ШТАММ БАКТЕРИЙ Rhodococcus sp. - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D - деструктор нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (1. Авторское свидетельство СССР № 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), Acinetronacter sp. НВ-1 (2. Патент RU N 2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1.01, C12N 1/20, B09C 101:00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии), Pseudomonas alcaligenes Е7 (3. Патент RU Ν 2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии).

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (4. Патент RU N 2019527. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений. С1, C02F 3/34, Е02В 15/04, С09K 17/00. Заявка: 93017464/26, 30.04.1993. Опубликовано: 15.09.1994. Заявитель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр. Авторы: Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. Патентообладатель: Северный государственный научно-исследовательский и проектно-конструкторский геологический центр), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Известен консорциум нефтеокнсляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас.% каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м² (5. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20. C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель. Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.Α., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18-+22°C, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+4°С).

В качестве прототипа служит штамм бактерий ((Bacillus subtilis Колыма 7/2» (6. Патент RU 2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроен М.М.. Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова А.М. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +4 до +30°C.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих способностью утилизировать, как нефть, так и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +4 до +30°C.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D - деструктор нефти и нефтепродуктов, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), перспективный для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в широком диапазоне температур (от +4 до +30°С).

Происхождение штамма.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D выделен из мерзлого грунта Шахты Шергина, г. Якутск, Республика Саха (Якутия), ул. Кулаковского, 18.

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ Ac-2626D. Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамположительные, неподвижные палочки. В односуточной культуре на минеральной среде Мюнца (7. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки -Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) образует короткие толстые палочки. При делении наблюдается характерное расположение клеток под углом друг к другу.

Культуральные признаки.

На мясопептонном агаре (ΜΠΑ), мас.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2, формирует пастообразные гладкие колонии кремовото-розового цвета диаметром 1-5 мм.

На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки, мас.%: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; pH 7,1-7,5, формирует пастообразные блестящие колонии кремовото-розового цвета диаметром 1-5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.

На среде Сабуро, мас.%: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный -0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3, формирует сметанообразные колонии кремовото-розового цвета диаметром 1-5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.

В мясопептонном бульоне, мас.%: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2, вызывает диффузное помутнение.

На минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава, мас.%: KNO₃- 0,4; MgSO₄·7Η₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРО₄ - 0,14; KН₂РO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH 7,2, растет в виде пастообразных матовых мутных колоний диаметром 1 мм. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм растет при температуре +4+30±1°C, в аэробных условиях и слабо в анаэробных условиях. Оптимум роста +4-+20±1°C.

Оксидазаотрицательный, не декарбоксилирует лизин, декарбоксирует орнитин, не способен расщеплять фенилаланин. Индолотрицателен. Сероводород не продуцирует. Не активен в отношении инозита. Уреаза отрицателен. Тест с β-галактозидазой -отрицателен. Не ферментирует лактозу, глюкозу, цитрат натрия, малонат натрия. Использует в качестве источника энергии нефтяные УВ.

Устойчив к амоксиклаву, ампициллину, каотиму, амоксициллину, иефлоксацину, амосину. Слабоустойчив к левомицетину. Чувствителен к бензилпенициллину, мозивару, оксациллину, цефатоксиму, цефтриаксону, полимиксину, фуразолидону, метранидазолу.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D

Штамм бактерий Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D выделен из мерзлого грунта Шахты Шергина, г. Якутск, Республика Саха (Якутия), ул. Кулаковского, 18 методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на ΜΠΑ.

Для этого 1,0 г мерзлого грунта с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца следующего состава, мас.%: ΚΝΟ₃ - 0,4; MgSO₄·7Η₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРО₄ - 0,14; KН₂РО₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, pH 7,2. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды. Инкубация проводилась в термостатируемьгх качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°C. Рост бактерий наблюдали уже через 7 дней инкубации по образованию мутноватой эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с ΜΠΑ, мас.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах от +4 до +30°C. Через 48-72 ч на поверхности ΜΠΑ наблюдали появление пастообразных гладких колоний кремовото-розового цвета диаметром 1-5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (8. Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408) идентифицированы как штамм Rhodococcus sp.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный ΜΠΑ и инкубируют 48 ч при температуре +20±1°C. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду следующего состава, мас.%: ΚΝO₃ - 0,4; MgSO₄·7Η₂Ο - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРO₄ - 0,14; KН₂РO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; pH среды 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48 ч, при температуре 20±1°С, при 200 об/мин. Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D, с титром 1-5·10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D

Клетки штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D со скошенного ΜΠΑ смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1·10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ас-2626D культивируют в водной среде с минеральным составом, мас.%: KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7Η₂Ο - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРO₄ - 0,14; KН₂РO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; pH среды 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D до концентрации 1·10⁹ клеток/ см³. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют при температурах +4°C; +20°C; +30°C в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (9.ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D уже на 7-е сутки при температуре +4°C утилизирует 14,0-19,8% нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C - 49,77-59,1%; при температуре +30°C - 43,2-66,18% в зависимости от типа ксенобиотика (табл. 1).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ AC-2626D

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Rhodococcus sp.LER-12 ВКМ Ac-2626D (по примеру 1), содержащего 1·10⁹ клеток/см³ суспензии. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 2 месяцев, поддерживая температуру воды в интервале +15-+20°С.

Полученные результаты (табл. 2) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D за 2 месяца составила 52,55%. Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась.

Пример 5. Очистка почвы от нефти с помощью клеток штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D

Способность штамма Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D активировать процессы деградации нефтезагрязнений в мерзлотной почве показаны в условиях полевого опыта (табл. 3).

Биодеградацию нефти в почве в процессе очистки штаммом Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ac-2626D определяют методом холодной экстракции в хлороформе по методике (10.РД 39-0147098-90 Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома).

За 2 месяца деградация нефтезагрязнения в почве, обработанной бактериальным препаратом на основе штамма: Rhodococcus sp. LER-12 ВКМ Ас-26260 составила 53,95%; в контрольном варианте естественные потери нефтезагрязнения составили 11,54% за тот же промежуток времени.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 7 суток до 2 месяцев), в широком диапазоне температур от +4 до +30°C, который может быть использован, для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Rhodococcus sp. LER-12, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), депонирован в ВКМ под регистрационным номером Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2626D и может быть использован для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне температур от +4 до +30°C. Изобретение позволяет повысить качество очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. 3 табл., 5 пр.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. BKM Ac-2626D - деструктор нефти и нефтепродуктов.