СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕТУЛОНА Российский патент 2014 года по МПК C12P7/26 

Область техники.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности получению биологически активных веществ с помощью микроорганизмов. Конкретно - способу получения одного из перспективных интермедиатов в синтезе фармакологически активных соединений - бетулона, представляющего собой продукт направленного окисления бетулина.

Уровень техники.

Бетулин, доступный тритерпеноид растительного происхождения, используется для получения фармакологически активных соединений. Известны немногочисленные примеры трансформации бетулина с помощью микроорганизмов. Так, Chaetomium longirostre IFO 9873 трансформирует бетулин в 3,4-секопроизводные, перспективные соединения в качестве противовирусных и противоопухолевых агентов [Akihisa T., Takamine Y., Yoshizumi K., Tokuda H., Kimura Y., Ukiya M., Nakahara T., Yokochi T., Ichiishi E., Nishino H.J. // Nat. Prod. 2002. V.65. P.278-282]. Armillaria luteo-virens Sacc QH, Aspergillus foetidus Zu-G1, A. oryzae Sacc QH катализируют образование бетулиновой кислоты, обладающей противораковым, противовирусным, противовоспалительным, антисептическим, антимикробным, противомалярийным и др. действием [Chen Q-H., Liu J., Zhang H-F., He G-Q., Fu M-L. // Enzyme Microb. Tech. 2009. V.45. P.175-80; Liu J., Fu M.L., Chen Q.H. // J. Appl. Microb. 2010. V.110. P.1-8]. Недавно появились сведения о региоселективном окислении бетулина с использованием Rhodotorula mucilaginosa [Мао D-B., Feng Y-Q., Bai Y-H., Xu C-P. // J. Taiwan. Inst. Chem. E. 2012. V.43. P.825-829] и Dothideomycete sp. HQ 316564 [Liu H., Lei X-L., Li N., Zong M-H. // J. Mol. Catal. B-Enzym. 2013. V.88, April. P.32-35] до бетулона, который является перспективным интермедиатом в синтезе биологически активных соединений [Koohang A., Majewski N.D., Szotek E.L., Mar A.A., Eiznhamer D.A., Flavin M.T., Xu Z-Q. // Bioorg. Medic. Chem. Lett. 2009. V.19. P.2168-2171; Mar A.A., Koohang A., Majewski N.D., Szotek E.L., Eiznhamer D.A., Flavin M.T., Xu Z.Q. // Chinese Chem. Lett. 2009. V.20. P.1141-1144; Mar A.A., Szotek E.L., Koohang A., Flavin W.P., Eiznhamer D.A., Flavin M.T., Xu Z.Q. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010. V.20. P.5389-5393; Orlov A.V., Khazipova G.R., Komissarova N.G., Shitikova O.V., Spirikhin L.V., Yunusov M.S. // Chem. Nat. Compd. 2011. V.46. P.906-909; см. US Patent WO 2007112043 A2, 2007]. Описан трехстадийный химический синтез бетулона, включающий стадии введения и снятия защиты первичной C-28 гидроксильной группы бетулина. Использование микроорганизмов позволяет осуществлять одностадийное окисление вторичной гидроксильной группы бетулина в оксогруппу при сохранении нативной C-28 гидроксильной группы. В качестве основных недостатков известных процессов биотрансформации бетулина в бетулон клетками дрожжей Rhodotorula mucilaginosa и грибов Dothideomycete sp. HQ следует отметить низкую нагрузку бетулина (0,057 или 0,1 г/л), при этом выход бетулона не превышает 52,65 и 43,4% соответственно. Продолжительность биотрансформации с участием Dothideomycete sp. HQ 316564 составляет 144 ч, а при использовании представителей дрожжей условно патогенного вида R. mucilaginosa наряду с бетулоном регистрируется накопление побочного продукта - метилового эфира 11,14-октадекадиеновой кислоты [Мао D.-B., Feng Y.-Q., Bai Y.-H., Xu C.-Р. // J. Taiwan. Inst. Chem. E. 2012. V.43. P.825-829; Liu #., Lei X.-L., Li N., Zong M.-H. // J. Mol. Catal. B-Enzym. 2013. V.88, April. P.32-35].

Одной из активно разрабатываемых групп микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus. Типично бактериальный, а не мицелиальный характер роста, лабильность метаболической системы, синтез биосурфактантов, способность расти на минимальных средах и высокая трансформирующая активность [Larkin M.J., Kulakov L.A., Allen C.R. // Adv. Appl. Microbiol. 2006. V.59. P.1-29; Martinkova L., Uhnakova B., Patek M., Nesvera J., Kren V. // Environ. Int. 2009. V.35. P.162-177; Kuyukina M.S., Ivshina I.B. // In: Alvarez HM (editor) Biology of Rhodococcus. Microbiology Monography. vol.16. Berlin: Springer; 2010. p.291-313] обусловливают эффективность использования родококков в качестве биокатализаторов процесса окислительной биотрансформации бетулина.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в повышении эффективности процесса биокаталитического синтеза бетулона.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении сравнительно высокого выхода бетулона (до 60%) в условиях значительного увеличения нагрузки субстрата, сокращения продолжительности процесса биотрансформации и упрощения стадии выделения бетулона за счет использования простой трансформационной среды.

Описание изобретения.

Сущность изобретения заключается в том, что бетулон получают путем микробиологической трансформации бетулина нерастущими клетками штамма Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66, поддерживаемого в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур (WFCC) #768, http://www.iegm.ru/iegmcol) и депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1898. Процесс осуществляют в фосфатно-щелочном буфере с pH 8,0 при оптической плотности клеточной суспензии 2,0-2,6 (сухой вес биомассы 7-10 г/л) и исходной концентрации бетулина 0,5-3,0 г/л. Продолжительность процесса обычно составляет от 24 до 48 часов.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Бактерии выращивают в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл, в которые вносят 100 мл среды LB ("Sigma", USA). Культивирование проводят на орбитальной качалке Centromat IS ("Sartorius", Германия) при 160 об/мин и 28°C в течение 48 часов. Родококки в период перехода в стационарную фазу осаждают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин и трижды промывают фосфатно-щелочным буферным раствором (pH 7). Значение оптической плотности клеточной суспензии определяют с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 ("Perkin-Elmer", USA) при длине волны 600 нм. Отмытые клетки ресуспендируют в 100 мл фосфатно-щелочного буфера (pH 8) и доводят OD₆₀₀ клеточной суспензии до требуемого значения с последующим пересчетом на сухой вес (г/л) биомассы. Бетулин вносят в виде раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации от 0,5 до 3,0 г/л.

Для выделения продуктов среду биотрансформации трижды экстрагируют эквивалентным объемом этилацетата. Полученный этилацетатный экстракт обезвоживают над Na₂SO₄. Растворитель удаляют с помощью роторного испарителя ("Heidolph", Germany). Качественный состав продуктов биотрансформации бетулина контролируют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем ("Merck", Germany) при обработке пластин 5% H₂SO₄ с последующим прогреванием 2-3 мин при 95-100°C. Анализ продуктов биотрансформации бетулина осуществляют методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) на хроматографе Agilent 6890N/5975B ("Agilent Technologies", USA), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS (30 м × 0,25 мм) и работающем в режиме ионизации электронным ударом (70 эВ). В качестве газа-носителя используется гелий (1 мл/мин). Вводится 0,2 мкл этилацетатного экстракта с делением потока (от 1:1 до 11:1). Температура колонки программируется от 150 до 300°C с повышением температуры со скоростью 50°C/мин. Масс-спектры регистрируются в диапазоне от 40 до 460 m/z. Отнесение масс-спектров подтверждают с помощью библиотеки NIST08.

Продукты биотрансформации разделяют с помощью колоночной хроматографии на силикагеле 60-200 µm ("Merck", Germany), соотношение вещества и сорбента ≈1:50, элюент-гексан : этилацетат (9:1). ¹Н ЯМР спектр раствора бетулона в CDCl₃ записывают на спектрометре Varian Mercury Plus 300 ("Varian Inc.", USA) (300 МГц, внутренний стандарт - ГМДС). Пороговое значение температуры в точке плавления определяют на приборе OptiMelt МРА100 ("Stanford Research Systems Inc.", USA).

Бетулон (луп-20(29)-ен-28-ол-3-он). Белый порошок; Т_пл 120,5°C (н-гексан-этилацетат, 5:1) (лит.: T_пл 94-96°C (н-гексан) [Hata K., Hori K., Takahashi S. // J. Nat. Prod. 2002. V.65. P.645-648], 175-176°C [Tinto W.F., Blair L.C., Alli A., Reynolds W.F., McLean S. // J. Nat. Prod. 1992. V.55. P.395-398]). ¹H ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): 0,92 (3H, c); 0,98 (3H, c), 1,01 (3H, c), 1,05 (3H, c), 1,06 (3H, c), 1,67 (3H, c), 2,37-2,48 (3H, м, H-19+2H-2), 3,33 и 3,79 (2H, 2д, J=10.8 Hz, H₂-28), 4,57 и 4,68 (2H, 2 уш.с, H₂-29). MS, m/z (отн. интенсивность): 440.4 (9.51, M+) [Hiroya K., Takahashi T., Miura N., Naganuma A., Sakamoto T. // Bioorgan. Med. Chem. 2002. V.10. P.3229-3236].

Пример 1.

Биотрансформацию бетулина (0,5 г/л) проводят с использованием нерастущих клеток R. rhodochrous ВКПМ АС-1898 в 100 мл фосфатно-щелочного буфера (pH 8) при постоянном перемешивании (160 об/мин) и 28°C. Оптическая плотность используемой клеточной суспензии 2,0 (сухой вес биомассы 7 г/л). Бетулин (0,5 г/л) в буфер добавляют в виде раствора в ДМСО. Выход бетулона составляет 45% через 48 ч.

Пример 2.

Способ осуществляют по примеру 1, но с использованием клеточной суспензии с оптической плотностью (OD₆₀₀) 2,6 (сухой вес биомассы 10 г/л). Выход бетулона составляет 65% через 48 ч.

Пример 3.

Способ осуществляют по примеру 2, бетулин в буфер добавляют в концентрации 0,5 г/л. Через 24 ч выход бетулона составляет 60%.

Пример 4.

Способ осуществляют по примеру 2, но бетулин в буфер добавляют в концентрации 3,0 г/л. Через 24 ч выход бетулона составляет 40%.

Описание чертежей.

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых изображено.

На Фиг.1. Влияние концентрации используемой клеточной биомассы на выход бетулона в процессе биотрансформации бетулина (0,5 г/л) нерастущими клетками R. rhodochrous ВКПМ АС-1898. Условия процесса биотрансформации: фосфатно-щелочной буфер (pH 8), 100 мл; бетулин (0,5 г), растворенный в 0,5 мл ДМСО; 28°C, 180 об/мин, 48 ч.

На Фиг.2. Динамика образования бетулона в условиях использования различных концентраций бетулина (0,5-3,0 г/л). Условия процесса биотрансформации: фосфатно-щелочной буфер (pH 8), 100 мл; клеточная суспензия с оптической плотностью (OD₆₀₀) 2,6 (сухой вес биомассы 10 г/л); 28°C, 180 об/мин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическому получению бетулона. Способ предусматривает выращивание клеток штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-1898. Клетки осаждают и трижды промывают фосфатно-щелочном буферным раствором. Рессуспендируют в том же растворе и доводят оптическую плотность клеточной суспензии до заданного значения и вносят бетулин в растворе диметилсульфоскида в концентрации от 0,5 до 3,0 г/л с последующей биотрансформацией бетулина в бетулон. При этом процесс биотрансформации составляет 24-48 ч при оптической плотности клеточной суспензии 2,0-2,6 (сухой вес биомассы 7-10 г/л). Изобретение позволяет повысить выход бетулона. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр.

1. Способ получения бетулона, заключающийся в микробиологической трансформации бетулина нерастущими клетками Rhodococcus rhodochrous ВКПМ АС-1898 в фосфатно-щелочном буферном растворе с pH 8 при оптической плотности клеточной суспензии 2,0-2,6 (сухой вес биомассы 7-10 г/л) и нагрузке бетулина 0,5-3,0 г/л.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс ведут 24-48 ч.