Биодеструктор ибупрофена Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности, к биодеструкции фармполлютантов природной среды с помощью микроорганизмов.

В настоящее время остро стоит проблема медикаментозного загрязнения окружающей среды: в водных объектах 71 страны мира обнаружено более 600 химических веществ, относящихся к фармацевтическим препаратам. Фармполлютанты, представляющие собой высоко стабильные соединения с разнообразной химической природой и выраженной биоактивностью, с начала 2000-х годов признаны новым классом ксенобиотиков [aus der Beek Т., Weber F,A,, Bergmann Α., Hickmann S., Ebert I. Hein Α., Pharmaceuticals in the environment - Global occurrences and perspectives // Environmental Toxicology and Chemistry. 2016. Vol. 35. P. 823-835]. Чаще всего и в сравнительно значительных концентрациях (нг/л-мкг/л) - это тотально применяемые антибиотики, анальгетики и нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), гормоны, спазмолитики, антидепрессанты, терапевтические средства для лечения рака, а также статины и противодиабетические препараты [Fatta-Kassinos D., Maric S., Nikolaou A. Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research // Analytical and Bioaralytical Chemistry. 2011, Vol. 399, P. 251-275]. Фармполлютанты оказывают вредное влияние на окружающую среду, вызывая даже в экологически значимых концентрациях острую токсичность [Domaradzka D., Guzik U., Wojcieszyn'ska D. Biodegradation and biotransformation of polycyclic non-steroidal anti-inflammatory drugs // Reviews Environmental Science and Bio/Technology. 2015. Vol. 14. P. 229-239].

В связи с этим необходимо изучение возможности их биодеструкции микроорганизмами загрязненных сред, играющих роль первичной системы реагирования на потенциально опасные изменения среды их обитания и запускающих механизмы реакции детоксикации и разложения ксенобиотиков на самых ранних стадиях.

Среди микроорганизмов, участвующих в процессах самоочищении природных экосистем, важную экологическую роль в биологической детоксикации и деконтаминации почв и воды могут играть актинобактерии рода Rhodococcus - устойчивые обитатели загрязненных почв, водоемов, сточных вод, обладающие высокой активностью оксидоредуктаз, богатыми адаптивными возможностями в отношении различных токсических соединений, а также высоким потенциалом для биоремедиации загрязненных объектов [Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Krivoruchko Α.V. Hydrocarbon-oxidizing bacteria and their potential in cco-biotechnology and bioremediation // In: I. Microbial Resources: From Functional Existence in Nature to Industrial Applications, Academic Press. Cambridge. 2017. pp. 121-148].

Ранее была подтверждена способность родококков к полной биодеструкции фармпрепаратов группы обезболивающих и спазмолитических средств, в том числе парацетамола [Ившина И.Б., Рычкова М.И., Вихарева Е.В., Чекрышкна Л.Α., Мишенина И.И. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции не пригодных к использованию лекарственных средств // Прикладная биохимия и микробиология. 2006, Т. 42. №4. С. 443-447], дротаверина гидрохлорида (Патент RU 2496866. 2013), диклофенака натрия (Патент RU 2707536. 2019).

Задачей авторов данного изобретения было выявление возможного использования представителей рода Rhodococcus в качестве биоокислителей ибупрофена - моноциклического НПВС, производного пропионовой кислоты, наиболее часто детектируемого в окружающей среде. Ибупрофен - часто применяемый в медицине и ветеринарии лекарственный препарат, обладающий противовоспалительным, жаропонижающим, анальгезирующим эффектом, используется в лечении остеоартрита, подагры, перикардита, рака.

Объемы производства ибупрофена исчисляются тысячами тонн в год. Тотальное применение ибупрофена, высокая устойчивость молекулы и его неполное разложение в организме человека, ненадлежащая утилизация просроченного препарата приводят к значительным объемам его эмиссии в окружающую среду [Chopra S., Kumar D. 2020, Ibuprofen as an emerging organic contaminant in environment, distribution and remediation // Heliyon. 2020. Vol. 6: e04087]. Ибупрофен повсеместно встречается в поверхностных, грунтовых и очишенных сточных водах и в питьевой воде в концентрациях от нескольких нг/л до 6.000 мкг/л [Moreau М, Hadfteld J., Hughey J., Sanders F., Lapworth D.J., White D., Civil W. A baseline assessment of emerging organic contaminants in New Zealand groundwater // Science of the Total Environment. 2019. Vol. 686. P. 425-439].

Ибупрофен аккумулируется в живых организмах и способствует проявлению негативных эффектов - окислительный стресс, повреждение структуры ДНК. подавление активности отдельных ферментов, нитрование белков, нарушение работа митохондрии и пероксидирование липидов.

Развитие экологической биотехнологии свидетельствует о том, что бактериальная биоремедиация становится все более перспективной стратегией очистки загрязненных экосистем. Успех стратегии зависит прежде всего от правильного выбора штамма-биодеструктора, а также разработки эффективной методологии очистки загрязненных сред. Использование традиционных физико-химических методов и нынешних окислительных технологий утилизации фармацевтических загрязнителей экологически небезопасно и трудозатратно, поэтому сохраняется потребность в инновационных технологиях, направленных на эффективную детоксикацию и выведение органических микрозагрязнителей из водных и сухопутных экосистем.

В связи с этим технической задачей описываемого изобретения является изыскание средства, обеспечивающего эффективную и экологически безопасную биотрансформацию фармполлютанта ибупрофена. Для этого авторами изобретения был осуществлен поиск активного штамма-биодеструктора ибупрофена и проведены эксперименты по изучению закономерностей процесса биоразложения молекулы ибупрофена в зависимости от условии эксперимента.

Техническим результатом изобретения является эффективная биодеструкция ибупрофена штаммом Rhodococcus cemstii ИЭГМ 1278. На 8 сутки эксперимента биодеградация ибупрофена (100 мг/л) в условиях кометаболизма достигает 98.5%. В условиях низкой концентрации (100 мкг/л) ибупрофена полную деградацию ибупрофена регистрировали на 30 ч эксперимента.

Предлагаемый в качестве эффективного биодеструктора ибупрофена штамм выделен в естественных условиях из нефтезагрязненной почвы после биоремедиации. Удмуртская республика. Россия.

Штамм депонирован в Национальный биоресурсный центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2160.

Данный штамм характеризуется следующими признаками.

Культуральные и морфологические признаки

Штамм R. cerastii ВКПМ Ас-2160 штамм представляет собой грамположительные неспорообразующие неподвижные плеоморфные одиночные короткие палочки с закругленными концами размером 0,5-1,0×2,0-4,0 мкм. Хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясного экстракта и пептонов. Колонии, выращенные на мясопептонном агаре, округлые, выпуклые, с ровным краем, непрозрачные, маслянистой консистенции, желто-оранжевого цвета размером 2-3 мм (через пять суток 3-4 мм). Рост возможен при температуре 5-28°С. Значение рН, оптимальное для роста клеток, составляет 6,8-7,0. Однако рост происходит и при рН 6.5-10.5 и в присутствии 1-6% (w/v) NaCl (оптимально 2-3%) в мясопептонном бульоне.

Φизиолого-биохимические признаки

Штамм R. cerastii ВКПМ Ас-2160 имеет выраженную каталазную активность, характеризуется хемоорганотрофным и окислительным типом обмена веществ, В качестве единственного источника азота использует нитраты или соли аммония. Образует кислоту из глюкозы, лактозы, фруктозы, рамнозы, рибозы, арбутина, салицина, трегалозы, ксилозы, инозитола, галактозы, маинозы, целлобиозы, но не продуцирует ее из α-метил-клюкозида, дульцитола, фукозы, meso-эритрола, раффинозы, ксилитола. Не усваивает в качестве единственного источника фенилуксусную, пропионовую и олеаноловую кислоты. Использует в качестве единственного источника углерода такие углеводороды, как н-пропан (С3), н-пептан (С5), н-додекан (С12), н-пентадекан (С15), н-гексадекан (С16), н-гептадекан (С17). Содержит миколовыс кислоты с 44-54 атомами углерода. Штамм характеризуется высокой устойчивостью к солям тяжелых металлов, а именно Cr⁶⁺ (40,0 мМ). Ζn²⁺ (20,0 мМ). Cu²⁺, Ni²⁺, Mo⁶⁺ (5,0 мМ).

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример. Динамика биотрансформации ибупрофена клетками Rhodococcus cerastii ВКПМ Ас-2160 в присутствии н-гексадекана или D-глюкозы.

Ибупрофен (C₁₃H₁₇O₂Na; CAS: 31121-93-4; (RS)-2-(4-(2-метилпропил)фенил)пропановая кислота в виде натриевой соли) использовали в виде фармацевтической субстанции (бесцветный кристаллический порошок с характерным запахом, чистота - 98,0%). Для получения ультрачистой воды для высокоэффективной жидкостной хроматографии использовали Millipore Simplicity Personal Ultrapure Water System (Millipore, США).

По результатам определения минимальных подавляющих концентрации (МПК) ибупрофена микропланшетным методом выявлена выраженная устойчивость штамма Rhodococcus cerastii ВКПМ Ас-2160 в отношении фармвещества (МПК ≥1000 мг/л).

В экспериментах по биотрансформации ибупрофена применяли минеральную среду "Киевская"' (г/л); ΚΝO₃ - 1,0; K₂HPO₄, - 1,0: ΚH₂PO₄ - 1,0: NaCl - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2: CaCl₂×2H₂O 0.02; FeCl₃ - 0,001 (pH 6.9) с добавлением раствора микроэлементов http://www.iegmcol.ru/ strains/index.html]. Ибупрофен вносили в виде стерильного концентрированного водного раствора (1000 мг/л) до конечной концентрации 100 мг/л или 100 мкг/л. При выборе начальной концентрации фармсоединения учитывали большой объем его использования, интенсивность выброса в окружающую среду и персистентность в природных средах. При этом исходили из фактической концентрации ибупрофена. детектируемого в водных и почвенных средах, а также из предположения о том, что большие дозы провоцируют негативные эффекты, но стимулируют защитные механизмы организма, тогда как малые дозы вызывают негативные эффекты, но не стимулируют защитные механизмы организма.

В качестве дополнительного источника углерода и энергии использовали н-гексадекан (0,1 об, %) или D-глюкозу (0,5%), а инокулята - суспензию родококков (OII₆₀₀ 1,0), предварительно выращенных в течение 3 сут в LB (Sigma-Aldrich, США) и отмытые дважды фосфатным буфером (рН 7,0). Эксперименты по биотрансформации ибупрофена проводниц в условиях периодического культивирования (160 об/мин, 28°С) в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с объемом среды 100 мл. Масштабирование процесса биотрансформации ибупрофена проводили в условиях лабораторного биореактора BioFlo/CclliGen 115 (Eppendorf. New Brunswick, США) в объеме среды 4 л при температуре 28°С с дополнительной аэрацией 0,3 л/мин и скоростью перемешивания 160 об/мин.

В качестве контролей использовали (а) стерильный раствор ибупрофена в минеральной среде (для оценки абиотической деструкции фармвещества): (б) стерильный раствор ибупрофена в минеральной среде с инактивированными бактериальными клетками (для оценки степени адсорбции ибупрофена на бактериальных клетках).

Убыль ибупрофена в процессе биогрансформации контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографа I.С Prominence 20A (Shimadzu Япония), оборудованного хроматографнческой колонкой с обращенно-фазным сорбентом Phenomenex Jupiter® 5и C18 300 А, 250 × 4,60 мм 5 мкм (Phenomenex. США) и диодно-матричным детектором (SPD-M20A). Оптимальные условия для определения ибупрофена: подвижная фаза фосфатный буферный раствор (рН 5,5) - ацетонитрил (40:60), поток элюента - 0,5 мл/мин. температура колонки 40°С, объем вводимой пробы - 20 мкл, длина волны детектирования - 254 нм, В данных условиях время удерживания субстрата составило 9,28±0,20 мин. Регистрацию и обработку хроматографнческой информации осуществляли с помощью программы LCSolution (v/1,25 rus).

Эксперименты показали, что родококкн неспособны к метаболизму ибупрофена в качестве единственного источника углерода и энергии. Биодеструкцию ибупрофена фиксировали исключительно в условиях косубстратного культивирования.

В условиях высокой концентрации ибупрофена (100 мг/л) на 8 сут эксперимента биоконверсия вещества составляла 97,1% и 98,5% в присутствии н-гексадекана и глюкозы соответственно (Фиг. 1А). В условиях экологически релевантной концентрации (100 мкг/л) полная трансформация ибупрофена достигалась к 30 ч эксперимента в присутствии обоих субстратов (Фиг. 1Б).

При проведении процесса биотрансформации ибупрофена в условиях лабораторного биореактора наблюдали замедление убыли фармполлютанта: остаточное содержание ибупрофена на 20 сут эксперимента составляло еще более 30% (Фиг. 2А). Следует отметать, что уровень биоконверсии субстрата коррелировал (-0,92) с уменьшением концентрации растворенного в культуральной среде кислорода. Обнаружено, что поглощение кислорода снижалось с накоплением продуктов биотрансформации ибупрофена (Фиг. 2Б), что свидетельствовало о подавляющем влиянии их высокой концентрации на респирацию активно растущей бактериальной биомассы.

Таким образом, заявленный штамм Rhodococcus cerastii ИЭГМ 1278. депонированный в Национальный биоресурсный центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2160, может рассматриваться как эффективный биодеструктор ибупрофена.

Изобретение поясняется нижеследующими графическими материалами, на которых изображены:

на Фиг. 1. Динамика биотрансформации 100 мг/л (А) и 100 мкг л ибупрофена (Б) клетками R, cerastii ВКПМ Ас-2160 в присутствии н-гексадекана (1) или глюкозы (2). - контроль биосорбции, - контроль абиотической деструкции.

на Фиг. 2. Динамика биотрансформации 100 мг/л ибупрофена клетками R. cerastii ВКПМ Ас-2160 (А) и совокупная площадь ВЭЖХ-пиков продуктов биотрансформации ибупрофена (Б) в условиях лабораторного биореактора. - содержание растворенного кислорода в среде.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Rhodococcus cerastii ВКПМ Ас-2160, обладающий способностью к деструкции ибупрофена может быть использован при доочистке сточных вод фармацевтических предприятий и обезвреживании опасных фармотходов. 2 ил.

Применение штамма бактерий Rhodococcus cerastii ВКПМ Ас-2160 в качестве биодеструктора ибупрофена.