СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к биологическим составам на основе экстрактов растительного происхождения и может быть использовано в качестве гепатопротектора, а также средства, повышающего сопротивляемость организма к воздействию химических веществ техногенного происхождения, стрессовым ситуациям, алкогольным отравлениям.

В связи с прогрессирующим ухудшением экологической обстановки человек все более активно подвергается воздействию различных веществ техногенного происхождения. В нашей стране гигиеническое регламентирование охватывает в настоящее время около 2 тыс. вредных химических веществ, для которых установлено более 3 тыс. гигиенических нормативов предельно допустимого содержания в различных объектах окружающей среды. Влияние стрессовых ситуаций (гипо- и гипертермия, высокая физическая нагрузка, дыхание гипоксическими смесями, нахождение в зоне техногенных катастроф и др.), несбалансированное питание, алкоголизм настоятельно требуют поиска нетрадиционных подходов к фармопрактике возникающих нарушений в организме. Известно, что основным барьером, нейтрализующим токсические загрязнения в организме человека и животных, является печень. Заболевания печени и билиарной системы составляют 40% в группе нозологических форм, относящихся к патологии пищеварительной системы.

В настоящее время ведется активный поиск средств, повышающих устойчивость печени к патологическим воздействиям, усиливающих ее обезвреживающие функции путем повышения активности ферментной системы, а также способствующих восстановлению ее функций при различных повреждениях, в том числе при алкогольной интоксикации.

В качестве средства, повышающего общую устойчивость организма известен экстракт гребней винограда (а.с. N 1473139, опубл. 10.09.1998).

Известно средство, обладающее антиалкогольным действием, полученное путем экстракции спиртом предварительно высушенных и измельченных гребней винограда (а.с. N 1072309, опубл. 10.09.1998)
Известны также препараты, обладающие гепатопротекторным действием, в которых активным агентом является группа флавоноидных соединений - Silimarin, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Sylybum marianum L). На основе этих соединений разработан ряд лекарственных препаратов "силимарин", "силибор", "силибинин", "карсил" и др. Все эти препараты зарубежного производства, поэтому очевидна актуальность и необходимость поиска и изучения новых источников сырья среди природных, в частности растительных, дикорастущих видов непищевого назначения.

Наиболее близким к заявляемому является препарат "Легалон", содержащий в своем составе в качестве активного агента группу флавоноидов из экстракта плодов расторопши пятнистой. Легалон обладает гепатопротекторным и антитоксическим действием. Механизм действия связан с ингибированием перекисного окисления липидов, вследствие чего предотвращается разрушение клеточных мембран. В поврежденных гепатоцитах препарат стимулирует синтез белков и фосфолипидов, в результате чего происходит стабилизация клеточных мембран, предотвращается потеря компонентов клетки, например трансаминаз. Препарат препятствует проникновению в клетку некоторых гепатотоксических веществ. (Лекарственные препараты зарубежных фирм в России, М.- Астрафармсервис, 1993, с.350).

Технической задачей изобретения является расширение ассортимента гепатопротекторных средств за счет использования новых источников полифенольных соединений.

Поставленная задача решается средством, обладающим гепатопротекторным действием, содержащим в качестве активного начала спиртовой экстракт гребней калины (Viburnum) в эффективном количестве.

Экстракт получают способом, обычным для приготовления экстрактов из растительного сырья. Для этого гребни калины (Viburnum) высушивают при температуре, не превышающей 50^oC и измельчают для ускорения и улучшения процесса экстракции. Измельченное сырье экстрагируют 40% этанолом, как правило, при соотношении сырья к экстрагенту 1:1.

Состав полученного экстракта по данным хроматографии содержит до 50% полифенольных соединений.

Готовый экстракт обладает низкой токсичностью (ЛД₅₀ составляет 36 мл/кг) и не оказывает вредного действия при длительных введениях в желудок и парэнтерально, что позволяет провести экспериментальные исследования, показавшие выраженное гепатопротекторное действие экстракта на модели алкогольной интоксикации.

Эксперимент проводят по схеме, приведенной в работе Gajdos А. с соавторами ("Effet curatif de la(+)-catechine sur les troubles biochimigues du foie de rat intoxique par l'ethanol", C.R. Seances Soc. Biol.Fil, v.l66. No. 2, p. 277-279), а в качестве препарата сравнения используют Легалон.

Эксперимент проводили на крысах-самцах Вистар массой 130-180 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Сначала в течение 7 дней крысам вводят этанол в дозе 7,5 мл на 1 кг массы тела животного внутрибрюшинно 2 раза в сутки. Затем после последнего дня введения этанола вводят экстракт калины в дозе 0,2 мл на 100 г массы в течение 7 дней, при этом для исключения влияния этанола исходный экстракт калины предварительно выветривают на воздухе или упаривают на водяной бане при температуре не выше 55^oC до 2/3 объема, а затем доводят дистиллированной водой до первоначального объема. Обработанный таким способом экстракт калины вводят животным перорально. Животные были разделены на 5 групп: 1-я - контрольная (интактная); 2-я - введение 33% этанола; 3-я - введение 33% этанола в течение 7 дней с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я - введение Легалона после 7-дневной алкоголизации; 5-я - введение экстракта из гребней калины после 7-дневной алкоголизации.

В таблице 1 приведены биохимические параметры животных, подвергшихся воздействию алкоголя и последующего введения Легалона и экстракта калины. Как видно, алкогольная интоксикация, вызванная введением 33% этилового спирта, сопровождается достоверным снижением активности мембраносвязанной лизосомальной бета-глюкозидазы на 15% в результате мембраноповреждающего эффекта этанола. Увеличение активности цитозольной бета-галактозидазы на 13% (P<0,05) обусловлено увеличением проницаемости мембран лизосом и выходом матричного фермента.

Нарушается соотношение компонентов антиоксидантной защиты. Увеличение активности супероксиддисмутазы (СОД) в 3 раза (P<0,001) связано с образованием из этанола гидроксиэтиловых свободных радикалов, которые активируют микросомальные ферменты монооксигеназной системы. Снижение активности глутатионредуктазы (ГР) на 61% (P<0,05) и количества восстановленного глутатиона на 14% (P<0,05) свидетельствует о снижении способности печени эффективно осуществлять детоксикацию. В результате активируется перекисное окисление липидов, что подтверждается увеличением количества малонового диальдегида (МДА) на 35% (92,94 + 1,4 мкмоль/г против 68,91 + 1,7 мкмоль/г в контроле; P<0,05).

Снижение содержания НАД+ на 49% (0,26 + 0,03 мкмоль/г против 0,51 + 0,04 мкмоль/г в контроле; P<0,05), являющегося коферментом алкоголь-дегидрогеназы, свидетельствует о высокой интенсивности окисления этанола, накоплении восстановленной формы НАДН и соответственно нарушении функционирования аэробного гликолиза. Это подтверждается увеличением количества лактата на 42% (P<0,05), являющегося конечным продуктом анаэробного гликолиза.

В таблице 2 приведены данные о влиянии Легалона и экстракта гребней калины на состав нейтральных липидов печени крыс при поражении этиловым спиртом (в % от общих липидов). Видно, что в содержании фракций нейтральных липидов печени отмечается увеличение количества холестерина (ХС) на 13% (P<0,001), триацилглицерина (ТАГ) на 4% (P<0,05), свободных жирных кислот (СЖК) на 18% (P<0,001) и снижение эфиров холестерина (ЭХС) на 14% (P<0,05). Эти изменения обусловлены усилением периферического липолиза (стрессовая реакция на этанол), в результате которого происходит поступление жирных кислот и глицерина в печень из жировых депо с последующей этерификацией в ТАГ. Увеличение количества холестерина (ХС) связано с усилением его синтеза из ацетил-КоА, образовавшегося при окислении этанола. Уменьшение количества эфиров холестерина обусловлено нарушением этерифицирующей функции печени. Нарушение этой функции проявляется и в снижении количества общих фосфолипидов на 24% (P<0,05), как следует из таблицы.3.

В таблице 4 приведены данные по влиянию Легалона и экстракта из гребней калины на фосфолипидный состав печени крыс при поражении этиловым спиртом. Видно, что среди фосфолипидных фракций уменьшилось количество фосфатидилхолина (ФХ) на 11% (P<0,05) и фосфатидилсерина (ФС) на 19% (P<0,05). Заметно повысилось количество лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) в среднем на 30-40%(P<0,05), что связано с увеличением активности фосфолипазы А2. Повысился уровень фосфатидилинозита (ФИ) на 28% (P<0,05).

Полученные изменения в содержании фракционного состава фосфолипидов свидетельствуют о повышении проницаемости мембран гепатоцитов.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при воздействии этилового спирта отмечается выраженное гепатотропное его действие, которое проявляется в виде существенных сдвигов в липидном и углеводном обмене печени, а также в разбалансировке ферментных систем.

Через 7 дней после отмены этанола (табл. 1, 3 группа) большинство изученных биохимических параметров к норме не возвращается. Остается пониженной активность бета-глюкозидазы (на 27%; P<0,05). Сохраняется рассогласование активности ферментов системы антиоксидантной защиты (увеличение СОД в 2,9 раза, снижение активности ГР на 55%) и пониженное количество восстановленного глутатиона (25,2 + 0,16 мкг/мл против 28,2 + 0,15 мкг/мл в контроле; P<0,05). Содержание НАД+ через 7 дней после окончания алкогольной интоксикации остается на уровне такового показателя во 2-й группе (соответственно 0,28 + 0,04 мкмоль/г и 0,26 + 0,03 мкмоль/г), что свидетельствует о сохранении тканевой гипоксии. В связи с этим также зафиксирован достоверно повышенный уровень лактата (8,03 + 0,36 мкмоль/г). Содержание триацилглицерина и свободных жирных кислот сохраняется повышенным, то есть жировая инфильтрация не устраняется (табл.2, 3 группа). Количество общих фосфолипидов (табл.3, 3 группа) не восстанавливается до контрольного уровня (меньше на 13%; P<0,05). Содержание эфиров холестерина становится еще меньше (табл. 3, 3 группа) - на 24% по сравнению с контролем (P<0,001). Следовательно, этерифицирующая функция печени при отмене этанола в течение 7 дней не восстанавливается.

Сохраняется высокий уровень лизофосфатидилхолина (увеличение на 25% по сравнению с контролем; P<0,05) (табл.4; 3 группа), что свидетельствует о повышенной активности фосфолипаз. Следует отметить снижение количества дифосфатидилглицерина (ДФГ) на 19% (P<0,05) по сравнению с контролем, чего не отмечалось после 7- дневной интоксикации этанолом,
Таким образом, отмена этанола в течение 7 дней сопровождается неполным восстановлением функционального состояния печени крыс. По нашему мнению, период отмены токсического агента является стрессом для организма, так как возросли величины изменений некоторых изученных биохимических параметров (более выросло количество свободных жирных кислот и снизилось количество эфиров холестерина, дифосфатидилглицерина, фосфатидилсерина).

Исследования по применению гепатопротектора Легалона и экстракта из гребней калины в период отмены этанола показывают, что полученный биологический эффект влияния был в общем идентичен, но в ряде случаев имеет разную степень выраженности (таблицы 1-5; 4-я и 5-я группы). Так, при действии обоих препаратов нормализуется активность лизосомальных гликозидаз (бета-глюкозидазы и бета- галактозидазы), уровень НАД+, содержание триацилглицерина и свободных жирных кислот. То есть оба препарата обладают выраженным гепатопротекторным эффектом, проявляющимся в снятии жирового перерождения печени.

В то же время при действии Легалона остаются повышенными количество лактата и активность супероксиддисмутазы, пониженными активность глутатионредуктазы и уровень восстановленного глутатиона. При действии экстракта из гребней калины эти величины соответствуют контрольному уровню.

Следует отметить факт более высокого содержания НАД+ в печени крыс, получавших экстракт из гребней калины (0,6 + 0,02 мкмоль/г). При введении Легалона эта величина составляет 0,52 + 0,03 мкмоль/г, что на 18% меньше.

Также следует обратить внимание на уровень эфиров холестерина в печени крыс 4 и 5 групп. Так, при введении Легалона уровень эфиров холестерина соответствует контрольной величине (соответственно 19,0 + 1,49% и 19,42 + 0,61%). При введении экстракта из гребней калины содержание эфиров холестерина составляет 24,27 + 0,92%, что на 25% (P<0,001) выше контрольного уровня. Вероятно данный феномен обусловлен поступлением в гепатоцит возросшего потока холестерина в этерифицированной форме в составе липопротеидов высокой плотности. То есть введение экстракта из гребней калины сопровождается гипохолестеринемическим эффектом.

Оба препарата обладают одинаковой восстанавливающей способностью биохимических параметров фосфолипидного обмена, что говорит о нормализации этерифицирующей функции печени.

Для проверки воздействия химической природы был избран, помимо этилового спирта, тиопенталовый наркоз. Тиопентал вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 60 мг на кг массы тела через 2 часа после внутрижелудочного введения Легалона (100 мг на кг массы тела) или экстракта из гребней калины (0,4 мл на 100 г массы). В контрольной группе погибло 2 крысы. Во 2-й и 3-й группах гибели не было (таблица 5). Видно, что предварительное введение препаратов сопровождается снижением времени бокового положения, что указывает на активацию монооксигеназной системы, осуществляющей биотрансформацию ксенобиотиков. Однако действие экстракта из гребней калины было более эффективно, чем таковое при введении Легалона.

Таким образом, исходя из полученных экспериментальных данных следует:
1. Экстракт из гребней калины обладает выраженным гепатозащитным действием при алкогольном поражении печени и введении тиопентала.

2. Механизм терапевтического действия экстракта из гребней калины обусловлен благоприятным влиянием на нарушения токсикантом метаболизма и функцию печени:
* Ингибирует свободнорадикальные реакции и уменьшает образование токсических продуктов липопероксидации;
* Стабилизирует мембраны лизосом и тормозит выход в цитоплазму гепатоцитов мембранотропных гидролаз;
* Нормализует структуру гепатоцитов за счет регуляции синтеза холестерина, его этерификации и включения в структуру мембран;
* Нормализует этерифицирующую функцию печени, характеризующуюся синтезом фосфолипидов из триацилглицерина;
* Восстанавливает пул окисленного НАД+, снижая ацидоз и повышая активность процессов энергообеспечения за счет активации эробного гликолиза.

3. Экстракт из гребней калины является эффективным стимулятором антитоксической функции печени на фоне ее угнетения этиловым спиртом и тиопенталом.

4. Исследованный экстракт из гребней калины в условиях интоксикации этиловым спиртом превосходит эталонный гепатопротектор Легалон по способности увеличивать образование окисленной формы НАД+ и восстановленного глутатиона, эфиров холестерина; в большей степени снижать время тиопенталового наркоза. По остальным показателям экстракт из гребней калины показывает биологическую активность, равную таковой Легалона.

Изобретение относится к медицине, а именно для создания средств растительного происхождения в качестве гепатопротекторного средства. Сущность изобретения состоят в том, что в качестве гепатопротектора предложен спиртовой экстракт гребней калины. Предложенное средство ингибирует свободнорадикальные реакции и уменьшает образование токсических продуктов липопероксидации, стабилизирует мембраны лизосом и тормозит выход в цитоплазму гепацитов мембранотропных гидролаз, нормализует этерифицирущую функцию печени, характеризующуюся синтезом фосфолипидов из триацилглицерина и т.д. 5 табл.

Средство, обладающее гепатопротекторным действием, содержащее в качестве активного начала экстракт растительного происхождения, отличающееся тем, что в качестве активного начала оно содержит спиртовой экстракт калины.