ШТАММ БАКТЕРИЙ Rhodococcus degradans H33 Ас-2901D - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, представляет собой новый бактериальный штамм Rhodococcus degradans Н33 Ac-2901D - деструктор нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов.

В настоящее время загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами является одной из актуальных проблем. При этом остается открытым вопрос их биологической деструкции при помощи микроорганизмов, способных окислять нефтяные углеводороды в широком диапазоне рН 4-11 (так как многие нефтезагрязнения в Западной Сибири локализованы в кислых средах, а для загрязнений южных регионов России характерны щелочные значения рН) [1].

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus [2], которые осуществляют деструкцию нефтепродуктов в ассоциации, что увеличивает затраты на изготовление конечного препарата.

Известен штамм Bacillus species 739 [3] и полученный на его основе бактериальный препарат «Бациспецин» [4], используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Недостатком штамма является его низкая эффективность, особенно в условиях высокого содержания нефти и нефтепродуктов в углеводородсодержащем субстрате, отсутствует информация о рН - стабильности бактериальной культуры и ее рабочем диапазоне рН.

Большая эффективность в условиях низких положительных температур установлена для штамма Rhodococcus erythropolis Е-17 [5] при биодеградации нефти, без указания рабочего диапазона рН утилизации нефтепродуктов.

Наиболее близким аналогом является штамм Rhodococcus jialingiae Б-М-1 - деструктор нефтяных углеводородов, депонированный во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номером Ас-1967 [6], жизнеспособный до значения рН 9. Недостатком данного штамма является отсутствие информации о диапазоне рН, в котором проявляется его нефтеокисляющая способность.

Целью изобретения является расширение номенклатуры штаммов нефтедеструкторов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне рН (от 4,5 до 11).

Полученный штамм выделен из нефтезагрязненной почвы Республики Башкортостан.

Полученный штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ Ac-2901D и характеризуется следующими признаками:

Клетки штамма - подвижные палочки изменчивые по Граму, встречающиеся преимущественно парами и нерегулярными скоплениями, не спорообразующие. Небольшие непрозрачные, круглые колонии с ровными краями с бледно-лососево-розовым пигментом диаметром 1,0-2,5 мм (на питательном агаре). Оптимальная температура роста 26-28°С. Не растут при 37°С. Рост при температурах от 15 до 30°С, рН от 4,5 до 11 и концентрации хлорида натрия до 7%. Положительные признаки: каталаза, оксидаза, гидролиз желатина и казеина, утилизация цитрата, индола, фосфатазную активность, образование H₂S, использует малонат в качестве источника углерода. Отрицательные признаки: активности лизин-декарбоксилазы, уреазы, лецитиназы, нитратредуктазы, утилизация крахмала.

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена кодирующего 16S рРНК с известными структурами из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) позволяет утверждать, что микроорганизм относится к виду Rhodococcus degradans (обнаружено 100% сходства с типовым штаммом вида Rhodococcus degradans ССМ 4446).

Хранится на косяках МПА и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.

Пример 1. Приготовление препарата на основе микробных клеток Rhodococcus degradans Н33 Ас-2901D.

Культуру Rhodococcus degradans Н33 выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0,1; CaCl₂ - 0,01; MnSO₄⋅7H₂O - 0,02; FeSO₄⋅7H₂O - 0,02; NaH₂PO₄ - 1,5; K₂HPO₄ - 1,0; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2; NH₄NO₃ - 2,0; пептон - 1,0; дизельное топливо - 10; вода дистиллированная - 1000 мл при температуре 26±2°С в течение 72-96 часов. Полученную нативную культуру, содержащую не менее 1⋅10⁹ живых микробов в 1 см³, используют в качестве биологического препарата для оценки деструктивной активности в отношении нефти и нефтепродуктов при различных значениях рН.

Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus degradans Н33 Ac-2901D в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении воды при различных значениях рН.

Для определения биодеградационной активности штамма Rhodococcus degradans Н33 Ac-2901D в отношении нефти, дизельного топлива и мазута в воде при кислом (рН 4,5), нейтральном (рН 6,86) и щелочном (рН 11,0) значениях рН готовят минимальную солевую среду (пропись среды изложена в примере 1), разливают в лабораторные колбы емкостью 250 см по 100 см и доводят до нужной кислотности. Затем в отдельные колбы вносят нефть, дизельное топливо, мазут в количестве 10,0 г/л среды и нативную культуру штамма Rhodococcus degradans Н33 Ac-2901D (по примеру 1) в количестве, обеспечивающем конечную биологическую концентрацию в смеси 1⋅10⁷ живых микробных клеток. В качестве контроля параллельно ставят аналогичные пробы без внесения микробной культуры. Затем пробы выдерживают на термостатируемой качалке при температуре 26±2°С и постоянном перемешивании 180 об/мин в течение 7 сут.

Концентрацию нефтепродуктов в пробах воды определяют с использованием анализатора жидкости Флюорат-02 согласно ПНДФ 14.1 2 4.128-98 Методика измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природных, питьевых, сточных вод на анализаторе жидкости Флюорат-02 (М 01-05-2012).

Утилизация (нефтеокисляющая активность) составила:

при рН 4,5 в отношении нефти, дизельного топлива и мазута соответственно 54,5%, 58,0% и 32,6% (в контроле менее 1,0%);

при рН 6,86 в отношении нефти, дизельного топлива и мазута соответственно 98,6%, 99,6% и 68,6% (в контроле менее 1,8%);

при рН 11,0 в отношении нефти, дизельного топлива и мазута соответственно 88,6%), 92,2% и 60,3% (в контроле менее 1,0%).

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus degradans Н33 Ac-2901D в отношении нефти и нефтепродуктов при загрязнении почвы при различных значениях рН.

Определение биодеградационной активности штамма Rhodococcus degradans Н33 Ac-2901D в отношении нефти, дизельного топлива и мазута при загрязнении почвы при кислом (рН 4,5), нейтральном (рН 6,86) и щелочном (рН 11,0) значениях рН проводят следующим образом. Доводят рН почвы с остаточной влажностью 50-60%) до нужной кислотности и фасуют по 1 кг в сосуды емкостью 1,5 дм. Затем в отдельные сосуды вносят нефть, дизельное топливо, мазут в количестве 80 г/кг почвы и нативную культуру штамма Rhodococcus degradans Н33 Ac-2901D (по примеру 1) из расчета конечной концентрации 1⋅10⁷ живых микробных клеток на 1 г загрязненной почвы. Приготовленные пробы выдерживают при температуре 22±2°С в течение 2 месяцев. В качестве контроля параллельно ставят аналогичные пробы без внесения микробной культуры. Остаточную влажность поддерживают орошением водопроводной водой на протяжении срока наблюдения.

Концентрацию нефтепродуктов в пробах почвы определяют в соответствии с ПНД Ф 16.1.41-2004 «Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах почв гравиметрическим методом».

Утилизация (нефтеокисляющая активность) составила:

при рН 4,5 в отношении нефти, дизельного топлива и мазута соответственно 65,8%, 68,9% и 39,5% (в контроле менее 2,0%);

при рН 6,86 в отношении нефти, дизельного топлива и мазута соответственно 87,5%, 95,6% и 58,4% (в контроле менее 2,8%);

при рН 11,0 в отношении нефти, дизельного топлива и мазута соответственно 80,2%, 82,5% и 50,4% (в контроле менее 2,0%).

Таким образом, преимуществом заявляемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 7 суток до 2 месяцев), в широком диапазоне рН среды (от 4,5 до 11,0), который может быть использован для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, мазут).

Список литературы

1. Ветрова А.А., Иванова А.А., Филонов А.Е., Забелин В.А., Гафаров А.Б., Соколов С.Л., Нечаева И.А., Пунтус И.Ф., Воронин A.M. Биодеструкция нефти отдельными штаммами и принципы составления микробных консорциумов для очистки окружающей среды от углеводородов нефти // Изв. Тульского гос. ун-та. Естественные науки. 2013. Вып. 2, ч. 1. С. 241-257.

2. Патент СССР №1493666, кл. C12N 1/20, C02F 3/34, C02F 101/32, C02F 103/06, C12R 1/01, C12R 1/27, 1989.

3. Авторское свидетельство СССР №1743019, кл. С12N 1/20, 1989.

4. Патент РФ №2077397, кл. C09K 3/32, 1997.

5. Патент РФ №2019527, кл. C02F 3/34, 1994.

6. Патент РФ №2618838, кл. C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, C12R 1/01, 2016.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus degradans Н33, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ Ac-2901D и может быть использован при биологической очистке воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Изобретение позволяет повысить степень очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. 3 пр.

Штамм бактерий Rhodococcus degradans ВКМ Ac-2901D - деструктор нефти и нефтепродуктов.