СПОСОБ ОЦЕНКИ БЕЛОК СИНТЕЗИРУЮЩЕЙ ФУНКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано в клинической практике для диагностики белков и пептидов, синтезируемых лейкоцитами.

Известными способами молекулярной диагностики являются иммуноферментный анализ, полимеразно-цепная реакция и различные варианты применения этих методик в комбинации с иммуноблотингом и методами культивирования клеток крови человека для диагностики синтезируемых белков или определения фрагментов ДНК (генов) или РНК, кодирующих синтез белков в клетке. (Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с.; Kalendar R., Lee D., Schulman A.H., 2011 Java Web tools for PCR, in silico PCR, and oliginucletide assembly and analysis./ Genomics, 98(2): 137-144. http://pnmerdigital.com/tools; Клиническая лабораторная аналитика. Том II. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории / Под ред. В.В. Меньшикова: М.: Лабинформ-РАМЛД. - 1999. - С.205; Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная аналитика. Том I. - Основы клинического лабораторного анализа.- М.: Агат-Мед. - 2002. - 860 с.).

Описанные методы являются недостаточно точными в целях оценки белков, синтезируемых лейкоцитами в условиях очага воспаления и/или условиях тесного межклеточного контакта, дефицита питательных веществ и метаболического стресса.

Для решения данной задачи применяются специальные методики, например метод, примененный в научном исследовании К. Hattar at al (Grandel Amplification of LPS and LTA induced cytokine synthesis in NSCLC/neutrophil cocultures // J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 22198)). Авторы установили роль межклеточной кооперации, стимулирующее влияние продуцируемых цитокинов (ИЛ-8) и тесного межклеточного контакта путем определения матричной РНК, кодирующей синтез цитокинов (ИЛ-6) нейтрофилами в культуре клеток.

Вместе с тем, описанный метод является экономически высокозатратным и трудоемким, что не позволяет применить его в клинической практике для индивидуальной диагностики.

Недостатком другого метода, описанного Туевым А.В., Мишлановым В.Ю. в 2000 году (Патент РФ №2194995 МПК G01N 33/92, опубл. 20.12.2002. «Способ диагностики прогрессирующей стенокардии у больных ишемической болезнью сердца». Приоритет установлен 28.04.00.), является определение только концентрации общего холестерина в супернатанте культуры лейкоцитов, ассоциированного с молекулами белка, что не позволяет осуществлять точную молекулярную диагностику белоксинтезирующей функции лейкоцитов для клинических исследований.

Общим недостатком описанных методов культивирования клеток является длительность периода культивации.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому методу является иммуноферментный анализ белков в сыворотке крови. Безусловным преимуществом метода является точность определения концентрации белков. Однако при воспалении белки и пептиды, определяемые в сыворотке крови, отражают системный уровень иммунного ответа, «включающийся» в ряде ситуаций позднее, чем местный, определяющийся процессами происходящими непосредственно в тканях (Ross R. Atherosclerosis - an inflammatory disease // N. Engl. J. Med. - 1999. - Vol.340. - P.115-126). В связи с этим изучение концентрации белков и пептидов, синтезируемых клетками (лейкоцитами) непосредственно в очаге воспаления, позволяет судить о местном воспалительном ответе и является в ряде ситуаций более ранним маркером патологического процесса.

Изобретение направлено на решение задачи: повышение точности и производительности метода.

Решение указанной задачи достигается путем применения метода иммуноферментного анализа, при котором белки и/или пептиды определяют после предварительного 20-часового культивирования лейкоцитов, выделенных из венозной крови, в присутствии фактора некроза опухоли-альфа с последующим разрушением клеточных мембран лизирующим раствором и 50-кратным разведением образцов при определении концентрации альфа-дефензинов, а при изучении содержания С-реактивного белка без разведения, рекомендованного для определения сывороточной концентрации фирмой производителем тест-системы, с целью достижения оптимального соотношения антигена и моноклональных антител (конъюгата).

Вышеперечисленная совокупность существенных признаков позволяет получить следующий технический результат - повышение точности и производительности метода.

Способ осуществляют следующим образом.

Лейкоциты выделяют из венозной крови с помощью системы Vacutainer BD, содержащей декстрозу, или методом отстаивания в растворе полиглюкина. Клеточную суспензию отмывают физиологическим раствором натрия хлорида, затем питательной средой Игла-МЕМ. Осуществляют подсчет количества клеток и доводят их концентрацию до 50000 в 1 мкл, что обеспечивает тесный клеточный контакт при культивировании лейкоцитов. Суспензию лейкоцитов в количестве 400 мкл помещают в стерильные пенициллиновые флаконы, закрывают резиновыми пробками. Культивирование клеточной суспензии, обогащенной лейкоцитами, осуществляется в среде Игла-МЕМ в течение 20 часов при 37°C, при добавлении фактора некроза опухоли -альфа в концентрации 0,005 мкг/мл. После культивирования клеточные мембраны лейкоциты разрушают, применяя лизирующий раствор. Проводят ресуспендирование, центрифугирование образцов. Затем молекулярную диагностику осуществляют методом иммуноферментного анализа, например, используя наборы фирмы Hycult Biotech для определения концентрации дефензинов-альфа (1-3) и/или наборы фирмы Biomerica для определения С-реактивного белка. При этом для повышения чувствительности методики и достижения оптимального соотношения антигена и моноклональных антител (конъюгата) в случае определения концентрации СРБ разведение биологического материала не применяется, в отличие от рекомендованного 100-кратного при изучении в сыворотке крови, а при определении содержания альфа-дефензинов образцы разводятся в 50 раз.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Проведено обследование 15 практически здоровых лиц среднего возраста 43,4±45 года. Среди них мужчины составили 37%, а женщины 63%. У всех обследуемых с использованием метода иммуноферментного анализа определялось содержание дефензинов (наборы фирмы Hycult Biotech) и C-реактивного белка (наборы фирмы Biomerica) в сыворотке крови и в супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур по описанной методике с оптимального разведением образцов. Определены средние значения дефензинов и C-реактивного белка в сыворотке крови и в супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур (см. табл.1).

Таблица 1 Содержание дефензинов и С-реактивного белка в сыворотке крови и супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур у здоровых лиц Показатель Единицы измерения Среднее значение в сыворотке±SD Среднее значение в супернатантах лейкоцитарных культур ±SD Дефензин-альфа нг/мл 0,16±0,09 115,9±56,3 C-реактивный белок мкг/л 10,3±5,6 1,8±1,1

Приведенные данные свидетельствуют о том, что C-реактивный белок и дефензины, синтезированные лейкоцитами в культуре in vitro, могут быть определены описанным выше методом.

Пример 2. Больной П., 47 лет, обследован через 1 месяц после операции коронарного шунтирования по поводу окклюзирующего атеросклероза передней нисходящей и огибающей коронарных артерий с наложением 2-х аутовенозных шунтов. Клинически отмечается положительная динамика, заключающаяся в исчезновении симптоматики стенокардии после оперативного лечения, исчезновении болей, связанных с стернотомией, отсутствие местных воспалительных изменений со стороны послеоперационного шва передней грудной стенки, заживлением послеоперационных ран голени. Методом иммуноферментного анализа с использованием набора фирмы Hycult Biotech определена концентрация дефензинов-альфа в сыворотке крови - 0,23 нг/мл, в супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур (предложенным методом) - 104,12 нг/мл. С помощью наборов фирмы Biomerica определена концентрация C-реактивного белка в сыворотке крови - 44,7 мкг/л, в супернатантах лейкоцитарных культур (предложенным методом) - 2,5 мкг/л.

Данный пример демонстрирует высокое диагностическое значение определения C-реактивного белка в культуре лейкоцитов и показывает, что у больного ишемической болезнью сердца, перенесшего операцию коронарного шунтирования 1 месяц назад, имеющего положительную клиническую динамику и исчезновение острых воспалительных изменений в области послеоперационных швов, концентрация C-реактивного белка, синтезируемого лейкоцитами в условиях in vitro, соответствует средним значениям, полученным в группе практически здоровых лиц, а концентрация C-реактивного белка в сыворотке крови уменьшается медленно и остается умеренно повышенной. Концентрация дефензинов в сыворотке и культуре лейкоцитов значимо не отличалась от уровня здоровых лиц (см. пример 1). Подобная особенность концентрации противомикробных пептидов может быть маркером минимальной активности воспаления, что подтверждается клинически благополучным течение послеоперационного периода.

Пример 3. Больной М., 50 лет, обследован через 1 месяц после операции коронарного шунтирования по поводу окклюзирующего атеросклероза передней межжелудочковой, огибающей и правой коронарных артерий с наложением 4-х аутовенозных шунтов. На 2 неделе послеоперационного периода появилась одышка, субфибрильная лихорадка. Пациент отмечал болевой синдром связанный со стернотомией, наблюдались признаки местного воспаления в области послеоперационной раны. При проведении ультразвукового исследования плевральных полостей в синусах выявлен уровень жидкости. Отмечался умеренный лейкоцитоз 8,8·10⁹ и высокая СОЭ - 56 мм/час. На 4 неделе послеоперационного периода пациент был госпитализирован в кардиологическое отделение, где верифицирован посткардиотомный синдром.

В сыворотке крови и супернатантах, содержащих лизаты лейкоцитарных культур (по предложенной методике), была выявлена высокая концентрация C-реактивного белка - 103 мкг/л и 8,4 мкг/л соответственно. При относительно не высоком содержании сывороточных дефензинов - 0,29 нг/мл отмечен их высокий уровень в супернатантах лейкоцитарных культур (по предложенной методике) - 178,9 нг/мл. Оценка содержания изучаемых пептидов позволяет говорить об активном системном и местном воспалительном процессе, что коррелирует с неблагоприятным течением послеоперационного периода у данного пациента.

Представленные данные подтверждают высокое диагностическое значение предлагаемого метода и позволяют считать, что белки и пептиды, синтезированные лейкоцитами в условиях тесного межклеточного контакта in vitro имеют патогенетическое и высокое клиническое значение.

Предлагаемый способ отличается от известного следующими признаками.

Сроки культивирования лейкоцитов сокращены до 20 часов, для стимуляции синтеза белка применяется фактор некроза опухоли-альфа, определение белков или пептидов, синтезированных лейкоцитами, осуществляют иммуноферментным методом после предварительного разрушения мембран лейкоцитов лизирующим раствором, для повышения чувствительности методики и достижения оптимального соотношения антигенного материала и моноклональных антител (конъюгата) в случае определения концентрации СРБ разведение биологического материала не применяется, в отличие от рекомендованного фирмой производителем тест-системы 100-кратного при изучении в сыворотке крови, а при изучении содержания альфа-дефензинов образцы разводятся в 50 раз.

Данное описание и примеры рассматриваются как материал, иллюстрирующий изобретение, сущность которого и объем патентных притязаний определены в нижеследующей формуле изобретения, совокупностью существенных признаков и их эквивалентами.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и описывает способ оценки белоксинтезирующей функции лейкоцитов для клинических исследований методом иммуноферментного анализа путем выделения лейкоцитов из венозной крови с использованием системы Vacutainer BD, содержащей декстрозу, процедуры отмывания клеток, подготовки суспензии, содержащей 50000 клеток в 1 мкл, последующего 20-часового культивирования в среде Игла-MEM при добавлении фактора некроза опухоли-альфа в концентрации 0,005 мкг/мл, разрушения клеточных мембран лизирующим раствором и 50-кратным разведением образцов при определении концентрации альфа-дефензинов, а при определении содержания C-реактивного белка без разведения. Изобретение обеспечивает повышение точности и производительности метода. 1 таб., 3 пр.

Способ диагностики белоксинтезирующей функции лейкоцитов для клинических исследований методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что белки и/или пептиды определяют после предварительного 20-часового культивирования лейкоцитов, выделенных из венозной крови, в присутствии фактора некроза опухоли-альфа с последующим разрушением клеточных мембран лизирующим раствором и 50-кратным разведением образцов при определении концентрации альфа-дефензинов, а при изучении содержания C-реактивного белка без разведения, рекомендованного для определения сывороточной концентрации фирмой производителем тест-системы.