ШТАММ БАКТЕРИЙ Rhodococcus rhodochrous - ДЕСТРУКТОР НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, а также к экологии. Оно касается получения новой культуры бактерий, эффективной при очистке природных объектов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, детоксикации опасных нефтесодержащих отходов и обеспечивающей снижение концентрации углеводородов, в том числе тяжелых углеводородных фракций.

Несмотря на значительное количество работ, посвященных микробиологической утилизации нефтеотходов и биовосстановлению загрязненных углеводородами земель, данная проблема остается открытой для новых решений. При этом особенно остро стоит вопрос биологической утилизации нефтешламов - опасных нефтесодержащих отходов, имеющих большое содержание биологически и химически устойчивых тяжелых углеводородных фракций.

Известен штамм бактерий Mycobacterium flavescens ЕХ-91 ВКПМ В-6000 (патент РФ №2053296, МПК (6) C12N 1/20, C02F 3/34, C12R 1:32, C12N 1/20, опубл. 1996). Данный штамм показал эффективную деструкцию нефти, мазута, дизельного топлива и керосина на 30; 43; 45 и 81% соответственно при температуре 10°C.

Известен штамм бактерий Rhodococcus species 56-Д ЦКМ В-61 Б (Центральная коллекция микроорганизмов государственного концерна «Биопрепарат»), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (патент РФ №2101352, МПК (6) C12N 1/20, C02F 3/34, B09C 1/10, C12R 1:01, опубл. 1998). Данный штамм осуществляет очистку от нефти, мазута, дизельного топлива, керосина при температуре 12-30°С в течение 7-14 суток.

Известны штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis для разложения нефти и нефтепродуктов (патент РФ №2257409, МПК (7) C12N 1/20, B09C 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1:01, опубл. 2005; патент РФ №2257410 МПК (7) C12N 1/20, B09C 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1:01, опубл. 2005). Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номерами ВКПМ Ас-1668 и ВКПМ Ас-1667 соответственно. Штаммы показывает высокую эффективность деструкции в отношении нефти. Деструкция застарелых нефтяных загрязнений штаммами Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1668 и Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1667 составила 70,7% и 71,7% при 30 сутках эксперимента соответственно.

Недостатком всех вышеперечисленных штаммов является отсутствие способности перерабатывать тяжелые нефтяные углеводороды, входящие в состав нефтешламов.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococus globerulis Н-42 для разложения нефти и нефтепродуктов, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1641 (патент РФ №2300561, C12N 1/20 (2006.01), C02F 3/34 (2006.01), В09С 1/10 (2006.01), C12R 1/00 (2006.01), опубл. 2007). Для штамма показана способность в течение двух месяцев снизить исходную концентрацию углеводородов на 81,3% в нефтезагрязненной почве. В почве с застарелым нефтяным загрязнением деструкция углеводородов в течение одного месяца составила 80,7%.

Недостатком данного штамма является низкая эффективность снижения концентрации углеводородов при очистке застарелых нефтяных загрязнений, представленных биологически устойчивыми углеводородами (аналогично нефтешламам).

Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма бактерий, проявляющего высокую деструкционную активность в отношении нефтяных углеводородов, входящих в состав нефтешламов, а также в отношении нефти и мазута.

Для достижения технического результата предлагается использовать штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous KR 32, выделенный из нефтезагрязненной почвы в Краснодарском крае. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г.Пущино) под регистрационным номером ВКМ Ас-2018 Д.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик. Полученный штамм характеризуется следующими морфологическими, культуральными, хемотаксономическими и физиологическими признаками, позволяющими определить его таксономическую принадлежность. На мясо-пептонном агаре (МПА) образует округлые, ярко-красные колонии диаметром 1-2 мм (культивирование в течение 3 суток, при 25°C), на мясо-пептонном бульоне при тех же условиях, без встряхивания - помутнение, осадок. В возрасте 15 часов культура представлена грамположительными коринеформными палочками размером 0,7×2-8 мкм, ветвление не отмечено. В возрасте 4 суток клетки укорачиваются до 1 мкм, т.е. наблюдается выраженный цикл развития кокк-палочка-кокк. Подвижность не наблюдалась ни в одной из фаз развития. В гидролизатах целых клеток обнаруживаются мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза (IV тип клеточной стенки). Метилмиколаты, по подвижности при тонкослойной хроматографии, соответствуют нокардомиколовым кислотам. Содержит дигидрированные менахиноны с восемью изопреноидными единицами. Строгий аэроб. Растет при температурах от 4°C до 37°C. Каталазо- и оксидазоположителен. Использует в качестве единственного источника углерода и энергии: цитрат, малат, сукцинат, пропионат, пируват, глицерол; не использует следующие соединениях в качестве единственного источника углерода и энергии: лактат, фумарат, оксалат, адипинат (натриевые соли). Гидролизует: мочевину, твин-80; не гидролизует: крахмал, целлюлозу. Растет в присутствии 8% NaCl.

На основании культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков, а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК, таксономическая принадлежность штамма была определена как Rhodococcus rhodochrous.

Поддержание штамма осуществляется на плотной агаризованной питательной среде - питательном агаре (ПА) следующего состава (г/л):

- панкреатический гидролизат рыбной муки - 24,0;

- натрий хлористый - 4,0;

- агар-агар микробиологический - 12,0±2,0;

- вода дистиллированная - 1 л.

Поддержание штамма в пробирке со скошенным ПА при температуре 4°C осуществляется в течение не более чем 1-2 месяца. По истечении этого срока требуется пересев на свежую среду.

Хранение штамма на длительный срок (годы) осуществляют посредством лиофилизацией биомассы клеток на аппарате для лиофильной сушки типа ЛС-1000 (или эквивалентном) с последующей герметичной запайкой лиофилизата в стеклянные ампулы. Хранение лиофилизированной культуры при (4-6)°C. Штамм хорошо переносит замораживание сырой биомассы в растворе глицерина с последующим хранением при -70°C.

Для получения штамма ампулу объемом 2-5 мл, содержащую лиофильно высушенную на лиофильной сушилке ЛС-1000 биомассу штамма Rhodococcus rhodochrous KR 32 ВКМ Ас-2018 Д, стерильно вскрывают, заполняют при помощи стерильного шприца или пипетки Пастера стерильным физиологическим раствором. Полученную суспензию штрихом рассевают на питательном агаре для получения изолированных бактериальных колоний. Отмечают совпадение культурально-морфологических свойств полученного изолята с таковыми Rhodococcus rhodochrous KR 32 ВКМ Ас-2018 Д.

Получение биомассы клеток штамма осуществляют посредством глубинного культивирования на жидкой минеральной среде следующего состава (г/л):

- KNO₃ - 4;

- Na₂HPO₄×12H₂O - 1,4;

- KH₂PO₄ - 0,6;

- MgSO₄×7H₂O - 0,8;

- стандартный раствор микроэлементов (10 элементов) - 1 мл;

- вода дистиллированная - 1 л.

Данная среда используется для получения биомассы в небольших объемах в лабораторных условиях (до 8 литров жидкой культуры). При необходимости получения больших объемов (более 8 литров исходной жидкой культуры) в качестве питательной среды использовали осветленную вытяжку из комплексных минеральных удобрений.

В качестве единственного источника углерода и энергии в среду вносят сахарозу, либо растительное масло, либо углеводороды в концентрациях 0,5-2% по массе. В качестве оборудования возможно использование качалочных колб, биореакторов различной емкости и конструкции, обеспечивающих перемешивание и аэрирование среды в необходимом объеме.

Культивирование на качалочных колбах осуществляют в сосудах объемом 0,1-1,0 л при частоте оборотов платформы 100-200 об/мин и температуре 20-30°C. Срок культивирования - 4-7 суток.

Культивирование на аппарате культивирования АК-210 емкостью 10 л (коэффициент заполнения до 0,8) производства Института биологического приборостроения РАН осуществляют при оборотах ротора 160-280 об/мин, температуре 25-30°C. Срок культивирования 2-3 суток.

Культивирование в ферментационном модуле емкостью 100 л (коэффициент заполнения 0,85) комплексного биотехнологического оборудования ОКА-01-100Т производства Института биологического приборостроения РАН осуществляют при оборотах ротора 140-250 об/мин, температуре 25-30°C. Срок культивирования 3-4 суток.

В результате удается получить культуру с концентрацией биомассы клеток штамма Rhodococcus rhodochrous KR 32 ВКМ Ас-2018 Д до 3 г/л (абсолютно сухой вес) и титром живых клеток до 5×109 КОЕ (колонии образующих единиц)/мл.

Деструкционная активность штамма Rhodococcus rhodochrous KR 32 ВКМ Ас-2018 Д отражается способностью усваивать индивидуальные алканы (C₅H₁₂, C₆H₁₄, C₇H₁₆, C₈H₁₈, C₉H₂₀, C₁₀H₂₂, C₁₁H₂₄, C₁₂H₂₆ C₁₃H₂₆, C₁₄H₃₀, C₁₅H₃₂, C₁₆H₃₄, C₁₇H₃₆, C₁₈H₃₈, а также парафин - смесь высших алканов C₁₈-C₃₅) в качестве единственного источника углерода и энергии при культивировании на агаризованной минеральной питательной среде (использована питательная среда для наработки биомассы при глубинном культивировании в лабораторных условиях, с добавлением 1,8% агара, индивидуальные алканы добавляли в чашки в количестве 1% непосредственно перед застыванием агара, культивирование велось при 10°C, 30°C и 37°C в течение 7 суток, посев производили микробиологической петлей, инокулят выращивали на минеральной среде с нефтью).

Практическая применимость штамма связана с его способностью осуществлять эффективную деструкцию нефти российской, топочного мазута и различных нефтешламов, различающихся составом, в том числе содержанием тяжелых углеводородных фракций.

Лабораторные испытания, проведенные в Кубанской медицинской академии, показали непатогенность штамма. Испытания проводились в остром опыте на белых мышах. Наблюдение за животными вели в течение 30 суток после заражения. Штамм не обладает токсичным или токсигенным воздействием.

На чертеже представлены графики снижения концентрации нефтепродуктов в смеси нефтешламов с грунтом. График 1 - снижение концентрации при обработке Rhodococcus rhodochrous KR 32 BKM Ac-2018 Д, график 2 - контроль.

Пример 1. Деструкция штаммом Rhodococcus rhodochrous KR 32 BKM Ac-2018 Д нефтяных углеводородов, входящих в состав нефтешламов, а также нефти и мазута была исследована в следующих опытах. Готовилась жидкая минеральная среда для получения биомассы глубинным культивированием в лабораторных условиях. Среда разливалась по 50 мл во флаконы емкостью 200 мл, стерилизовалась автоклавированием 30 мин при 1 атм.

В качестве субстрата использовались нефтесодержащие отходы (нефтешламы) и товарные нефтепродукты. Их состав, отражающий содержание тяжелых фракций, приведен в таблице 1. Нефтесодержащие отходы (нефтешламы) стерилизовались автоклавированием 20 мин при 0,5 атм, вносились в среду в количестве 0,5 г перед инокуляцией. Среда инокулировалась суспензией предварительно выращенных клеток штамма Rhodococcus rhodochrous KR-32 BKM Ac-2018 Д в минеральной среде. Засевная доза составляла 10⁶ клеток/мл.

Флаконы помещались на качалку и культивировались при температуре 30°С на протяжении 7 суток. Результаты оценивались по остаточной концентрации углеводородов в среде, определявшейся гравиметрическим методом. В качестве контроля использовали колбы с соответствующими углеводородами, куда штамм не вносили. Как видно из таблицы 1, предлагаемый штамм способен расти на тяжелых нефтепродуктах с высоким содержанием ароматических и, в том числе, полициклических соединений. Большое снижение концентрации углеводородов при деструкции широкого круга биологически устойчивых нефтеотходов (нефтешламы) и товарных нефтепродуктов (нефть, мазут) позволяет утверждать, что штамм Rhodococcus rhodochrous KR 32 BKM Ac-2018 Д способен утилизировать тяжелые нефтяные фракции.

Таблица 1 Деструкция штаммом Rhodococcus rhodochrous KR 32 ВКМ Ас-2018 Д нефтяных углеводородов различных нефтешламов и товарных нефтепродуктов Субстрат Содержание биологически устойчивых компонентов углеводородной природы, % Утилизация, % 3 суток 7 суток контроль Метанонафтеноароматическая фракция Парафины Смолы бензольные/спиртобензольные Асфальтены Нефтешлам 1 84,58 1,05 6,25 8,12 78 97 9 Нефтешлам 2 65,19 15,52 9,39 9,9 83 95 8 Нефтешлам 3 90,64 0 2,08/1,71 5,93 91 98 7 Нефтешлам 4 73,45 13,59 7,39 5,57 82 97 6 Нефтешлам 5 80,24 12,68 4,6 2,48 85 98 8 Нефтешлам 6 81,51 1,01 5,09/5,58 6,81 78 97 5 Нефтешлам 7 36 6,71 3,61/2,62 10,38 76 95 3 Нефть сырая 79,43 0,21 5,31/7,04 8,01 79 100 21 Мазут М-40 70,66 11,27 11,52/4,39 2,16 87 96 17

Пример 2. Деструкция штаммом Rhodococcus rhodochrous KR 32 ВКМ Ас-2018 Д нефтяных углеводородов, входящих в состав смеси нефтешлама с грунтом, исследовали в лабораторных условиях. Для этого в 2 стакана на 1000 мл вносили по 300 г смеси нефтешлама с грунтом при содержании нефтепродуктов 61 г/кг, в один добавили 2 мл культуры штамма, Rhodococcus rhodochrous KR 32 ВКМ Ас-2018 Д с концентрацией клеток 10⁸ КОЕ/мл. Во второй стакан штамм не вносили. В оба стакана вносили воду до 60% полной влагоемкости грунтосмеси, а также аммофос в количестве 0,1 г в каждый стакан. Очищаемый грунт регулярно перемешивали, влажность и концентрацию биогенных элементов измеряли и поддерживали на начальном уровне. Результаты оценивались по остаточной концентрации нефтяных углеводородов, определявшейся гравиметрическим методом. Биообработку повторили через 15 дней эксперимента. После 30 дней очистки степень деструкции нефтяных углеводородов при их начальной концентрации 61 г/кг составила 85%. В стакане, куда штамм не вносили, снижение концентрации не превышало 12%.

Пример 3. Деструкция штаммом Rhodococcus rhodochrous KR 32 BKM Ac-2018 Д нефтяных углеводородов, входящих в состав смеси нефтешлама с грунтом, была исследована в полевых условиях. Испытания препарата проводили на территории объекта размещения нефтесодержащих отходов. На специально оборудованном полигоне были размещены нефтешламы в смеси с грунтом. На выделенном участке отходы были обработаны суспензией клеток штамма Rhodococcus rhodochrous KR 32 BKM Ac-2018 Д в концентрации 10⁷ КОЕ/мл, из расчета 10 л/тонна. В качестве контроля был подготовлен такой же участок, куда штамм не вносили. На оба участка внесли аммофос из расчета 300 г/тонна, по мере необходимости проводили увлажнение и перемешивание. Обработки аммофосом, увлажнение и рыхление повторяли 3 раза в месяц. Биологическая обработка была повторена через 20 дней эксперимента. Результаты оценивались измерением концентрации нефтяных углеводородов гравиметрическим методом. На чертеже показано уменьшение концентрации нефтепродуктов в обрабатываемых отходах (график 1) и контроле (график 2). В результате обработки препаратом концентрация нефтепродуктов снизилась с 93,45 до 12,10 г/кг за 48 дней (деструкция составила 87,05%), что показывает возможность и эффективность использования штамма для снижения концентрации нефтяных углеводородов в нефтешламах.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью штамма Rhodococcus rhodochrous KR 32 BKM Ac-2018 Д достигается эффективная деструкция нефтяных углеводородов при биологической очистке и детоксикации опасных нефтесодержащих отходов, в том числе нефтешламов, восстановлении нефтезагрязненных объектов.

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН под регистрационным номером ВКМ Ас-2018 Д. Штамм обладает высокой деструкционной активностью в отношении нефтяных углеводородов, входящих в состав нефтешламов, а также в отношении нефти и мазута. Деструкция указанным штаммом за 7 суток сырой нефти составляет до 100%, нефтешламов - до 98%, мазута - до 96%. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Штамм Rhodococcus rhodochrous BKM Ac-2018 D - деструктор нефтяных углеводородов.