома анфельции тобучинской, характеризуется наличием в своем составе фракции фосфолипидов морского происхождения, включающих фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилинозит (ФИ) и фосфатидилглицерин (ФГ), обладающих репаративными свойствами. При этом необходимо отметить, что содержание ФХ, основного структурного фосфолипида внешнего монослоя мембран эритроцитов, внутреннего монослоя митохондриальной мембраны и плазматических мембран гепатоцитов, которые подвергаются основному воздействию в процессе перекисного окисления, превышает 60% от суммы фосфолипидов. В то же время, в отличие от прототипа, фосфолипиды которого содержат в основном линоленовую (18:3 n-3) и стеаридовую (18:4 n-3) жирные кислоты, фосфолипиды заявляемого препарата отличаются высоким содержание архидоновой (20:4 n-6) и эйкозапентаеновой (20:5 n-3) жирных кислот, которые в процессе осуществления структурной функции могут напрямую встраиваться в фосфолипиды плазматических мембран, не требуя предварительных процессов элонгации и десатурации (Эндакова Э.А., Новгородцева Т.Н., Светашев В.И. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях. - Владивосток: Дальнаука, 2002. 296 с), что увеличивает их биологическую ценность. Это обусловлено, тем, что чем больше двойных связей содержат жирные кислоты фосфолипидов, тем выше жидкостность мембран, ниже их вязкость и выше активность всех встроенных в мембрану рецепторов и транспортных и сигнальных систем (Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Холестеринозю - М..Медицина, 1983. - 352 с. ) Присутствующая в липидном экстракте фракция гликолипидов, также является важным источником полиненасыщенных жирных кислот семейства n-9, n-6 и n-3, необходимых для репарации фосфолипидов, поврежденных в процессе перекисного окисления и преобразования лизофосфолипидов в структурные компоненты мембран.

Необходимо отметить, что биологическая активность липидного комплекса анфельции тобучинской Ahnfeltia tobuchensis (Каппо et Matsubara) Makijenko ранее не изучалась.

В качестве сырья для получения средства используют таллом анфельции тобучинской. Анфельция тобучинская Ahnfeltia tobuchensis (Каппо et Matsubara) Makijenko относится к отделу красных водорослей. Распространена в России в заливе Петра Великого (Японское море), островах Сахалин, Кунашир, Шикотан. Является важным промысловым объектом и единственным источником агара в России с подтвержденными запасами в объеме 230000 тонн (Titlyanov, Е. А., Cherbadgy, I. I., Chapman, D. J. (1999). A review of the biology, productivity and economic potential of the agar-containing red alga, Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsub.) Makijenko, in the seas of the Far East of Russia.// Int. J. Algae. 1999. - Vol. 1. - N 4. - P. 28-67.). Используется как пищевой продукт повышенной'биологической ценности.

Исходное сырье - таллом Ahnfeltia tobuchensis имеет ряд преимуществ перед прототипом. В ходе переработки сырья нами было выяснено, что содержание воды в талломе Ahnfeltia tobuchensis произрастающей в акватории залива Петра Великого японского моря составляет 70%-75%, тогда как содержание таковой в талломе водорослей Ulva fenestrate достигает 90%. Таким образом, выход суховоздушного сырья при переработке 1 кг сырой водоросли анфельции, превышает таковой для ульвы в 2-3 раза. Кроме этого биомасса анфельции в местах обитания достигает 22 кг/м² (http://www.aquaristics.ru/nature/seaweed/ahnfeltia-tobuchiensis), тогда как ульвы не превышает 4 кг/м² (http://www.aquaristics.ru/nature/seaweed/ulva-prodyryavlennaya-ulva-fenestrata-p-et-r). Все это снижает затраты на подготовку сырья для экстракции и себестоимость конченого продукта

Использование таллома, по мнению заявителя, обусловлено тем, что он является частью растения, которая достигает наибольшего размера и характеризуется максимальной скоростью роста, что требует постоянного биосинтеза вторичных метаболитов, необходимых для построения вновь образующихся клеток. Это определяет наибольшее содержание липидов в талломе в период вегетации.

Получение липидной фракции из спиртового экстракта осуществляют общепринятым для выделения липидов из растительного и животного сырья способом (Bligh Е. G.,Dyer W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. - 1959. - Vol. 37. - N 8. -P. 911-917.).

Образцы водоросли Ahnfeltia tobuchensis (Kanno et Matsubara) Makijenko (отдел Rodophyta, порядок Ahnfeltiales, семейства Ahnfeltiaceae) собирали в августе - сентябре в заливе Петра Великого Японского моря (пролив Старка, о. Попов). Собранные водоросли тщательно очищали от загрязнений другими водорослями, мелкими безпозвоночными и твердыми частицами. Водоросли промывали сначала в морской воде, потом пресной, после этого отжимали и погружали в кипящую воду на 2 мин. для инактивации ферментов. Обработанные таким способом водоросли сушили до суховоздушного состояния. Высушенный таллом помещали в морозильную камеру при -80°С на 2 часа для повышения хрупкости, после этого измельчали с помощью лабораторной мельницы до размеров частиц 0,5-1 мм и экстрагировали 96% спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:2 в течение 8 часов при непрерывном перемешивании. Экстракт отделяли на воронке Бюхнера под вакуумом. Полученный жмых заливали свежей порцией экстрагента до образования зеркала, и оставляли на ночь. На следующее утро экстракт отделяли и объединяли с ранее полученным. Затем упаривали спирт на роторном испарителе при температуре менее 37°С до постоянного веса. Полученный сухой остаток растворяли в смеси хлороформ: этанол: вода (1:2:0,8) и тщательно взбалтывали. Далее добавляли один объем хлороформа, тщательно перемешивали и добавляли один объем воды. После перемешивания давали отстояться, отбирали верхнюю фазу, содержащую воду и этанол, и отбрасывали ее. Нижнюю фазу, содержащую липиды, промывали двукратным объемом 0,73% раствора хлористого натрия. После разделения фаз хлороформный слой, содержащий липиды, отделяли на делительной воронке и упаривали на роторном испарителе (Т<37°С) до отсутствия запаха хлороформа. Липидный экстракт представляет собой маслообразную массу зелено-коричневого цвета. Экстракт для фармакологического тестирования предварительно растворяли в соотношении 1:2 в вазелиновом масле категории «медицинское». В качестве разбавителя вазелиновое масло было выбрано, так как оно не впитывается пищеварительной системой, имеет неизменный химический баланс, не содержит токсичных для организма веществ, не скапливается в самом организме и, следовательно, не может оказать влияние на получаемые в эксперименте результаты.

Выход липидного экстракта составил 1,7% от массы сухой водоросли. При изучении состава полученной липидной фракции было определено, что 87% составляют общие липиды, из которых 69% относятся к мембраноактивным компонентам, необходимым для репарации нарушенной структуры мембран гепатоцитов. В качестве мембраноактивной фракции принимали сумму эссенциальных фосфолипидов, гликолипидов и нейтральных липидов, за вычетом триацилглицеринов, которые практически не входят в состав 'биологических мембран (Harwood J. L. Plant Acyl Lipids: Structure, Distribution, and Analysis // Lipids: Structure and Function Eds. P. K. Stumpf: Academic Press, 1980. - P. 1-55). Эссенциальные фосфолипиды составляли 26% мембраноактивной фракции липидного извлечения. Важным элементом выделенной липидной композиции является высокое содержание арахидоновой (20:4 n-6) и эйкозопентаеновой (20:5 n-3) кислот, которые являются важнейшими высоколабильными компонентами фосфолипидов мембран, которые, в первую очередь, подвергаются процессам перекисного окисления и требуют перманентной репарации. При этом в отличии от прототипа, содержащего в основном альфа линоленовую. (18:3 n-3) и стеаридовую (18:4 n-3) жирные кислоты, в заявляемом средстве арахидоновая (20:4 n-6) и эйкозапентаеновая кислоты (20:5 n-3) могут напрямую включаться в состав фосфолипидов мембран, не требуя предварительного процесса элонгации. Основные компоненты липидной фракции, выделенной из таллома Ahnfeltia tobuchensis (Каппо et Matsubara) Makienko представлены в таблице 1.

Низкая токсичность (ЛД₅₀ составляет более 5000 мг/кг) и безопасность при длительных введениях в желудок и парэнтерально позволили провести экспериментальные исследования, которые выявили выраженнное гепатопротекторное действие экстракта на модели интоксикации четыреххлористым углеродом (CCI₄). В качестве сравнения использовали препарат «Эссенциале»® («Рон-Пуленк Рорер», Германия), являющийся полиненасыщенным фосфатидилхолином соевых бобов и гепатопротекторное средство на основе липидной фракции из спиртового экстракта таллома ульвы продырявленной (Ulva fenestrate P. et R.), (п. РФ №2528898 опубл. 20.09.2014 г. ).. Эссенциале, как эталонный гепатопротектор, рекомендован официальными изданиями Фармакопейного комитета в качестве препарата сравнения при испытании новых средств, обладающих гепатопротекторными свойствами, содержащими фосфолипиды (Венгеровский А.И., Маркова И.В. и др. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. 2000. С. 228-231))

Эксперимент проводили на беспородных мышах-самцах (виварий ТИБОХ ДВО РАН) массой тела 25-30 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Экспериментальную модель острого токсического гепатита (интоксикация четыреххлористым углеродом - ЧХУ) на животных (мышах) и введение препаратов осуществляли согласно руководству для проведения доклинических испытаний (Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета. 1999. №1. С. 9-12). Для создания острого гепатита животным вводили подкожно (в дорсальную шейную складку) 2 мл/кг ЧХУ в 50% масляном растворе (оливковое масло) ежедневно в течение 4 дней. С 5-го дня эксперимента одна группа мышей получала в течение 7-и дней внтурижелудочно 80 мг/кг эссенциале (в вазелиновом масле) (Саратиков А.С., Ратькин А.В., Фролов В.Н, Чучалин B.C. Влияние гепатопротекторов фосфолипидной природы на, токсичность циклофосфана // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2004. №2. С. 43-47), другая группа - липидную фракцию из экстракта таллома анфельции (Ahnfeltia tobuchiensis), третья группа - липидную фракцию из экстракта таллома ульвы продырявленной (Ulva fenestrate P. et R.). Липидные фракции из водорослей вводили в дозе 80 мг/кг в вазелиновом масле. Животным контрольной группы вводили эквиобъемное количество вазелинового масла. Через сутки после последнего введения препаратов мышей декапитировали под эфирным наркозом.

Терапевтическую эффективность гепатопротекторов оценивали по их влиянию на выживаемость животных, весовые характеристики и биохимические показатели печени. В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и содержание малонового диальдегида, в печени определяли показатели липидного обмена.

Животные были разделены на следующие группы: 1-я - контрольная (интактные); 2-я - введение ЧХУ в течение 4 дней; 3-я - введение ЧХУ с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я - ведение липидной фракции экстракта таллома анфельции в период депривации в течение 7 дней; 5-я - введение эссенциале в период депривации в течение 7 дней; 6-я группа -введение липидной фракции экстракта таллома ульвы в период депривации в течение 7 дней.

В процессе эксперимента после 4-дневного введения ЧХУ масса животных снизилась на 42% (р<0,001), а удельная масса печени (г/100 г массы тела) увеличилась в 2,5 раза (р<0,001) (Таблица 2).

При внешнем осмотре у животных 2-й группы шерсть была тусклой, слипшейся в отдельные образования. Животные были слабо подвижны, плохо ели корм. В печени отмечалась сплошная зернистость жировых включений, то есть проявлялась выраженная жировая инфильтрация, характерная при интоксикации ЧХУ. Это подтверждается тем фактом, что количество общих липидов в печени превышало контрольный уровень в 4 раза (Таблица 3).

О развитии токсического гепатита в данной экспериментальной модели свидетельствует повышение активности в крови маркерного фермента печени АлАТ в 5 раз (р<0,001), обусловленное выходом фермента из гепатоцитов в кровь в результате повышения проницаемости мембран. Одним из показателей токсического гепатита является активация перекисного окисления липидов. Увеличение количества малонового диальдегида (МДА) в 1,8 раза (р<0,001) при введении ЧХУ характеризует высокую активность перекисного окисления жирных кислот мембранных фосфолипидов, что также обусловливает повышение проницаемости мембран гепатоцитов.

Количество общих липидов в печени увеличилось в 4 раза (р<0.001). Это связано с увеличением на 17% (р<0,001) количества триацилглицеринов (ТАГ) и на 12% (р<0,001) свободных жирных кислот (СЖК) за счет активации периферического липолиза в жировой ткани под действием химического стресса, который сопровождался увеличением потока жирных кислот и глицерина в печень с их последующим ресинтезом в ТАГ (Таблица 4).

Увеличение количества холестерина (ХС) на 13% (р<0,001) связано с активацией его биосинтеза из ацетил-КоА, образующегося при окислении жирных кислот. Известно, что при токсическом CCI₄-гепатите, вызанном четыреххлористым углеродом, угнетено митохондриальное окисление ацетил-КоА (Boll М, Weber L.W., Becker Е., Stamp Н.А. Pathogenesis of carbon tetrachloride-induced hepatocyte injury Bioactivation of CCI4 by cytochrome P450 and effects on lipid homeostasis // Z. Naturforsch. C. - 2001. - Vol. 56. - No. 1-2. - P. 111-121). В то же время отмечено снижение количества эфиров холестерина (ЭХС) на 13% (р<0,001) и эфиров жирных кислот (ЭЖК) на 9% (р<0,01), что обусловлено угнетением этерифицирующей функции печени.

В фосфолипидном спектре печени следует отметить среди холиносодержащих фракций достоверное снижение фосфатидилхолина (ФХ) на 6% (р<0,01) при одновременном увеличении лизофосфатидилхолина (ЛФХ) на 70% (р<0,001) и сфингомиелина (СМ) на 48% (р<0,001) (Таблица 5).

ФХ входит в состав наружного монослоя мембран и является преобладающим по количеству фосфолипидом. Известно, что при активации свободнорадикальных процессов, в первую очередь, подвергаются окислению полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) фосфолипидов мембран, что и вызывает уменьшение содержания их основных структурных кбмпоненетов, в частности, ФХ. Среди этаноламиновых фракций следует отметить снижение количества фосфатидилэтаноламина (ФЭ) на 13% (р<0,001), фосфатидилсерина (ФС) на 15% (р<0,001) и увеличение лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) на 68% (р<0,001). Факт роста лизофракций фосфолипидов (ЛФХ и ЛФЭ) обусловлен повышением фосфолипазы А₂ (Гусакова Е.А., Городецкая И.В. Стресс и протеолитические ферменты лизосом // Вестник Витебского государственного медицинского университетата. 2012. - Т. 11. - №4.- С. 15-25). Также подтверждением высокой активности фосфолипаз при интоксикации ЧХУ является увеличение количества фосфатидной кислоты (ФК) в 2 раза (р<0,001), связанное с активацией фосфолипазы D. Этот фосфолипид является основой в структуре фосфолипидов. Уменьшение количества метаболически активных фракций (ФИ и ФС) предполагает снижение активности мембраносвязанных транспортных АТФаз (Cornelius F., Habeck М., Kanai R. et al. General and specific lipid-protein interactions in Na,K-ATPase // Biochim. Biophys. Acta_TBiomembranes. 2015. - Vol.1848. - N 9. - P. 1729-1743). Накопление лизофракций фосфолипидов в мембране гепатоцитов способствует повышению проницаемости их мембран. Компенсаторным механизмом на повышение проницаемости является увеличение количества сфингомиелина (СМ) на 48% (р<0,001), являющегося совместно с холестерином ее стабилизатором. Снижение количества дифосфатидилглицерина (ДФГ) на 73% (р<0,001), являющегося маркером митохондрий, определяет нарушения в системе функционирования ферментов дыхательной цепи и угнетение процессов синтеза АТФ.

На основании выше изложенного следует отметить, что выполненная экспериментальная модель интоксикации ЧХУ действительно способствовала развитию токсического гепатита с нарущением метаболических реакций печени. Это проявлялось:

- в увеличении массы печени за счет жировой инфильтрации гепатоцитов;

- в нарушении проницаемости мембран и выходе маркеров цитолиза в кровь (АлАТ);

- в активации перекисного окисления липидов;

- в увеличении интенсивности липолитических процессов;

- нарушении этерифицирующей функции печени.

Через 7 дней после отмены ЧХУ (период депривации) в печени подопытных животных большинство биохимических параметров не нормализовалось, что свидетельствовало о продолжающемся токсическом стрессе и недостаточности собственных защитных сил организма противостоять развитию токсической патологии. Известно, что значительная часть ЧХУ, попадая в организм, депонируется в жировой ткани с периодом полувыведения более суток (Sanzgiri U.Y., Srivatsan V., Muralidhara S. et al. Uptake, distribution, and elimination of carbon tetrachloride in rat tissues following inhalation and ingestion exposures // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1997. - Vol.143. - No. 1. - P. - 120-129).

Масса животных в период депривации (Таблица 2) увеличилась на 21% (р<0,01) относительно 2-й группы (ЧХУ), тогда как относительно контроля сохранялась достоверно низкой (на 30%, р<0,001). Масса печени животных понизилась на 29% (р<0,05) относительно 2-й группы (ЧХУ), но в то же время еще достоверно превышала контрольный уровень на 85% (р<0,001). В печени при вскрытии имелись зернистые включения липидов. Животные при внешнем осмотре были слабо подвижны, плохо ели корм, шерсть была тусклой. Количество общих липидов (Таблица 3) в печени относительно 2-й группы снизилась на 14%, тогда как относительно контрольного уровня их величина превышала в 3 раза (р<0,001). О сохранении токсического гепатита в данной группе животных свидетельствует достоверно высокая относительно контроля (в 3 раза, р<0,001) активность маркерного фермента печени АлАТ. Также сохранялся высокий уровень МДА (на 52%, р<0,001), что определяет продолжающийся процесс перекисного окисления липидов. То есть, в период депривации токсический стресс продолжается из-за присутствия продуктов метаболизма ксенобиотиков, а также из-за истощения антиоксидантной защиты.

В период депривации количество ТАГ стало еще выше, чем во 2-й группе (увеличение на 9%, р<0,05) (Таблица 4). Также увеличилось количество СЖК (на 9%, р<0,01). В то же время величины ЭЖК и ЭХС остались на уровне таковых, зарегистрированных во 2-й группе (интоксикация ЧХУ). То есть, этерифицирующая функция печени не восстановилась и процесс развития жировой инфильтрации продолжился.

Анализ фракционного состава фосфолипидов печени в период отмены ЧХУ показал, что содержание ЛФХ превысило контрольный уровень в 2 раза, а содержание ЛФЭ увеличилось на 77% (р<0,001). Это свидетельствует о дальнейшем усилении перекисного окисления липидов и активности фосфолипаз. Содержание основных структурных компонентов мембран гепатоцитов - ФХ и ФЭ претерпело дальнейшее снижение по сравнению со 2-й группой, а по сравнению с контролем достоверно снизилось в среднем на 10-14% (р<0,001). Также еще ниже, чем во 2-й группе, было количество ФИ, ФС и ДФГ, необходимых для функционирования мембраносвязанных ферментов. Обращает на себя внимание тот факт, что количество СМ стало еще выше (на 57% по сравнению с контролем, р<0,001), обусловленное компенсаторной реакцией на нарушение проницаемости мембран.

Таким образом, данные по анализу исследованных биохимических параметров печени указывает на продолжающиеся и углубляющиеся нарушения метаболических реакций даже в отсутствии токсического агента (период депривации).

Исследования по применению известного гепатопротектора эссенциале, липидной фракции экстракта таллома анфельции и липидного экстракта таллома ульвы в период отмены ЧХУ показали, что полученный биологический эффект влияния был, в общем, идентичен, но в ряде случаев имел разную степень выраженности (таблицы 2-5, 4-я и 5-я и 6-я группы). При действии всех препаратов отмечалась выраженная тенденция к нормализации исследуемых показателей. Так, отмечалось восстановление весовых характеристик животных (увеличение веса относительно 3-й группы) на 47% (р<0,001) в 4-й группе (липидная фракция экстракта таллома анфельции), на 41% (р<0,001) - в 5-й группе (эссенциале) и на 44% (р<0,001) в 6-й группе (липидная фракция экстракта таллома ульвы). Следует отметить тот факт, что удельная масса печени животных, которым вводили липидную фракцию из анфельции и ульвы, соответствовала контрольным значениям, тогда как при введении эссенциале удельная масса печени мышей была достоверно выше таковой у контрольных животных на 16% (р<0,001). У животных шерсть стала гладкой, пушистой, они начали хорошо есть и активно двигаться. Количество общих липидов печени при введении липидной фракции экстракта анфельции и ульвы практически нормализовалось и не имело достоверных отличий от контрольных показателей, тогда как t при введении эссенциале эта величина была на 39% (р<0,001) выше, хотя по сравнению с группой депривации (3 группа) она была снижена на 60% (р<0,001). Введение липидной фракции из анфельции сопровождалось снижением количества общих липидов в печени по сравнению с группой депривации почти в 3 раза. Аналогичная динамика отмечалась в группе животных, получавших липидную фракцию из ульвы.

Так как активность маркерного фермента токсического гепатита АлАТ достоверно не отличалась от контрольных значений при введении экстракта из анфельции, то это свидетельствует о его мембраностабилизирующих свойствах. В то же время при введении эссенциале активность АлАТ была достоверно выше контрольного уровня на 43% (р<0,05), что свидетельствует о не полном восстановлении структуры мембран гепатоцитов. Введение липидной фракции из ульвы, также приводило к нормализации активности АлАТ. При сравнении показателей перекисного окисления липидов мембран (МДА) следует отметить, что в 4-й группе (липидная фракция экстракта анфельции) и 6 - й группе (липидная фракция экстракта ульвы) произошло восстановление этого показателя до контрольных величин. В то же время в группе животных с введением эссенциале величина МДА была на 35% (р<0,001) выше контроля. Однако относительно 3-й группы (депривация) значение МДА было, снижено при введении эссенциале, липидной фракции анфельции и ульвы, соответственно, на 12%, 29% и 28% (р<0,001).

При исследовании показателей нейтральных липидов печени мышей после введении препаратов следует отметить выраженное снижение количества ТАГ, СЖК и ХС при одновременном увеличении ЭЖК и ЭХС относительно 3-й группы (Таблица 4). По сравнению с контролем достоверные различия имеются в 5-й группе (эссенциале). Так, количество ТАГ оставалось повышенным на 5% (р<0,001), количество СЖК - на 6% (р<0,05), ХС - на 5% (р<0,01). При этом количество ЭЖК и ЭХС было равнозначно снижено на 6% (р<0,05). Таким образом, эссенциале не полностью снял жировую инфильтрацию и не окончательно восстановил этерифицирующую функцию печени. В 6-й группе (липидная фракция ульвы) отмечали превышение (на 4%, р<0.01) количества ТАГ по сравнению с контролем, что указывало на сохраняющиеся признаки жировой инфильтрации печени. Липидная фракция экстракта анфельции полностью нормализовала исследованные биохимические параметры нейтральных липидов и показала более высокую эффективность в восстановлении функции печени.

При сравнении показателей фосфолипидных фракций в ткани печени 4-й, 5-й и 6-й групп с таковыми в контроле следует отметить, что введение липидной фракции экстракта анфельции и экстракта ульвы полностью нормализовало исследуемые параметры (Таблица 5), за исключением того, что в группе животных получавших липидную фракцию экстракта ульвы отмечали повышенное на 26% (р<0,05) содержание ЛФХ, что указывало на сохраняющуюся высокую активность фософлипаз, как следствие сохранения эффекта токсического стресса. При введении эссенциале отмечались достоверные отличия показателей фосфолипидного обмена от контрольных величин: содержание ЛФХ превышало на 37% (р<0,05), ЛФЭ - на 18% (р<0,001), а СМ - на 14% (р<0,05) при одновременном снижении ФЭ на 8% (р<0,001). Особенно значимые отличия наблюдались в содержании метаболически активных фракций: количество ФК было выше контрольного уровня на 64% (р<0,001), а ДФГ - ниже на 31% (р<0,001).

При сравнении исследованных показателей в 4-й группе с таковыми в 5-й группе (липидная фракция экстракта анфельции с эссенциале) отмечались выраженные достоверные различия. Так, при введении эссенциале масса животных была на 10% (р<0,05) меньше, а масса печени на 11% (р<0,001) больше, чем таковые показатели при введении липидной фракции экстракта анфельции. При этом, количество общих липидов печени при введении эссенциале было выше на 21% (р<0,05), активность АлАТ - на 35% (р<0,05), а количество МДА - на 25% (р<0,001). Среди нейтральных липидов следует отметить более высокий уровень ТАГ (на 4%, р<0,01) и холестерина (на 6%, р<0,01), а также низкий - эфиров холестерина (на 5%, р<0,01). Различия отмечались и в содержании фракций фосфолипидов: количество ЛФХ было выше на 31% (р<0,05), ЛФЭ - на 16% (р<0,05), а количество ФК - на 48% (р<0,001). Одновременно отмечалось более низкое содержание ФЭ (на 8%, р<0,001) и ДФГ (на 21%, р<0,01).

Преимущества введения липидной фракции экстракта таллома анфельции в период депривации по сравнению с эссенциале были следующими:

- масса животных и печени, активность АлАТ, величина МДА полностью восстановились;

- величина ХС ниже (на 6%, р<0,01), ЭХС выше (на 5%, р<0,01);

- количество лизофракций фосфолипидов ниже на 16-31% (р<0,001);

- количество метаболически активных фракций (ДФГ) выше на 21% (р<0,01), ФК - выше на 48% (р<0,001).

Введение липидной фракции экстракта анфельции, эссенциале и ульвы способствовало коррекции нарушений, вызванных интоксикацией ЧХУ, однако восстановление измененных параметров под действием липидной фракции экстракта анфельции оказалось более эффективным.

По-видимому, основной причиной наблюдаемого различия является то, что биологической активности полиненасыщенного фосфатидилхолина соевых бобов, входящего в состав эссенциале, противопоставлен многокомпонентный комплекс липидной фракции экстракта таллома анфельции. Большая эффективность экстракта, по мнению заявителя, обусловлена наличием в его составе всех известных классов фосфолипидов морского происхождения, обладающих репаративными свойствами. При этом жирно-кислотный состав липидной фракции анфельции отличается высокой степенью ненасыщенности и содержит в своем составе ПНЖК семейства n-3 (эйкозапентаеновую; 22:5) и n-6 (арахидоновую; 20:4), необходимые для преобразования лизофосфолипидов в основные структурные компоненты мембран - ФХ и ФЭ, которые в отличие от содержащихся в прототипе ПНЖК кислот альфа линоленовую (18:3 n-3) и стеаридовую (18:4 n-3) способны напрямую включаться в структурные процессы восстановления основных фосфолипидов плазматических мембран гепатоцитов, так как в отличии от ПНЖК 18:3 n-3 и 18:4 n-3 не требуют предварительного процесса элонгации и десатурации.

При сравнительном анализе исследуемых величин в крови и печени мышей между группой с введением липидной фракции из экстракта анфельции тобучинской (4 группа) и группой с введением прототипа - липидной фракции экстракта из ульвы (6-я группа), было показано, что сравниваемые препараты одинаково эффективны при восстановлении массы животных, удельной массы печени, содержания общих липидов, активности АлАТ и уровня МДА (Таблица 2, 3). Однако, при сравнении величин содержания фракций нейтральных липидов между 4-й и 6-й группами (Таблица 4) следует отметить достоверно более высокое количество ТАГ (на 4%, р<0,01) в 6-й группе (введение липидной фракции экстракта ульвы), а в фосфолипидном спектре - достоверно повышенное содержание ЛФХ (на 26%, р<0,05) (Таблица 5). То есть липидная фракция из экстракта анфельции была более эффективной, чем липидная фракция из экстракта ульвы в снятии жировой инфильтрации печени и нормализации активности фосфолипаз.

Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует:

1. Липидная фракция экстракта таллома анфельции тобучинской обладает выраженным гепатозащитным действием при поражении печени четыреххлористым углеродом.

2. Механизм терапевтического действия липидного экстракта таллома анфельции тобучинской обусловлен восстановлением нарушенных токсикантом метаболических реакций печени:

- стабилизирует мембраны гепатоцитов за счет встраивания фосфолипидов в пределах липидного бислоя плазматической мембраны;

- нормализует структуру мембран гепатоцитов и тормозит выход в кровь печеночных ферментов (АлАТ);

- снимает жировую инфильтрацию печени;

- активирует этерифицирующую функцию печени, что способствует синтезу фосфолипидов из триацилглицеринов.

3. Заявляемое средство в условиях интоксикации ЧХУ превосходит по своей терапевтической эффективности эталонный гепатопротектор эссенциале по способности восстанавливать массу животных, удельную массу печени, активность АлАТ, показатели липидного обмена и процессов перекисного окисления, а также превосходит прототип - липидную фракцию экстракта ульвы, по способности снимать жировую инфильтрацию печени и снижать содержание лизофракций основных структурных фосфолипидов, более эффективно устраняя последствия токсического стресса.

Таким образом, заявляемое средство позволяет расширить ассортимент гепатопротекторных средств, при этом находят применение новые источники фосфолипидных гепатопротекторов, не применяющиеся ранее для этих целей, а именно морская красная водоросль Ahnfeltia tobuchiensis (Кащто et Matsub.) Makijenko.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к гепатопротекторному средству. Гепатопротекторное средство на основе липидной фракции спиртового экстракта таллома анфельции тобучинской - Ahnfeltia tobuchensis (Kanno et Matsubara) Makijenko, отдел Rodophyta, порядок Ahnfeltiales, семейства Ahnfeltiaceae, содержащей до 69% мембраноактивных липидных компонентов, включающих не менее 30% гликолипидов и не менее 26% эссенциальных фосфолипидов с содержанием полиненасыщенных жирных кислот семейства n-9, n-6 и n-3 не менее 66% от общей суммы жирных кислот. Вышеописанное средство обладает эффективным гепатопротекторным действием, способствует ускоренному восстановлению каскадов метаболических реакций, обеспечивая нормализацию биохимических показателей углеводного и липидного обмена. 5 табл.

Гепатопротекторное средство на основе липидной фракции спиртового экстракта таллома анфельции тобучинской - Ahnfeltia tobuchensis (Kanno et Matsubara) Makijenko, отдел Rodophyta, порядок Ahnfeltiales, семейства Ahnfeltiaceae, содержащей до 69% мембраноактивных липидных компонентов, включающих не менее 30% гликолипидов и не менее 26% эссенциальных фосфолипидов с содержанием полиненасыщенных жирных кислот семейства n-9, n-6 и n-3 не менее 66% от общей суммы жирных кислот.