УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИНТЕГРАЛЬНОГО АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕВОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/68 C12M1/38 C12N15/09 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к устройству для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени и к способу определения целевой нуклеиновой кислоты с его использованием и, более конкретно, к устройству для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени для одновременного осуществления качественного анализа или количественного анализа генов в многочисленных биологических образцах различных типов и к способу определения целевой нуклеиновой кислоты с его использованием.

ПРЕДПОСЫЛКИ

В отношении диагностического исследования in vitro (диагностическое исследование iv), конкретное целевое вещество определяют или количественно анализируют, используя образец, полученный из организма человека, такой как кровь, моча, слюна или т.п., в качестве образца, с целью определить, протекает ли заболевание или инфекция, или нет. Молекулярное диагностическое исследование или исследование нуклеиновой кислоты (NAT) является самым быстро растущим сегментом рынка диагностических исследований in vitro, но его осуществляют только в крупных больницах и организациях, специализированных на клинических исследованиях, вследствие сложности процесса.

Качественные и количественные исследования на вирусы или бактерии, вызывающие инфекционные заболевания, в настоящее время составляют основную часть молекулярных диагностических исследований, и подтверждающее исследование или т.п. осуществляют для того, чтобы независимо подтвердить результаты диагностического исследования на инфекционные заболевания или подтвердить наличие мутантов. Быстро растет число диагностических исследований для ранней идентификации опухолей и увеличения эффективности способов терапии. Молекулярные диагностические исследования различно применяют в области персонализированной медицины для определения аномальных генов, определения способов терапии, выбора лекарственного средства и оценки эффективности лекарственного средства, в отношении заболеваний, вызываемых личной генетической предрасположенностью.

Используемая в настоящее время автоматизированная система для молекулярного диагностического исследования разработана таким образом, что весь ход выделения, амплификации, идентификации и т.п. нуклеиновой кислоты является автоматизированным. Например, в отношении системы прямого отбора образца из пробирки TIGRIS DTS компании Gen-Probe, которая является первой автоматизированной системой, одобренной Управлением по контролю над продуктами и лекарствами США, захват мишеней, амплификация, идентификация и вывод результатов исследования являются автоматизированными. Система может исследовать инфекцию Neisseria gonorrhea, которая является возбудителем гонореи, в качестве одного из типичных венерических заболеваний, и Chlamydia trachomatis, которая является возбудителем передаваемого половым путем заболевания. В качестве других примеров, разработаны система COBAS (Ampliprep, анализатор Taqman) компании Roche Molecular Systems, система m2000 (m2000sp, m2000rt) компании Abbott, система GeneXpert компании Cepheid, анализатор Liat («Лаборатория в пробирке») компании IQuum Inc., в автоматизированной системе, основанной на полимеразной цепной реакции (ПЦР), и представлены на рынке.

Однако в соответствии с существующей автоматизированной системой, поскольку получение образцов, количественный анализ в реальном времени и отчет в отношении образца одного типа осуществляют за одну стадию, невозможно осуществлять получение образцов, количественный анализ и качественный анализ в реальном времени и создавать отчет в отношении образцов многих различных видов одновременно и за один раз.

В частности, число пациентов с гепатитом В велико, тогда как число пациентов с туберкулезом не много. В этом случае исследования нужно отложить на несколько дней до тех пор, пока не будет получено предварительно определенное количество образцов. В случае, когда осуществляют диагностическое исследование образцов нескольких типов, для каждого типа нужно осуществлять отличающееся исследование, что требует повторных экспериментов и, таким образом, многие исследования нельзя осуществить за день. Необходимо много времени для сбора образцов для определения гепатита B и выделения, очистки и амплификации нуклеиновой кислоты для того, чтобы определить вирус гепатита В.

По существу, много времени необходимо для того, чтобы получить большое количество образцов одного типа, и расточительно использовать современный 96-луночный реактор для амплификации нуклеиновых кислот для того, чтобы анализировать только несколько образцов гепатита В. В конце концов, в этом случае устройство работает без пользы или нужно дополнительно собирать образцы. По этой причине мелкие и средние больницы не могут осуществлять различные клинические исследования относительно малого числа клинических образцов вследствие экономических и временных ограничений и, таким образом, привлекает внешние исследовательские организации для проведения исследований, что ведет к увеличению времени, затрат и усилий.

ОПИСАНИЕ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

Авторы настоящего изобретения, изучая автоматизированную систему, способную выделять, анализировать и создавать отчеты о мишенях нескольких типов одновременно, разработали устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени для сбора образцов нескольких типов, выделения нуклеиновых кислот из образцов нескольких типов в тот же день и одновременного определения нуклеиновых кислот в одном амплификаторе нуклеиновых кислот для того, чтобы предоставить маленьким и средним больницам, которые имеют относительное небольшое число образцов, возможность осуществлять различные диагностические исследования эффективно, и способ анализа целевых нуклеиновых кислот с его использованием, и затем выполнили настоящее изобретение.

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, которое способно одновременно осуществлять качественный анализ или количественный анализ генов, соответствующих биологическим образцам множества различных типов.

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ определения целевой нуклеиновой кислоты с использованием устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к устройству для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, которое способно одновременно осуществлять качественный анализ или количественный анализ генов из многочисленных биологических образцов различных типов.

Настоящее изобретение также относится к способу определения целевой нуклеиновой кислоты из биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты, с использованием устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени.

В основном аспекте представлено устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени для одновременного осуществления качественного анализа или количественного анализа целевых нуклеиновых кислот, соответствующих биологическим образцам различных типов, где устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени содержит: множество приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, которые отделяют и очищают целевые нуклеиновые кислоты от биологических образцов различных типов, содержащих целевые нуклеиновые кислоты; амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200, содержащий многолуночный блок термоциклирования 210 и измеряющий количества целевых нуклеиновых кислот различных типов в реальном времени, которые получены посредством множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100; контроллер, который назначает множество лунок на блоке термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200 посредством стандартизованной колонки, в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот, соответственно целевым нуклеиновым кислотам различных типов, соответственно разделенным и очищенным посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, сохраняет информацию о биологических образцах из приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 в соответствии с соответствующими лунками, назначенными посредством стандартизованной колонки, осуществляет одновременную амплификацию при тех же условиях для блока термоциклирования и осуществляет комплексное управление так, что результаты амплификации, посредством которых соответствующие целевые нуклеиновые кислоты качественно или количественно анализируют, соответствуют соответствующим биологическим образцам, которые подвергли разделению и очистке посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100; и блок отображения 300 в реальном времени, который выводит результаты качественного или количественного анализа с контроллера.

При назначении множества лунок на блоке термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200 посредством стандартизованной колонки, в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот, и сохранении информации о биологических образцах в соответствии с приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100 соответственно соответствующим лункам, назначенным посредством стандартизованной колонки, можно дополнительно хранить информацию об образце положительного стандарта, образце отрицательного стандарта или образце количественного стандарта.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 может иметь диагностические наборы, загруженные на многолуночный блок термоциклирования 210, диагностические наборы содержат нуклеиновые кислоты различных типов, полученные от множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100.

Многолуночный блок термоциклирования 210 может представлять собой 96-луночный блок термоциклирования, состоящий из 12 колонок × 8 рядов лунок.

Измеряемые элементы можно выборочно установить на многолуночный блок термоциклирования 210 посредством стандартизованной колонки.

Контроллер, когда внутренний положительный контроль (ВПК) отделяют вместе с биологическими образцами различных типов в каждом приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100, может определить по продукту амплификации посредством амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, успешно ли отделили нуклеиновую кислоту посредством приспособления для автоматизированной очистки и распределения 100, и тем самым может определить, нужно ли повторять отделение нуклеиновой кислоты.

Контроллер может качественно определить присутствие или отсутствие целевых нуклеиновых кислот, посредством сравнения значений Ct соответствующих биологических образцов, которые получены посредством одновременной амплификации при тех же условиях амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, с критическим значением Ct.

Контроллер может количественно определять целевую нуклеиновую кислоту в образце посредством сравнения соответствующих значений Ct, полученных посредством одновременной амплификации образца количественного стандарта с известной концентрацией и соответствующих биологических образцов при тех же условиях амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, с количественным графиком значений Ct образца количественного стандарта для вычисления числа целевых нуклеиновых кислот.

Приспособление для автоматизированной очистки и распределения 100 может содержать картридж, содержащий различные биологические образцы, содержащие нуклеиновые кислоты и буферы, используемые для выделения нуклеиновых кислот из них, охлаждающий блок, высокотемпературный блок, емкость для жидких отходов, картридж пипетки и блок пипетки, блок пипетки можно перемещать на подложке, на которой предоставлены блоки и картриджи, что делает возможным присоединение и разъединение пипеток, и содержит блок приложения магнитного поля для приложения магнитного поля к пипеткам или его выключения, а информацию о соответствующих образцах стандартов и биологических образцах и информацию о целевых нуклеиновых кислотах в соответствии с приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100 можно хранить в контроллере.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 может содержать многолуночный блок термоциклирования, температуру которого меняют в соответствии с предварительно определяемыми значениями температуры, источник света облучения для облучения светом реакционных пробирок, загруженных в блок термоциклирования, и датчик определения флуоресцентного света для того, чтобы принимать свет, создаваемый в реакционных пробирках, и измеряемые элементы задают и хранят посредством стандартизованной колонки назначенных лунок.

Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени может дополнительно содержать блок хранения базы данных 400, хранящий результаты анализов.

В другом основном аспекте способ определения целевой нуклеиновой кислоты с использованием устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени содержит: 1) отделение и очистку нуклеиновых кислот, содержащихся в соответствующих образцах, от различных биологических образцов, содержащих образцы стандартов и нуклеиновые кислоты, посредством множества приспособлений для автоматизированного разделения и очистки 100, и затем внесение раствора, таким образом отделенного и очищенного, в реакционную пробирку с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот; 2) назначение множества лунок на многолуночном блоке термоциклирования 210 посредством стандартизованной колонки в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот так, что многолуночный блок термоциклирования 210, на который загружают реакционные пробирки с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот, и соответствующие целевые нуклеиновые кислоты, разделенные и очищенные посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, соответствуют друг другу, и хранение информации об образцах стандартов и биологических образцах, разделенных посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, соответственно с соответствующими лунками, назначенными посредством стандартизованной колонки; 3) загрузку реакционных пробирок, подготовленных на стадии 1), в соответствующие лунки в соответствии с хранимой информацией о биологических образцах в соответствующих лунках многолуночного блока термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени; и 4) одновременно амплификацию соответствующих целевых нуклеиновых кислот, загруженных на блок термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени, при тех же условиях и осуществление качественного анализа или количественного анализа соответствующих целевых нуклеиновых кислот для множества биологических образцов, и тем самым получение результатов амплификации.

На стадии 1) внутренний положительный контроль (ВПК) можно добавить в биологический образец с последующим отделением нуклеиновой кислоты в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100 и можно определить эффективность определения целевой нуклеиновой кислоты посредством определения успешности отделения целевой нуклеиновой кислоты в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100 по результатам амплификации, а также эффективность амплификации.

Реакционную пробирку с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот можно подготовить посредством внесения раствора отделенной и очищенной нуклеиновой кислоты в реакционную пробирку, которая содержит компоненты, необходимые для амплификации нуклеиновой кислоты, в сухом виде и смешивания раствора с компонентами.

Внутренний положительный контроль может представлять собой частицу вируса табачной мозаики, когда целевой нуклеиновой кислотой является РНК.

Внутренний положительный контроль может представлять собой плазмидную ДНК или продукт ПЦР, когда целевой нуклеиновой кислотой является ДНК.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Как изложено выше, устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени может автоматически осуществлять отделение и очистку нуклеиновых кислот от биологических образцов различных типов, используя по меньшей мере два приспособления для автоматизированной очистки и распределения, и может одновременно анализировать различные образцы за один раз в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени, и может снижать временные и финансовые затраты на исследование, используя контроллер, который управляет приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения и амплификатором нуклеиновых кислот в реальном времени.

Кроме того, в соответствии со способом определения целевой нуклеиновой кислоты с использованием устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, можно подтвердить, отделены ли нуклеиновые кислоты для соответствующих биологических образцов или нет, и имели ли место проблемы во время процедуры амплификации нуклеиновой кислоты в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени, посредством добавления внутренних положительных контролей по настоящему изобретению вместе с биологическими образцами в приспособление для автоматизированной очистки и распределения во время отделения и очистки нуклеиновой кислоты.

Кроме того, множество лунок многолуночного блока термоциклирования можно назначить в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот соответственно целевым нуклеиновым кислотам различных типов, отделенным и очищенным в соответствующих приспособлениях для автоматизированной очистки и распределения, и, таким образом, можно параллельно осуществлять исследования различных мишеней, необходимые для различных образцов, за одну стадию. Следовательно, настоящее изобретение можно эффективно использовать в больницах или т.п., где необходимо быстро диагностировать заболевания.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Указанные выше и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения видны из следующего описания предпочтительных вариантов осуществления, данного в сочетании с сопроводительными чертежами, на которых:

На фиг. 1 представлено схематическое изображение устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению.

На фиг. 2 представлен вид многолуночного блока термоциклирования 210, предоставленного в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени 200 по настоящему изобретению.

На фиг. 3 представлен вид блока отображения 300 по настоящему изобретению.

На фиг. 4 представлена полная схема устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению.

На фиг. 5 представлена загружающая образцы в лунки часть картриджа в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения по настоящему изобретению.

На фиг. 6 представлен график полимеразных цепных реакций в реальном времени (ПЦР) со стандартными матрицами вируса табачной мозаики (TMV) в отношении частиц вируса табачной мозаики (ВПК) по настоящему изобретению.

На фиг. 7 представлена калибровочная кривая (наклон: -0,283, R²: 1) для графика ПЦР в реальном времени стандартных матриц вируса табачной мозаики (TMV) на основе частиц вируса табачной мозаики (ВПК) по настоящему изобретению.

На фиг. 8 представлен график ПЦР в реальном времени ДНК стандартной матрицы HBV в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени с использованием наборов для количественной ПЦР HBV по настоящему изобретению.

На фиг. 9 представлена калибровочная кривая (наклон: -0,2882, R²: 0,9997) для графика ПЦР в реальном времени ДНК стандартной матрицы HBV в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени с использованием наборов для количественной ПЦР HBV по настоящему изобретению.

На фиг. 10 представлен график ПЦР в реальном времени стандартной матрицы РНК HCV в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени с использованием наборов для количественной ОТ-ПЦР HCV по настоящему изобретению.

На фиг. 11 представлена калибровочная кривая (наклон: -0,2970, R²: 0,9998) для графика ПЦР в реальном времени стандартной матрицы РНК HCV в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени с использованием наборов для количественной ОТ-ПЦР HCV по настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ОСНОВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ

100: приспособление для автоматизированной очистки и распределения

200: амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени

300: блок отображения

400: блок хранения базы данных

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В настоящем документе подробно описано устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени со ссылкой на сопроводительные чертежи. Следующие чертежи предоставлены в качестве примера с тем, чтобы в достаточном объеме передать идею настоящего изобретения специалистам в той области, к которой относится настоящее изобретение, и могут быть выполнены не в масштабе.

Если не указано иначе, следует понимать, что все термины, используемые в описании, включая технические и научные термины, имеют такое же значение, в котором их понимают профессионалы в данной области, и, кроме того, в приведенных ниже описании и сопроводительных чертежах хорошо известные функции или конструкции не описаны подробно, поскольку это может излишне затруднить понимание настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Пример 1 направлен на устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению. На фиг. 1 схематически изображено устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению, и далее в настоящем документе настоящее изобретение описано более подробно.

Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени содержит множество приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 для отделения и очистки различных нуклеиновых кислот от биологических образцов различных типов, содержащих нуклеиновые кислоты. Биологический образец обозначает биологический материал, который выделен из природной окружающей среды и содержит нуклеиновую кислоту. Биологический образец по настоящему изобретению может представлять собой раствор нуклеиновой кислоты, микроорганизм, ткань, биологическую жидкость или клетки, которые очищены или отделены. Примеры биологической жидкости могут включать кровь, плазму, мокроту, мочу, церебральную спинномозговую жидкость, жидкость лаважа желудка, лейкофорез, различные образцы, полученные из организма человека и т.п., но не ограничен этим. Образец по настоящему изобретению может представлять собой образец, полученный из любого растения, животного, организма человека, бактерии или вируса, содержащий нуклеиновые кислоты. Примеры нуклеиновой кислоты в настоящем изобретении, как правило, могут включать ДНК, РНК, ПНК, гибрид ДНК и РНК или содержащее их вещество, но не ограничены этим. Устройство по настоящему изобретению можно использовать при разделении и определении вещества, такого как белок.

Как показано на фиг. 1, можно установить несколько приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 по настоящему изобретению, предпочтительно, от 2 до 6, для того, чтобы отделять нуклеиновые кислоты от образцов одного типа, многих типов или нескольких типов. Приспособление для автоматизированной очистки и распределения 100 по настоящему изобретению отличается тем, что магнитную частицу обратимо связывают с нуклеиновой кислотой для отделения нуклеиновой кислоты для того, чтобы отделить нуклеиновые кислоты от большого числа растворов биологических образцов.

Приспособление для автоматизированной очистки и распределения 100 автоматически очищает и распределяет нуклеиновые кислоты и содержит картридж, содержащий различные биологические образцы, содержащие нуклеиновые кислоты и буферы, которые используют для выделения нуклеиновых кислот из них, охлаждающий блок, высокотемпературный блок, емкость для жидких отходов, картридж пипетки и блок пипетки. Блок пипетки можно двигать по подложке, на которой предоставлены упомянутые выше блоки и картриджи, что делает возможным присоединение и разъединение пипеток, и содержит блок приложения магнитного поля для приложения магнитного поля к пипеткам или его выключения. Блок пипетки может позволять присоединение и разъединение от 8 до 16 пипеток.

Магнитные частицы, используемые при отделении нуклеиновых кислот от большого числа растворов биологических образцов, связывают нуклеиновые кислоты в буфере. Если магнитное поле применяют к пипетке, когда нуклеиновые кислоты, связанные с магнитными частицами, всосаны в пипетку, то магнитные частицы, связанные с нуклеиновыми кислотами, образуют скопления в пипетке и прилипают к внутренней части пипетки, а другие вещества выбрасывают из пипетки.

В качестве магнитных частиц по настоящему изобретению предпочтительно используют мелкие магнитные частицы, обладающие большой площадью поверхности.

В настоящем изобретении можно использовать постоянный магнит или электромагнит в качестве блока приложения магнитного поля для приложения магнитного поля к пипетке, а магнитное поле можно применять к пипетке обратимо. Раствор можно выбрасывать посредством поршня, соединенного с пипеткой во время работы пипетки, а перемещать пипетку можно посредством блока перемещения пипетки.

В качестве приспособления для автоматизированной очистки и распределения 100 по настоящему изобретению можно использовать общеизвестное устройство автоматизированной очистки и распределения, и можно использовать, например, устройство, описанное в корейском патенте с регистрационным № 148239, US5702590, US5647994, EP 0691541, US 5336760, US5897783, US6187270, и корейской патентной заявке № 10-2008-0032904. Также предпочтительно можно использовать полностью автоматизированную систему очистки ДНК/РНК/белков ExiPrep™ 16 компании Bioneer Company в качестве приспособления для автоматизированной очистки и распределения 100 по настоящему изобретению.

Нуклеиновую кислоту, отделенную и очищенную приспособлением для автоматизированной очистки и распределения 100, распределяют в диагностический набор, состоящий из стандартизованной реакционной пробирки, ранее загруженной в него. Диагностический набор, состоящий из 8-луночной полоски пробирок, в которых нуклеиновую кислоту распределяют в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100, вынимают и запечатывают прозрачной пленкой и затем загружают в колонку, назначенную в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени. Запускают амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени и, таким образом, автоматически получают результаты.

Блок распознавания штрих-кодов (не показан) можно добавить ко множеству приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 для отделения и очистки нуклеиновых кислот от биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты. Информацию о биологическом образце, которую узнают посредством блока распознавания штрих-кодов, можно хранить в виде базы данных в контроллере, который представляет собой программное обеспечение управления системой в устройстве для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, и эту информацию также можно автоматически применить в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени 200. Штрих-код предоставляет информацию, необходимую для того, чтобы различать образцы между собой, такую как пол, возраст, тип биологического образца и т.п.

Настоящее изобретение относится к амплификатору нуклеиновых кислот в реальном времени 200 для амплификации целевых нуклеиновых кислот различных типов, полученных из множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 в реальном времени.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 по настоящему изобретению содержит многолуночный блок термоциклирования 210, в который загружают диагностические наборы, соответствующие отделенным и очищенным нуклеиновым кислотам из приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, и температуру которого меняют в соответствии с предварительно определяемыми значениями температуры, источник света для облучения светом реакционных пробирок, загруженных в блок термоциклирования, и датчик определения флуоресцентного света для получения света, образованного обнаружимыми метками внутри реакционных пробирок. Датчик определения флуоресцентного света допускает результаты качественных и количественных анализов в реальном времени в отношении целевых нуклеиновых кислот.

В качестве амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200 по настоящему изобретению, который представляет собой устройство, которое допускает ПЦР в реальном времени, можно использовать известное устройство для полимеразной цепной реакции (ПЦР) нуклеиновой кислоты в реальном времени, и предпочтительно устройство, описанное в корейском патенте № 794703, устройство, описанное в PCT/KR2008/064558, или можно выбрать и использовать блок количественного термоциклирования в реальном времени Exicycler™ 96, продукт компании Bioneer Company.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 содержит многолуночный блок термоциклирования 210. Многолуночный блок термоциклирования 210 состоит из 96 лунок 12 колонок × 8 рядов. Соответствующие лунки разделяют посредством стандартизованной колонки и тем самым назначают посредством стандартизованной колонки. Таким образом, количество амплификации соответствующих нуклеиновых кислот и информацию о мишени в соответствии с целевыми нуклеиновыми кислотами различных типов можно отображать посредством стандартизованной колонки через блок отображения 300 в реальном времени. В настоящем примере элементы определения целевых нуклеиновых кислот задают посредством стандартизованной колонки лунок, но без ограничения этим, но их можно задавать посредством стандартизованного ряда или стандартизованной лунки.

В настоящем изобретении устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени может дополнительно содержать блок хранения базы данных 400, хранящий результаты анализов.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 по настоящему изобретению хранит информацию о типах целевых нуклеиновых кислот, отделенных и очищенных посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, и о биологических образцах. Также амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 назначает множество лунок на многолуночном блоке термоциклирования 210 посредством стандартизованной колонки в соответствии с типами соответствующих целевых нуклеиновых кислот, отделенными соответствующими приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100. Одну или несколько колонок предпочтительно назначают на многолуночном блоке термоциклирования. Нуклеиновые кислоты, отделенные от биологического образца и образцов стандартов, помещают в соответствующие лунки в каждую из назначенных областей, которые задают так, чтобы иметь одинаковую определяемую мишень, и связанную информацию хранят для каждой лунки.

В настоящем изобретении «лунка 211a» обозначает каждую лунку многолуночного блока термоциклирования 210, на которую можно загрузить реакционную пробирку диагностического набора. Соответствующие определяемые мишени задают посредством стандартизованной колонки на многолуночном блоке термоциклирования амплификатора нуклеиновых кислот в соответствии с типами диагностических наборов.

Настоящее изобретение относится к управляющему программному обеспечению устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, которое управляет приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100, управляет амплификатором нуклеиновых кислот в реальном времени 200, передает информацию из устройства автоматизированной очистки и разделения в амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени, и хранит и управляет информацией амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени.

Диагностический набор, используемый в настоящем изобретении, содержит обнаружимую метку и состоит из реакционных пробирок 500, которые в одинаковых количествах содержат праймеры для амплификации конкретных целевых нуклеиновых кислот и буфер.

В настоящем изобретении, «реакционная пробирка 500» содержит контейнер для размещения образца в нем. Можно подготавливать от 1 до 96, предпочтительно 8, 12, 16 или 96 реакционных пробирок. Реакционная пробирка может представлять собой углубление или пробирку, сформированную в пластмассе или схожем веществе, и может представлять собой пробирку, образующую регулярную структуру, например, 96-луночный реакционный планшет или 384-луночный реакционный планшет с прямоугольной решеткой или 8-луночную полоску.

Реакционная пробирка 500 для диагностического набора содержит праймер для амплификации целевой нуклеиновой кислоты, обнаружимую метку и буфер, и в нее добавляют отделенную нуклеиновую кислоту. Их общий объем предпочтительно составляет от 10 до 50 мкл, но без ограничения этим. Различные праймеры и зонды в нескольких диагностических наборах амплифицируют при одинаковой температуре отжига (T₁). Каждая стандартизованная реакционная пробирка диагностического набора содержит праймер и зонд, предназначенные для амплификации различных целевых нуклеиновых кислот.

В настоящем изобретении диагностический набор получают посредством высушивания композиции, в которой смешивают конкретный праймер для амплификации конкретной части нуклеиновой кислоты, зонд, содержащий прикрепленную к нему флуоресцентную группу, ДНК полимеразу, и dNTP. В него можно добавить стабилизатор. Высушивание можно осуществлять посредством лиофилизации, термической сушки, вакуумной сушки при пониженном давлении или т.п. Следовательно, поскольку композиция диагностического набора присутствует в высушенном виде, в нее добавляют предварительно определенное количество раствора отделенной и очищенной нуклеиновой кислоты, не регулируя количество композиции, и тем самым непосредственно получают реакционную смесь для амплификации нуклеиновой кислоты.

В праймерах для определения целевых нуклеиновых кислот, которые используют в соответствующих диагностических наборах в настоящем изобретении, используют последовательности оснований, разработанные так, чтобы иметь одинаковую температуру плавления (Tm, °C) для диагностического исследования соответствующих целевых нуклеиновых кислот. Температуру плавления (Tm, °C) разрабатывают на основе части последовательности оснований целевой нуклеиновой кислоты, и важным является установить одинаковые температурные условия реакции для того, чтобы одновременно и избирательно амплифицировать различные целевые нуклеиновые кислоты на основе температуры отжига. По настоящему изобретению, несколько целевых нуклеиновых кислот можно одновременно определять в образцах от одного человека или в образцах от нескольких людей. Например, исследования для диагностики СПИД, гепатита B, гепатита C и венерических заболеваний можно осуществлять на одном амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени при одинаковых условиях амплификации за один раз.

На фиг. 2 представлен многолуночный блок термоциклирования 210, который имеет множество лунок, в которые загружают множество реакционных пробирок 500 для диагностических наборов, соответственно. В настоящем изобретении, реакционную пробирку 500 можно выполнить в виде полоски из 8 пробирок, полоски из 16 пробирок или 96-луночного планшета.

Как показано на фиг. 2, реакционные пробирки, в которые вносят нуклеиновые кислоты, отделенные и очищенные от биологических образцов одного типа, загружают в лунки 211a на назначенных колонках, и каждая реакционная пробирка, загруженная на одни и те же колонки, содержит праймер и/или зонд, предназначенные для амплификации одной и той же целевой нуклеиновой кислоты.

Как показано на фиг. 2, многолуночный блок термоциклирования 210 состоит из множества лунок 211. Реакционные пробирки 500 для диагностических наборов можно загружать в соответствующие лунки 211a. В настоящем изобретении, несколько различных реакционных пробирок для диагностических наборов можно загружать на многолуночный блок термоциклирования, и множество лунок многолуночного блока термоциклирования назначают посредством стандартизованной колонки, в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот. Множество диагностических наборов для различных целевых нуклеиновых кислот загружают на многолуночный блок термоциклирования и, таким образом, множество лунок на многолуночном блоке термоциклирования назначают соответствующим типам целевых нуклеиновых кислот посредством стандартизованной колонки соответственно целевым нуклеиновым кислотам различных типов. Однако диагностические исследования осуществляют при тех же условиях реакции амплификации.

Многолуночный блок термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению может относиться к 96-луночному (12 колонок × 8 рядов) типу. Множество лунок на многолуночном блоке термоциклирования предпочтительно задают так, чтобы назначить для определяемых мишеней одну или две смежные стандартные колонки, но без ограничения этим.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 по настоящему изобретению имеет температуру, которую повторно изменяют между первой температурой в качестве температуры отжига (Т₁) и второй температурой в качестве температуры элонгации (T₂) под управлением контроллера.

Следовательно, реакционные пробирки для диагностических наборов, загруженные в лунки 211a, имеют температуру между первой температурой в качестве температуры отжига (T₁) и второй температурой в качестве температуры элонгации (T₂) и, таким образом, амплифицируют нуклеиновые кислоты, а третья температура может быть необходима для денатурации. Первую температуру в качестве температуры отжига (T₁), вторую температуру в качестве температуры элонгации (T₂) и третью температуру многолуночного блока термоциклирования 210 можно задавать по отдельности в зависимости от типа целевой нуклеиновой кислоты.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 измеряет степени амплификации и одновременно определяет количества соответствующих целевых нуклеиновых кислот на основе информации о типах целевых нуклеиновых кислот и биологических образцах, соответствующей лункам, назначенным на многолуночном блоке термоциклирования. Целевые нуклеиновые кислоты измеряют посредством числовых значений сигналов обнаружимых меток, которые содержатся в реакционных пробирках.

Уровень сигнала, который генерирует метка, пропорционален количеству амплифицированных целевых нуклеиновых кислот. Сигнал обнаружимой метки может относиться к любому типу сигнала, включая, например, люминесцентный сигнал, сигнал цветного красителя или радиоактивный сигнал. Обнаружимый сигнал предпочтительно представляет собой люминесцентный сигнал. Люминесцентный сигнал может представлять собой флуоресцентный сигнал или хемилюминесцентный сигнал. Светом освещают после начала амплификации целевой нуклеиновой кислоты, и длительность освещения и интенсивность освещения меняют в зависимости от количества амплификации целевой нуклеиновой кислоты. Это позволяет осуществлять мониторинг количества амплификации целевой нуклеиновой кислоты.

В настоящем изобретении зонд, связанный с флуоресцентным красителем, можно использовать для определения сигналов, и можно использовать флуоресцентный краситель, такой как интеркалирующий краситель. Предпочтительно, зонд с двумя метками можно в основном использовать для амплификации нуклеиновой кислоты.

Амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 содержит контроллер. Контроллер хранит информацию о типах целевых нуклеиновых кислот, отделенных посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, и соответствующих биологических образцах, отделенных и очищенных посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, назначает множество лунок для соответствующих типов целевых нуклеиновых кислот соответственно целевым нуклеиновым кислотам различных типов, отделенным и очищенным посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, одновременно амплифицирует все целевые нуклеиновые кислоты на многолуночном блоке термоциклирования при одинаковых условиях, и измеряет и определяет соответствующие одновременно амплифицированные целевые нуклеиновые кислоты на основе информации о типах целевых нуклеиновых кислот, соответствующих назначенным колонкам, и биологических образцах, назначенных соответствующим лункам.

Всю информацию, с которой работает контроллер, вводит пользователь, и введенная информация подлежит хранению и обработке.

В этом амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени 200 количество амплификаций соответствующих целевых нуклеиновых кислот и информацию о мишени отображают посредством блока отображения 300 в реальном времени в соответствии с типами диагностических наборов для определения различных целевых нуклеиновых кислот, которые загружают на многолуночный блок термоциклирования 210 посредством стандартизованной колонки или посредством стандартизованной лунки.

На фиг. 3 представлен блок отображения 300 по настоящему изобретению. Как показано на фиг. 3, блок отображения 300 может содержать первый блок отображения 302 для отображения информации о назначенных колонках амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, второй блок отображения 301 для измерения и графического представления количества целевой нуклеиновой кислоты, амплифицированной в стандартизованной реакционной пробирке, и селектор лунок 303, который позволяет пользователю отдельно выбирать и видеть лунки 211a. Посредством выбора пользователя с помощью селектора лунок 303, диагностические результаты для одной или нескольких стандартизованных реакционных пробирок одновременно отображают различными цветами и, таким образом, различия диагностических результатов можно отображать ясным и различимым образом.

Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени в соответствии с настоящим изобретением содержит контроллер для интегрального управления приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения и амплификатором нуклеиновых кислот в реальном времени и, более конкретно, для передачи данных биологических образцов из приспособлений для автоматизированной очистки и распределения в амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени, и для качественного или количественного анализа информации о целевых нуклеиновых кислотах и результатов амплификации целевых нуклеиновых кислот различных типов, которые получают из амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени.

Интегральное устройство для анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению работает под управлением программного обеспечения контроллера, разделенного начетверо, то есть 1) ввод информации, 2) отделение и очистка нуклеиновой кислоты в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100, 3) запуск амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, и 4) обновление результатов и анализ, как показано на фиг. 6. Программное обеспечение контроллера по настоящему изобретению управляет всей работой. Программное обеспечение осуществляет работу и администрирование БД, управление приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения и их администрирование, запуск, анализ, контроль и администрирование амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени и т.п.

Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению состоит из двух компьютеров, трех приспособлений для автоматизированной очистки и распределения и одного амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени. Во-первых, программное обеспечение контроллера основано на данных, введенных пользователем в управляющее программное обеспечение устройства интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Один из двух компьютеров представляет собой компьютер для управляющего программного обеспечения устройства интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, на котором установлены локальная БД, управляющее программное обеспечение интегральной системы нуклеиновых кислот в реальном времени и программа приспособления для автоматизированной очистки и распределения. Другой компьютер предназначен для программы амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени. Соответствующие компьютеры передают и получают данные через TCP/IP. Компьютер для управляющего программного обеспечения интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени соединен с тремя приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения через TCP/IP. Компьютер для амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени соединен с амплификатором нуклеиновых кислот в реальном времени через USB. Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени состоит из среды клиент-сервер между компьютерами и среды клиент-сервер между управляющим программным обеспечением устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени и приспособлением для автоматизированной очистки и распределения.

Более конкретно, основная БД присутствует в каждом госпитале. Данные, связанные с образцами, вводят в основную БД посредством программы управления устройством интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Посредством этой работы предоставляют рабочий список на локальной БД, который используют в устройстве для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Предоставленный рабочий список назначают соответствующим приспособлениям для автоматизированной очистки и распределения с использованием штрих-кода или типа автоматизированного назначения пользователем. После завершения назначения приводят в действие приспособления для автоматизированной очистки и распределения. После завершения работы осуществляют обновление после завершения работы. Компьютер для управляющего программного обеспечения устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени проверяет обновления и тем самым выполняет обновление локальной БД. Управляющее программное обеспечение интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению может управлять несколькими инструментами очистки и распределения нуклеиновых кислот одновременно и по отдельности и управлять их рабочим состоянием.

Компьютер для управляющего программного обеспечения интегрального устройства для анализа нуклеиновых кислот в реальном времени уведомляет пользователя о том, что амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени готов. Реакционные пробирки загружают на многолуночный блок термоциклирования 96-луночного типа, после подтверждения получения уведомления пользователем. После выполнения загрузки реакционных пробирок запускают амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени. После завершения запуска компьютер для управляющего программного обеспечения интегрального устройства для анализа нуклеиновых кислот в реальном времени уведомляет пользователя о том, запущена ли программа анализа. После выполнения анализа, пользователь осуществляет завершение и окончание. Компьютер для управляющего программного обеспечения интегрального устройства для анализа нуклеиновых кислот в реальном времени проверяет, чтобы все операции и анализ были выполнены. Локальную БД обновляют после завершения проверки.

Сначала для работы устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению нужно ввести информацию о данных. Ввод информации о данных обозначает, что пользователь вводит информацию о данных в соответствии с образцом в соответствии с базой данных в программу интегрального управления компьютера для управляющего программного обеспечения интегрального устройства для анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Когда вводят информацию о данных, определяют протоколы, используемые в соответствии с диагностическими наборами. Другими словами, вводят название образца и выбирают диагностический набор, тип нуклеиновой кислоты, тип источника образца и протокол разделения. Выбирают вводимое число образцов и затем нажимают кнопку «input». В приспособлении для автоматизированной очистки и распределения лунки картриджа соответственно «назначают» посредством использования введенной информации о данных. В настоящем изобретении «автоматическое назначение» и штрих-кодовое «назначение» обозначают «назначение». «Назначение» автоматически осуществляют в том порядке, в котором нажимают на образцы, подлежащие очистке. Когда «назначение» завершают, каждое приспособление для автоматизированной очистки и распределения находится в работоспособном состоянии. Пользователь приводит в действие соответствующие блоки и приспособления для автоматизированной очистки и распределения. Программное обеспечение приспособления для автоматизированной очистки и распределения хранит всю информацию, связанную с работой. Программное обеспечение приспособления для автоматизированной очистки и распределения предоставляет пользователю информацию о прогрессе во времени, состоянии прогресса и т.п. во время работы. Время работы приспособления для автоматизированной очистки и распределения составляет приблизительно от 40 до 50 минут. Когда завершают работу приспособления для автоматизированной очистки и распределения, управляющее программное обеспечение устройства интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени осуществляет автоматизированное определение. После автоматизированного определения приводят в действие амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени, что является следующей стадией.

В настоящем примере по настоящему изобретению соответствующий компьютер для амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени определяют отдельно и, таким образом, пользователь запускает программу амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени. Рабочий список переносят из приспособления для автоматизированной очистки и распределения в амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени и тем самым автоматически предоставляют пользователю. Диагностические наборы для экспериментального использования выбирают посредством запуска программы амплификатора нуклеиновых кислот посредством управляющего программного обеспечения интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. В настоящем изобретении элементы управления автоматически назначают в зависимости от выбранного диагностического набора. Пользователь осуществляет работу в соответствии с рабочим списком, выполненным приспособлением для автоматизированной очистки и распределения нуклеиновых кислот. Множество лунок «назначают» в соответствии с порядком, в котором нажимают на образцы. Диагностические наборы загружают в соответствии с соответствующей информацией. Приводят в действие амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени. Работа амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени занимает приблизительно от 2 до 3 часов. Когда программное обеспечение амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени заканчивает работу, соответствующий файл результатов передают управляющему программному обеспечению. Когда завершают работу, автоматически распознают рабочее состояние, обновляют результаты и передают рабочий список следующему процессу, посредством управляющего программного обеспечения устройства интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Все результаты обновляют посредством осуществления обновления результатов посредством управляющей программы. Образцы, подлежащие обновлению, выбирают в соответствии с лунками из множества лунок. Обновление не осуществляют в отношении отказов образцов, которые возвращают на соответствующий процесс, такой как процесс разделения или процесс амплификации. Отображают окно «Analysis» для представления всех текущих анализов, что позволяет пользователю анализировать состояние амплификации.

Контроллер устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению автоматически соединяет пять программ, а именно «рабочий список», локальная база данных, управляющее программное обеспечение устройства интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, программное обеспечение устройства автоматизированной очистки и разделения, эксплуатационное программное обеспечение амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени и программное обеспечение для анализа амплификации нуклеиновых кислот в реальном времени и, таким образом, обеспечивает последовательность автоматизированных процессов. Связанное с экраном назначение обеспечивают в момент «назначения» для того, чтобы предотвратить ошибки человека, и все данные являются прослеживаемыми. Файлы системного журнала создают во время работы всех блоков и инструментов.

Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению может дополнительно содержать блок хранения базы данных 400, который хранит результаты анализов для стандартизованных реакционных пробирок из соответствующих диагностических наборов.

ПРИМЕР 2

Пример 2 направлен на способ определения целевой нуклеиновой кислоты с использованием устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению, и далее в настоящем документе это описано подробно.

Настоящее изобретение включает способ определения целевой нуклеиновый кислоты с использованием устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, где способ включает:

1) разделение и очистку нуклеиновых кислот, которые содержатся в соответствующих образцах из различных биологических образцов, которые содержат образцы стандартов и нуклеиновые кислоты, посредством множества приспособлений для автоматизированного разделения и очистки 100, и затем внесение таким образом отделенного и очищенного раствора в реакционную пробирку с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот;

2) назначение множества лунок на многолуночном блоке термоциклирования 210 посредством стандартизованной колонки в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот так, что многолуночный блок термоциклирования 210, на который загружают реакционные пробирки с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот, и соответствующие целевые нуклеиновые кислоты, отделенные и очищенные посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, соответствуют друг другу, и хранение информации об образцах стандартов и биологических образцах, отделенных приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100 соответственно соответствующим лункам, назначенным посредством стандартизованной колонки;

3) загрузку реакционных пробирок, полученных на стадии 1) в соответствующие лунки в соответствии с хранимой информацией о биологических образцах в соответствующие лунки многолуночного блока термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени; и

4) одновременную амплификацию соответствующих целевых нуклеиновых кислот, загруженных на блок термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени при одинаковых условиях, и осуществление качественного анализа или количественного анализа соответствующих целевых нуклеиновых кислот для множества биологических образцов и тем самым получение результатов амплификации.

В настоящем изобретении стадию 2) и стадию 3) можно осуществлять одновременно, или стадию 3) можно осуществлять перед стадией 2).

В настоящем изобретении нуклеиновые кислоты, очищенные и распределенные приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100, могут представлять собой различные нуклеиновые кислоты, или при отделении нуклеиновых кислот на стадии 1) можно использовать биологические образцы нескольких типов.

В настоящем изобретении в биологический образец добавляют внутренний положительный контроль (ВПК) с последующим отделением нуклеиновой кислоты в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100 и определяют эффективность определения целевой нуклеиновой кислоты, успешно ли целевую нуклеиновую кислоту отделили в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100, и эффективность амплификации, посредством определения по результатам амплификации.

В настоящем изобретении на стадии 1) реакционную пробирку с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот получают посредством внесения раствора отделенной и очищенной нуклеиновой кислоты в реакционную пробирку, которая в сухом виде содержит компоненты, необходимые для амплификации нуклеиновой кислоты, и смешивания раствора с компонентами.

Поскольку диагностический набор по настоящему изобретению выполнен из сухой композиции, к нему добавляют раствор отделенной и очищенной нуклеиновой кислоты и тем самым непосредственно получают смесь. Когда отделенный раствор нуклеиновой кислоты добавляют в диагностический набор в растворенном состоянии, реакционный объем увеличивается, и концентрация отделенной нуклеиновой кислоты снижается.

В настоящем изобретении, когда целевой нуклеиновой кислотой является РНК, внутренний положительный контроль представляет собой частицу вируса табачной мозаики.

В настоящем изобретении, когда целевой нуклеиновой кислотой является ДНК, внутренний положительный контроль представляет собой плазмидную ДНК или продукт ПЦР. Продукт ПЦР амплификации обозначает ДНК, полученную посредством ПЦР амплификации.

На стадии 1) внутренний положительный контроль может дополнительно содержать образцы количественных стандартов, которые добавляют в соответствии с известными концентрациями.

На стадии 1) отрицательный контроль (ОК) и положительный контроль (ПК) можно дополнительно использовать в качестве образцов стандартов.

В качестве праймера и зонда для амплификации внутреннего положительного контроля можно использовать последовательности, представленные ниже в таблице 1.

В настоящем изобретении внутренний контроль (или внутренний положительный контроль, ВПК) вносят со стадии отделения и очистки нуклеиновой кислоты, а амплификацию осуществляют в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени после отделения нуклеиновой кислоты от образца. Это используют для решения проблемы, которая заключается в том, что трудно подтвердить, заключается ли причина недостаточной амплификации нуклеиновой кислоты лежит в процедуре очистки или в процедуре амплификации. В настоящем изобретении внутренний положительный контроль (ВПК), который имеет известную концентрацию, добавляют к образцу из процедуры отделения, и отделяют и очищают вместе с нуклеиновой кислотой и, таким образом, можно подтвердить, правильно ли осуществили в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения нуклеиновых кислот или нет, а также можно легко увидеть, заключается ли причина недостаточной амплификации нуклеиновой кислоты во время процедуры амплификации после отделения в стадии отделения или в стадии амплификации. В настоящем изобретении вирус табачной мозаики используют в качестве внутреннего положительного контроля (ВПК). Вирус табачной мозаики (TMV), который представляет собой РНК вирус, можно должным образом использовать в качестве внутреннего положительного контроля (ВПК), когда РНК вирус, такой как подтип H1N1 вируса гриппа А, является мишенью для определения.

Использование вируса табачной мозаики (TMV) имеет следующие преимущества. В известном уровне техники внутренний положительный контроль (ВПК) не используют вместе с нуклеиновой кислотой, когда нуклеиновую кислоту нужно отделить от образца, и конкретный тип РНК добавляют к отделенному образцу нуклеиновой кислоты только в момент реакции амплификации нуклеиновых кислот. Однако в настоящем изобретении сами частицы вируса подвергают отделению, очистке и амплификации вместе с нуклеиновой кислотой со стадии отделения образца для реакции амплификации нуклеиновых кислот в реальном времени и, таким образом, их можно использовать при анализе эффективности. Вирус табачной мозаики (TMV), который является вирусом растений, допускает массовую очистку и не сопровождается риском при работе с ним. Поскольку вирус человека и вирус растения имеют различные реагирующие «рецепторы», человек не может быть инфицирован вирусом растения. Также, поскольку вирус растения имеет далекое родство с вирусом человека, их последовательность оснований имеет небольшое совпадение с последовательностью оснований целевой нуклеиновой кислоты человека во время получения праймера и зонда или во время реакции амплификации нуклеиновых кислот.

В настоящем изобретении диагностический набор состоит из внутреннего положительного контроля (ВПК), праймера, соответствующего амплифицированной целевой нуклеиновой кислоте, обнаружимой метки для определения целевой нуклеиновой кислоты и буфера, которые предоставлены в том же количестве в стандартизованной реакционной пробирке. В качестве стандартизованной реакционной пробирки можно использовать 8-луночную полоску. Также реактивы для амплификации нуклеиновых кислот в стандартизованной реакционной пробирке отличаются тем, что они получены в сухом виде.

В настоящем изобретении результат амплификации, из которого внутренний положительный контроль (ВПК) добавляют в биологический образец для отделения и идентификации нуклеиновой кислоты в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени 200, можно подтвердить по отделению или неотделению нуклеиновой кислоты, полученной из приспособления для автоматизированной очистки и распределения 100, и процедуре амплификации осуществления одновременной амплификации при тех же условиях, с использованием амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200.

Устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению может одновременно амплифицировать нуклеиновые кислоты, отделенные от множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения, за один раз посредством амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200.

Также настоящее изобретение дополнительно содержит сбор информации о целевых нуклеиновых кислотах, подлежащих определению, из соответствующих одновременно амплифицированных нуклеиновых кислот.

Например, нуклеиновые кислоты может отделять от крови, мочи, мокроты, клеток и т.п. посредством различных процедур, но нуклеиновые кислоты, отделенные от них, можно одновременно амплифицировать в одном амплификаторе. В настоящем изобретении нуклеиновые кислоты отделяют посредством нескольких приспособлений для автоматизированной очистки и распределения. Нуклеиновые кислоты соответственно отделяют от образцов крови, мочи, мокроты посредством трех приспособлений для автоматизированной очистки и распределения. Отделенные нуклеиновые кислоты можно применять при одновременном определении СПИД, гепатита B, гепатита C, малярии, туберкулеза и венерических заболеваний, используя соответствующие диагностические наборы.

Для того чтобы одновременно определить причины этих заболеваний посредством амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени, множество лунок на многолуночном блоке термоциклирования можно разделить посредством стандартизованной колонки и тем самым назначить конкретную лунку для определения. Например, колонки многолуночного блока термоциклирования назначают так, что первую колонку назначают для СПИД, вторую колонку для гепатита В, третью колонку для гепатита C, а четвертую колонку для венерического заболевания, и затем одинаковым образом задают условия их амплификации. Затем диагностические наборы, содержащие отделенные нуклеиновые кислоты, соответственно загружают на назначенные лунки на многолуночном блоке термоциклирования и затем осуществляют реакцию амплификации. Для того чтобы одинаковым образом задать условия реакции амплификации, значения Tm условий реакции соответствующих диагностических наборов задают сходно или одинаковым образом. Одновременную амплификацию осуществляют в 96-луночном амплификаторе нуклеиновых кислот при тех же условиях реакции ПЦР, при которых праймер или зонд настроены иметь одинаковые значения Tm. Как результат, можно усовершенствовать удобство, а время определения можно укоротить. Главное, можно уменьшить ошибку отсчета времени, которая вызвана последовательным определением одной за другой мишеней нескольких типов. Также процедуру идентификации можно осуществить легко, поскольку множество целевых ДНК или РНК одновременно определяют при тех же условиях посредством амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени вместо определения только одного типа целевого патогена в один момент времени. По существу, несколько патогенов можно одновременно идентифицировать за короткое время посредством отделения нуклеиновых кислот от образцов нескольких типов, полученных от одного человека, или от образцов, полученных от нескольких человек, и одновременно определять различные целевые нуклеиновые кислоты из них за один раз. В настоящем изобретении тестируемые элементы конкретного патогена назначают посредством стандартизованной колонки многолуночного блока термоциклирования.

Процедура отделения и очистки нуклеиновых кислот от биологических образцов с использованием множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 по настоящему изобретению представляет собой следующее. В настоящем образцовом варианте осуществления, полностью автоматизированный инструмент выделения нуклеиновой кислоты ExiPrep™ компании Bioneer Company адаптировали и использовали в качестве автоматизированных инструментов очистки нуклеиновой кислоты, а набор для выделения ExiPrep™ компании Bioneer Company модифицировали и использовали в качестве набора для очистки нуклеиновой кислоты.

В настоящем изобретении набор для очистки нуклеиновой кислоты приспособления для автоматизированной очистки и распределения состоит из комплекта картриджей, который содержит буферы, используемые при выделении нуклеиновых кислот из различных биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты, и пластмассовый расходуемый комплект, используемый при очистке. Комплект картриджей состоит из картриджа I и картриджа II. Картридж I содержит протеазу для внутриклеточного протеолиза, лизирующий раствор для лизиса клеток, магнитные частицы диоксида кремния для связывания элюированной нуклеиновой кислоты и связывающий раствор для связывания элюированной нуклеиновой кислоты и магнитных частиц диоксида кремния. Картридж II содержит по меньшей мере один тип отмывающего раствора для отмывания веществ, за исключением нуклеиновой кислоты, связанных с поверхностями магнитных частиц диоксида кремния, и элюирующий раствор для эффективного отделения нуклеиновых кислот от поверхностей магнитных частиц диоксида кремния. Пластмассовый расходуемый комплект состоит из одноразового наконечника фильтра, используемого для транспортировки и переноса буферов различных типов, реакционную пробирку, используемую при процедуре лизиса клеток посредством протеазы, и элюционную пробирку для хранения конечной очищенной нуклеиновой кислоты.

Картридж из набора для очистки нуклеиновой кислоты представляет собой многолуночный картридж, и предпочтительно можно использовать 96-луночный картридж. Набор для вирусной ДНК/РНК ExiPrep™ компании Bioneer Company можно выбрать и использовать в качестве набора для очистки нуклеиновой кислоты для отделения РНК нового вируса гриппа A (H1N1). Процедура выделения вирусной РНК состоит из процедуры предварительной обработки образца, процедуры добавления положительного контроля, отрицательного контроля, внутреннего положительного контроля (ВПК) и образца, и процедуры выделения нуклеиновой кислоты с использованием приспособления для автоматизированной очистки и распределения. Поскольку выделенную нуклеиновую кислоту автоматически смешивают с диагностическим набором для ОТ-ПЦР в реальном времени, вирусную РНК нужно вносить вручную в диагностический набор, после выделения нуклеиновой кислоты.

В качестве конкретного примера, процедура очистки вирусной рибонуклеиновой кислоты из нового вируса гриппа A с использованием приспособления для автоматизированной очистки и распределения и набора для очистки нуклеиновой кислоты устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени представляет собой следующее.

Образец отбирают из ротовой полости и носоглоточной полости, используя ватную палочку. Пробирку для хранения образца, которая содержит среду для транспортировки вируса (VTm), энергично встряхивают в течение 1 минуты, используя мешалку вортекс, и тем самым позволяют эффективно перенести вирус с ватной палочки в среду для транспортировки вируса, перед тем как использовать образец в очистке нуклеиновой кислоты. Раствор (PBS, изотонический раствор хлорида натрия, среда для транспортировки или т.п.) хорошо перемешивают в течение 1 минуты или более с использованием мешалки вортекс с тем, чтобы можно было перенести вирус с ватной палочки в раствор. 1 мл смешанного раствора образца переносят в 1,5 мл тестовую пробирку с последующим разделением центрифугированием на скорости 13000 об/мин в течение от 5 до 10 секунд. Берут 200 мкл супернатанта для использования при выделении вирусной РНК.

Приспособление для автоматизированной очистки и распределения включают и, таким образом, инициализируют. Управляющее программное обеспечение устройства интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени в основном разделено надвое, а именно на часть, управляющую приспособлением для автоматизированной очистки и распределения нуклеиновых кислот, и на часть, управляющую амплификатором нуклеиновых кислот в реальном времени. Для того чтобы выделить РНК вируса, диагностический набор, используемый в исследовании, выбирают посредством нажатия на изображение приспособления для автоматизированной очистки и распределения, которое расположено в левой части основного экрана программного обеспечения. Когда нажимают на поле ввода диагностического набора и выбирают диагностический набор для определения нового вируса гриппа, происходит автоматический выбор типа выделяемой нуклеиновой кислоты.

Тип образца в соответствии с типом образца пациента вводят в окно ввода «тип источника образца». Когда вводят тип образца, происходит автоматическое отображение всплывающего окна с запросом о состоянии картриджа. Подтверждают, присутствуют ли использованные лунки, с учетом буферного картриджа I, и когда использованные лунки присутствуют, использованные лунки маркируют посредством нажатия с тем, чтобы их более не использовать. Остальные лунки картриджа I автоматически маркируют для отрицательного контроля и положительного контроля. В качестве основы задают один ОК и один ПК, и два NTP и два ПК можно задать сменно. Если существует список для повторного исследования, то список для повторного тестирования отображают на этой стадии, и если выбирают несколько кнопок для образца для повторного тестирования, лунки последовательно «назначают». Нажимают на поле «название образца» и вводят в него информацию об образце, используя считыватель штрих-кодов или клавиатуру. Для того чтобы применить введенную информацию к устройству для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, нажимают кнопку «применить».

В каждую лунку вносят по 20 мкл внутреннего положительного контроля (ВПК) на первой колонке и второй колонке картриджа I набора для очистки нуклеиновой кислоты, на рабочем планшете. 200 мкл положительного контроля (ПК) вносят в лунку в месте для положительного контроля (ПК), то есть в место A-1 картриджа I, и 200 мкл третичной дистиллированной воды (отрицательный контроль, ОК), обработанной с использованием DEPC, вносят в лунку в месте B-1 картриджа I, в соответствии с содержимым, вводимым в устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. 200 мкл образца пациента вносят в каждую другую лунку в местах с C-1 до H-1 и с A-2 до H-2. Здесь образцы нуклеиновых кислот, конечно, нужно вносить в картридж в соответствии с местами, введенными из устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Одноразовые наконечники фильтра и стандартизованные реакционные пробирки загружают на стойки в соответствующих приспособлениях для автоматизированной очистки и распределения в соответствии с местами лунок картриджа, которые содержат вещество стандарта, третичную дистиллированную воду, обработанную с использованием DEPC, и образцы пациентов, соответственно.

Также на охлаждающий блок загружают элюционную пробирку и диагностический набор для диагностического исследования нового вируса гриппа, которые содержат очищенные нуклеиновые кислоты. Подготовленный комплект картриджей и пластмассовый расходуемый комплект загружают в каждое приспособление для автоматизированной очистки и разделения. Затем нажимают кнопку «run» в управляющем программном обеспечении устройства интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени для того, чтобы привести в действие приспособления для автоматизированной очистки и распределения, тем самым очищая РНК нового вируса гриппа из образцов от пациентов. Когда завершают очистку нуклеиновой кислоты, элюционную пробирку для хранения нуклеиновой кислоты и диагностический набор для диагностического исследования вынимают из охлаждающего блока. Элюционную пробирку для хранения нуклеиновой кислоты закрывают, используя предоставленную крышку пробирки, и затем хранят при температуре -80°C. В отношении диагностического набора, верхний конец полоски пробирок запечатывают, используя оптически клейкую оптическую пленку, и затем переносят в амплификатор нуклеиновых кислот. Затем в диагностическом наборе осуществляют ОТ-ПЦР в реальном времени. Когда завершают выделение, каждая элюционная пробирка и реакционная пробирка для диагностического набора в инструменте очистки и распределения нуклеиновых кислот содержит 50 мкл раствора выделенной нуклеиновой кислоты.

В настоящем образцовом варианте осуществления настоящего изобретения блок количественного термоциклирования в реальном времени Exicycler™ 96 выбирали и использовали в качестве амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени, а набор AccuPowerDiagnostics компании Bioneer Company выбирали и использовали в качестве диагностического набора.

Результаты амплификации в амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени получают посредством следующей процедуры. Сначала нажимают на изображение амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени в устройстве для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени. Списки образцов, выделение которых выполнено, хранят в соответствии с наборами в управляющем программном обеспечении. соответствующий список выбирают, нажимая на кнопку «Get Sample List».

Здесь отображают всплывающее окно для определения того, в какое место в многолуночном блоке термоциклирования помещают выбранный диагностический набор. Образцам назначают множество лунок посредством выбора независимых переключателей в списке образцов в соответствии с полосками реакционной пробирки. Когда выбирают каждую лунку, определяют место каждого диагностического набора. Здесь выбирают желаемые места диагностических наборов, в то время как на экране отображают многолуночное изображение.

Принимая во внимание число полосок пробирок диагностического набора, число колонок и число рядов выбирают для того, чтобы определить, куда загружать полоски пробирок в блок термоциклирования. Например, если диагностический набор, в который распределяют нуклеиновые кислоты, представляет собой 8-луночную полоску, диагностический набор размещают в центре многолуночного блока термоциклирования амплификатора нуклеиновых кислот, нажимая на кнопку для соответствующего места среди 96 лунок. Когда завершают выбор, отображают поле, в которое вводят идентификатор данных. Когда вводят желаемый идентификатор и нажимают кнопку, генерируют рабочий список нуклеиновых кислот, подлежащих амплификации.

Диагностические наборы загружают на многолуночный блок термоциклирования амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени в соответствии с «назначенными» местами, и затем запускают программное обеспечение амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени. Когда завершают работу амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени, данные результатов передают управляющему программному обеспечению. В устройстве для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени кнопку «update result» выбирают нажатием кнопки «tap» в части меню управляющего программного обеспечения контроллера и, таким образом, переносят результаты ПЦР. Результаты переносят посредством выбора кнопки «work list», который генерируется в левой верхней части вновь открытого окна. Значения результатов подтверждают в файле формата Excel в том порядке, в котором назначают диагностические наборы. Графики результатов в соответствии с соответствующими образцами можно анализировать с использованием программы анализа, связанной с ними. В отношении образцов, результаты которых подтверждают, обновление результатов осуществляют в управляющей программе. В ином случае выбирают повторное исследование со стадии амплификации или повторное исследование со стадии очистки и, таким образом, создают список повторных исследований.

Более конкретно, соответствующие стойки реакционных пробирок, стойку одноразовых наконечников, стойку элюционных пробирок и буферный картридж I загружают на планшет приспособления для автоматизированной очистки и распределения, подготовленный в боксе биологической безопасности (БББ). Реакционные пробирки, одноразовые наконечники фильтра, элюционные пробирки и диагностические наборы помещают в соответствующие стойки в соответствии с числом образцов. Отверстия формируют в герметизирующих пленках буферного картриджа I и буферного картриджа II, используя предоставленный перфоратор в соответствии с числом образцов и числом положительных контролей (ПК) и отрицательных контролей (ОК), которые используют в качестве образцов стандартов. Как показано на фиг. 5, 20 мкл растительного внутреннего положительного контроля (ВПК) вносят в каждую лунку в соответствии с местами, в которые вводят образцы, положительные контроли (ПК) и отрицательные контроли (ОК). 200 мкл дистиллированной воды, обработанной с использованием DEPC, вносят в каждую лунку для отрицательного контроля (ОК). 200 мкл положительного контроля (ПК) добавляют в каждую лунку для положительного контроля (ПК). 200 мкл полученных выше образцов пациента вносят в каждую лунку картриджа. После того, когда лунки закрывают прозрачными акриловыми крышками, картриджи помещают в приспособление для автоматизированной очистки и распределения.

Приспособление для автоматизированной очистки и распределения приводят в действие, чтобы программа провела исследование нового вируса гриппа. После подтверждения используемого инструмента маркируют лунки, которые соответственно содержат положительный контроль (ПК) и отрицательный контроль (ОК). В отношении лунок для образцов, за исключением лунок для положительного контроля (ПК) и лунок для отрицательного контроля (ОК), информацию о пациенте (пол, возраст, откуда взят образец и т.п.) для образцов пациентов вводят посредством считывателя штрих-кодов или вручную. Чтобы начать выделение вирусной РНК, нажимают кнопку «run».

После завершения выделения вирусной РНК, когда открыта «door» и вытянут «base plate», можно видеть стойку элюционных пробирок, на которую загружают элюционные пробирки и диагностический набор.

В каждой элюционной пробирке и диагностическом наборе присутствует по 50 мкл выделенной вирусной РНК. Следовательно, нет необходимости дополнительно добавлять РНК или дистиллированную воду, обработанную с использованием DEPC. Диагностический набор, необходимый для исследования нового вируса гриппа, можно получить из стойки элюционных пробирок и непосредственно применить ОТ-ПЦР в реальном времени, используя амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени. Вирусную РНК, содержащуюся в элюционной пробирке, используют в момент повторного исследования. Выделенную вирусную РНК хранят при температуре -80°C до использования, если возможно. Стойку элюционных пробирок хранят при температуре 4°C для того, чтобы хранить выделенную нуклеиновую кислоту.

Реактив для анализа амплификации нуклеиновых кислот, который содержится в диагностическом наборе, используемом в настоящем изобретении, содержит аналитический реактив, содержащий все компоненты, необходимые для амплификации целевой нуклеиновой кислоты. Аналитический реактив представлен в готовом для использования виде для того, чтобы в реальном времени определять целевую ДНК или РНК в образце качественно или количественно, используя амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени.

Аналитический реактив в диагностическом наборе, используемом в настоящем изобретении, содержит буфер для реакции, MgCl₂, dNTP четырех типов, полимеразу, праймер и метку для определения, которые необходимы для амплификации нуклеиновой кислоты, и стабилизатор по выбору. Аналитический реактив получают в сухом состоянии. Метка для определения отличается тем, что она представляет собой флуоресцентный краситель или зонд, меченый флуоресцентный краситель. Кроме того, по настоящему изобретению, композицию для аналитического реактива предпочтительно высушивают посредством лиофилизации, вакуумной сушки, термической сушки, сушки при пониженном давлении или т.п.

В качестве диагностического набора, используемого в настоящем изобретении, можно выбрать и использовать, например, набор для ПЦР AccuPower компании Bioneer Company. Праймер, флуорогенный зонд с двумя метками, ДНК полимераза, dNTP и стабилизатор для амплификации конкретной части генома нового вируса гриппа A (H1N1) и вируса гриппа A входят в состав New Inf A(H1N1) и Inf A Premix компании Bioneer Company. Продукт амплификации подтверждают посредством измерения флуоресценции, связанной с конкретным зондом во время термоциклирования. Амплификацию в соответствии с термоциклированием продукта ПЦР измеряют в реальном времени посредством измерения репортерного красителя, отнятого от зонда. Также диагностический набор содержит положительные контроли New Inf A H1N1 и Inf A для качественного анализа образцов.

В случае, когда на стадии амплификации используют аналитический реактив для амплификации нуклеиновых кислот, отделенную нуклеиновую кислоту помещают в полоску пробирок, которая содержит аналитический реактив. Здесь в пробирку добавляют РНК реактив положительного контроля и РНК реактив внутреннего положительного контроля (ВПК) New Inf A H1N1 и Inf A. Раствор смеси получают посредством смешивания дистиллированной воды, обработанной с использованием DEPC, и внутренним положительным контролем (ВПК) РНК в вычисленном количестве, и 45 мкл раствора смеси распределяют в каждую лунку полоски.

Полоску, по которой выполняют распределение всех реактивов и РНК, закрывают крышкой или герметизируют герметизирующей пленкой, тем самым полностью перемешивая содержимое в растворе смеси. Здесь после смешивания процедуру вращения предпочтительно осуществляют посредством использования Exispin™ (номер по каталогу A-7040, Bioneer Co., KOREA). Затем полоску загружают на многолуночный блок термоциклирования амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени (блок количественного термоциклирования в реальном времени Exicycler™ 96, Bioneer Company) и затем запускают амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени.

Включают основной переключатель питания, который расположен на нижней части задней поверхности амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени (Exicycler™ 96). Когда 96-луночный многолуночный блок термоциклирования перемещают в переднюю часть устройства, ПЦР полоски или планшеты вводят в соответствии с направлением лунок многолуночного блока термоциклирования. Когда кнопку «door» нажимают снова, 96-луночный многолуночный блок термоциклирования (температурный блок) перемещают внутрь. Запускают рабочую программу (пиктограмма «Run ExiDiagnosis») Exicycler™ 96. Для того чтобы запустить рабочий способ, необходимый для реакции ПЦР, в верхней части нажимают кнопку «File-Design Experiment».

Затем, когда отображают окно «Select Diagnostics Kit», выбирают кнопку «New Inf A & Inf A Real-time PCR Kit». Когда завершают выбор «Select Diagnostics Kit», выбирают и открывают файл в формате Excel, в который вводят информацию о положении полоски в 96-луночном многолуночном блоке термоциклирования.

Когда полностью завершают выбор, подтверждают экранное окно информации о протоколе и планшете, в котором можно отображать условия реакции ПЦР, подходящие для наборов, и информацию о выбранном положении.

Когда нажимают кнопку «Run tap», отображают новое окно, в которое можно ввести имя файла для хранения результатов. Когда вводят информацию о дате эксперимента и образце и нажимают кнопку «Ok», начинают ПЦР. Результаты можно подтвердить из программы анализа, используя введенное имя файла.

Результаты амплификации в отношении амплификации нуклеиновой кислоты анализируют, используя программу анализа Exicycler™ 96. Для анализа выбирают «PCR data file (.ехе3)». Специализированный анализ возможен посредством «Baseline subtraction (manual manner)» на экране «Flu. Graph» результата амплификации, а основные результаты анализов, предоставленные программой анализа, можно подтвердить, используя кнопку «auto scale». В случае отрицательного контроля (ОК), РНК New Inf A и Inf A не добавляют. Следовательно, значения флуоресценции FAM и техасского красного не измеряют. В случае внутреннего положительного контроля (ВПК) РНК, значения флуоресценции TAMRA нужно измерять во всех лунках.

Когда осуществляют ПЦР, предварительно определяемые лунки назначают среди лунок, и, например, A1 и B1 назначают для отрицательных контролей (ОК), а C1 и D1 назначают для положительных контролей (ПК). Положительный контроль и отрицательный контроль используют в качестве образцов стандартов. Если два контроля не соответствуют эталону, программа анализа может генерировать сообщение об ошибке. В настоящем изобретении программное обеспечение выполняет «авто» анализ во время диагностического анализа. Автоматически анализируют результаты и отображают проанализированные результаты.

ПРИМЕР 3

Пример 3 направлен на одновременное определение внутренних положительных контролей и нескольких образцов, которые используют при отделении и очистке нуклеиновых кислот, в способе определения целевой нуклеиновой кислоты с использованием устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению.

(1) Строение и применение праймера и зонда растительного внутреннего положительного контроля

В отношении растительного внутреннего положительного контроля (ВПК), последовательность оснований выбирали из последовательности оснований между основаниями № 4903 и № 5709 (ген двигательного белка, MP), и из последовательности оснований между основаниями № 5712 и № 6191 (ген белка оболочки, CP) геномной РНК (GeneBank. номер доступа NC001367) вируса табачной мозаики (TMV) так, что они имеют длину от 18 до 28 п. о. и значение Tm от 55°C до 62°C и, таким образом, выбранную последовательность оснований использовали в качестве прямого праймера и обратного праймера.

Кроме того, любую последовательность оснований выбирали из последовательностей оснований так, что она имела длину от 19 до 30 п. о. и значение Tm от 67°C до 72°C, и выбранную последовательность оснований использовали в качестве зонда [таблица 1]. Значения Tm проверяли посредством использования программы Primer3 Plus.

Процедуру поиска соответствующих комбинаций праймеров осуществляли посредством комбинации праймеров вируса табачной мозаики (TMV) в соответствии с выбранным и использования реактива для определения нуклеиновой кислоты SYBR Green и блока количественного термоциклирования Exicycler™ (Bioneer Company, Korea) в качестве количественного амплификатора в реальном времени.

Добавляли шесть комбинированных комплектов праймеров вируса табачной мозаики (TMV), реактив для окрашивания нуклеиновой кислоты, дистиллированную воду (ДВ) и матрицу вируса табачной мозаики, а затем проводили ОТ-ПЦР в реальном времени. Проводили 45 циклов при температуре 95°C в течение 10 минут для денатурации, 95°C в течение 20 секунд и 55°C в течение 30 секунд. Когда осуществляли соответствующие циклы ПЦР, амплифицированные флуоресцентные значения последовательно измеряли один раз каждый цикл после реакции при 55°C в течение 30 секунд каждый цикл.

Как результат, комплекты праймеров 1, 2 и 3 (комплекты MP 1, 2 и 3) показали более высокую скорость ПЦР, чем комплекты праймеров 4, 5 и 6 (комплекты CP 1, 2 и 3), и, таким образом, выбрали комплекты MP 1, 2 и 3.

В последующем эксперименте процедуру выбора подходящего комплекта зондов дополнительно осуществляли, используя зонд, который определяет нуклеиновую кислоту со специфичной последовательностью вместо неспецифичного реактива для окрашивания нуклеиновой кислоты. Туда добавляли 10× буфера 5 мкл, MMLV 600 Ед, Taq 7,5 Ед, dNTP 20 мМ 3 мкл, стабилизатор, праймер с оптимизированной концентрацией (15p), зонд и т.п. и вирус табачной мозаики (TMV) РНК, выделенный из пораженных листьев, достигая общего объема 50 мкл в одной пробирке, и осуществляли ОТ-ПЦР в реальном времени. Это полученное вещество подвергали ОТ-ПЦР при температуре 45°C в течение 15 минут, с последующими 45 циклами при температуре 95°C в течение 10 минут для денатурации, 95°C в течение 20 секунд и 55°C в течение 30 секунд.

Среди комплектов праймеров и зондов вирус табачной мозаики 1, 2 и 3, комплект зондов 1 (MP 1) имел наилучшую эффективность амплификации ПЦР, а комплект зондов 3 (MP 3) и комплект зондов 2 (MP 2) следовали за комплектом зондов 1 (MP 1) в этом порядке.

Эксперимент по ОТ-ПЦР в реальном времени с применением стандартной матрицы осуществляли посредством использования комплектов зондов 1 и 3 из комплектов зондов, используя РНК вируса табачной мозаики (TMV) в качестве РНК внутреннего положительного контроля в растворе смеси для ОТ-ПЦР, которая имеет указанный выше состав, и добавления РНК нового вируса гриппа в качестве матрицы. Результаты эксперимента подтверждают, что даже хотя комплекты зондов 1 (MP 1) и 3 (MP 3) достигали 1×10⁶ копий РНК внутреннего положительного контроля, отсутствовало значительное влияние на амплификацию РНК матрицу нового вируса гриппа, а амплификация внутренних положительных контролей хорошо протекала независимым образом.

(2) Получение растительного внутреннего положительного контроля, его применение во время процедуры выделения нуклеиновой кислоты и применение ОТ-ПЦР в реальном времени

Для того чтобы получить растительный внутренний положительный контроль, который можно использовать с биологическими образцами, сначала выращивают вирус табачной мозаики. Сеяли от 100 до 200 семян табака Nicotiana tabaccum cv. Samsun (которые доступны в лаборатории вирусов растений в Rural Development Administration) и через 10 суток появлялись ростки. Еще через 10 суток каждый объект пересаживали в маленький цветочный горшок и затем растили далее в течение 10 суток. Пораженные вирусом табачной мозаики листья (доступны в лаборатории вирусов растений в Rural Development Administration) помещали в ступку и растирали с 0,01 M фосфатным буфером (pH 7,2), тем самым получая сок. Полученный сок наносили на листья табака, которые обрызгивали карборундом и, таким образом, инокуляцию TMV проводили посредством повреждения листьев.

Через 10 суток после инокуляции на листьях табака наблюдали мозаичные пятна, деформацию листьев и т.п. Эффективность репродукции вируса табачной мозаики повышали посредством дальнейшего выращивания листьев табака в течение приблизительно 20 суток. Затем 30 г пораженных TMV листьев собирали и осуществляли эксперименты по очистке вирусных частиц.

Конкретно, 30 г пораженных вирусов табачной мозаики (TMV) листьев, 90 мл 0,1M фосфатного буфера (pH 7,2) и 0,6 мл β-меркаптоэтанола помещали в миксер с последующим измельчением листьев и фильтрованием через сетку, а затем туда добавляли 12 мл н-бутанола с последующим перемешиванием в течение 1 часа 30 минут при температуре 4°C. Полученную смесь подвергали разделению центрифугированием на скорости 8000 об/мин при температуре 4°С в течение 20 минут, затем собирали только супернатант, а затем фильтровали через волокнистую ткань Mira. Туда добавляли ПЭГ, составляющий 8% от объема супернатанта, и 0,1M NaCl, с последующим перемешиванием в течение 3 часов (поддерживали температуру 4°С).

Таким образом, полученную смесь подвергали разделению центрифугированием на скорости 10000 об/мин при температуре 4°С в течение 20 минут, а затем супернатант удаляли, а осадок тщательно растворяли в 7,5 мл 0,1M фосфатного буфера. Полученное вещество снова подвергали разделению центрифугированием на скорости 10000 об/мин при температуре 4°С в течение 20 минут, а затем брали супернатант и подвергали его разделению центрифугированием на скорости 28000 об/мин при температуре 4°С в течение 2 часов 30 минут. После удаления супернатанта оставшийся осадок растворяли в дистиллированной воде, в которую добавляли 300 мкл DEPC, тем самым выделяя частицы вируса табачной мозаики (TMV). Выделенные частицы подтверждали посредством SDS-PAGE и электронно-микроскопических изображений. Концентрацию вируса определяли количественно посредством измерения поглощения (260 нм) на УФ-спектрометре (продукт Shimazu Company, Japan) и используя следующее уравнение.

[поглощение при 260 нм/3,09 (коэффициент поглощения TMV)] × коэффициент разведения

На основе результата уравнения концентрации число копий РНК вычисляли по следующему уравнению.

6,02 × 10²³ × концентрация (концентрация, измеренная УФ-спектрометром, мг/мл)/6395 (размер генома вируса табачной мозаики, п. о.) × 330

Эксперимент по выбору оптимальной концентраций осуществляли для того, чтобы применять частицы вируса табачной мозаики, выделенные в указанном выше эксперименте на стадии очистки, которая представляет собой стадию выделения РНК. Сначала 200 мкл раствора для разведения частиц вируса табачной мозаики использовали для того, чтобы выделить 50 мкл посредством инструмента отделения и очистки нуклеиновой кислоты (ExiPrep™, продукт Bioneer Company, Korea), и это использовали в качестве РНК внутреннего положительного контроля. 1 мкл РНК внутреннего положительного контроля помещали в пробирку, в которую добавляли 10× буфера 5 мкл, MMLV 600 Ед, Taq 7,5 Ед, dNTP 20 мМ 3 мкл, стабилизатор, праймер с оптимизированной концентрацией (15p), зонд и т.п. и РНК нового вируса гриппа в качестве стандартной матрицы и дистиллированную воду, тем самым достигая общего объема 50 мкл. Затем в амплификаторе нуклеиновых кислот осуществляли ОТ-ПЦР в реальном времени. Это полученное вещество подвергали ОТ-ПЦР при температуре 45°С в течение 15 минут, с последующими 45 циклами при температуре 95°C в течение 10 минут для денатурации, 95°C в течение 20 секунд и 55°C в течение 30 секунд.

Как результат, подтвердили, что от 2×10⁸ до 2×10⁹/200 мкл РНК внутреннего положительного контроля на один реакционный раствор проявлял оптимальную эффективность ПЦР во время отделения и очистки.

Затем частицы вируса табачной мозаики, которые выделяли вместе с образцами нового вируса гриппа, применяли в экспериментах со стадии выделения РНК в ОТ-ПЦР в реальном времени, и затем сравнивали с существующим используемым внутренним положительным контролем (внутренний положительный контроль, который входит в состав AccuPower Diagnostics Kit компании Bioneer Company (плазмида гена DVL мыши)). Во время выделения РНК от 2×10⁸ до 2×10⁹ копий/20 мкл РНК в соответствии с концентрациями, выбранными посредством предшествующих экспериментов, смешивали с 200 мкл образца нового вируса гриппа, и отделяли и выделяли посредством инструмента очистки и распределения нуклеиновой кислоты. Во время ОТ-ПЦР в реальном времени в амплификаторе нуклеиновой кислоты использовали комплекты праймеров и зондов 1 и 3 (MP 1 и MP 3), выбранные в примере 2.

Результат эксперимента подтвердил, что оптимальная концентрация частиц вируса табачной мозаики во время выделения РНК составляет 2×10⁸ копий/20 мкл. Следовательно, предпочтительно смешивать 20 мкл 1×10⁷ копий/мкл частиц вируса табачной мозаики с 200 мкл образца на стадии очистки. Кроме того, показано, что комплект праймеров и зондов 1 (MP 1) имеет более высокую эффективность при амплификации внутреннего положительного контроля TMV.

Кроме того, когда этот результат сравнивали с результатами реакции с существующим внутренним положительным контролем в отношении того же образца нового вируса гриппа, подтвердили, что даже несмотря на то, что вирус табачной мозаики выделяли вместе с образцом и их использовали для проведения реакции, отсутствовало существенное влияние на амплификацию матрицы РНК нового вируса гриппа, а амплификация растительного внутреннего положительного контроля хорошо протекала независимым образом и имела хороший результат. Кроме того, подтверждали, что значение флуоресценции выше по сравнению с внутренним положительным контролем, используемым в существующем диагностическом наборе компании Bioneer Company, и, таким образом, выше интенсивность реакции.

Кроме того, для того, чтобы подтвердить, что можно осуществлять количественный анализ, выделение РНК осуществляли посредством инструмента отделения и очистки нуклеиновой кислоты, а ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли в амплификаторе нуклеиновых кислот, несмотря на то, что частицы вируса табачной мозаики использовали в концентрации от 10² до 10⁸ копий/реакция.

Как результат, частицы TMV, которые применяли в концентрациях от 10² до 10⁸ копий/реакция, поддаются определению по меньшей мере до 10³ копий/реакция (фиг. 6). Когда строили калибровочный график ОТ-ПЦР со стандартной матрицей в реальном времени, наклон составил -0,28 и значение R² составило 1 (фиг. 6). Здесь R² представляет коэффициент корреляции, который отражает линейность кривой на калибровочном графике ПЦР в реальном времени, и он обозначает, что чем ближе значение R² к 1 (чем кривая ближе к прямой линии), тем более предпочтительным образом осуществляют ПЦР. По сравнению с калибровочным графиком, для которого ОТ-ПЦР со стандартной матрицей в реальном времени осуществляли на РНК TMV, концентрация частиц вируса табачной мозаики имеет склонность к снижению до 1/10 после выделения РНК. Однако калибровочный график представляет равномерное пространство в соответствии с концентрациями вируса табачной мозаики, что подтвердило возможность количественного анализа.

(3) ПЦР в реальном времени с использованием нуклеиновых кислот различных четырех типов (ДНК/РНК)

Подтверждали возможность определения и диагностирования целевых нуклеиновых кислот различных типов, отделенных и очищенных от различных биологических образцов. В качестве амплификатора нуклеиновых кислот, входящего в состав устройства для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по настоящему изобретению, использовали блок количественного термоциклирования Exicycler™ (продукт Bioneer Company, Korea), а также использовали диагностические наборы компании Bioneer Company. В качестве диагностических наборов, используемых в ПЦР в реальном времени, использовали диагностические наборы четырех типов, а именно набор для количественной ПЦР с HBV (продукт Bioneer Company, номер по каталогу HBV-1111), набор для количественной ОТ-ПЦР с HCV (продукт Bioneer Company, номер по каталогу HCV-1111), набор для ОТ-ПЦР в реальном времени с New Inf A (H1N1) (продукт Bioneer Company, номер по каталогу SIV-1111) и набор для ПЦР в реальном времени с CT и NG (продукт Bioneer Company, номер по каталогу STD2A-1111).

Состав набора для количественной ПЦР с HBV делает возможным количественный анализ посредством амплификации ДНК HBV, выделенной из образца сыворотки, для того, чтобы определить наличие инфекции вирусом гепатита В. В отношении набора для количественной ПЦР с HBV, раствор смеси для ПЦР из 10× буфера для ПЦР 5 мкл, wTfi полимеразы 5 Ед, dNTP 20 мМ 5 мкл, термостабильной пирофосфатазы, PPi, стабилизатора и т.п., а также праймер и зонд, разработанные для специфичной амплификации только ДНК HBV, являются лиофилизированными (Таблица 2).

Состав набора для ПЦР в реальном времени с CT и NG позволяет одновременно амплифицировать ДНК Chlamydia trachomatis (CT) и ДНК Neisseria gonorrheae (NG), выделенные из образцов мочи или мазков, в одной реакционной пробирке для того, чтобы определить венерическую инфекцию. Набор для ПЦР в реальном времени с CT и NG содержит тот же раствор смеси для ПЦР, что и диагностический набор для HBV, а праймер и зонд, сконструированные для специфичной амплификации только ДНК CT или ДНК NG, являются лиофилизированными (Таблица 2).

Два указанных выше диагностических набора обладают сходством в амплификации ДНК, но имеют различия, заключающиеся в том, что диагностический набор для HBV амплифицирует вирусную ДНК одного типа, выделенную из сыворотки, а диагностический набор для CT и NG одновременно амплифицирует бактериальную ДНК двух типов, то есть ДНК CT и ДНК NG, выделенные из мочи, за один раз. Кроме того, диагностический набор для HBV разработан для количественного анализа ДНК, а диагностический набор для CT и NG разработан для качественного анализа ДНК.

Набор для количественной ОТ-ПЦР с HCV, который разработан для того, чтобы диагностировать инфекцию вирусом гепатита С, схож с диагностическим набором для HBV тем, что количественный анализ возможет посредством амплификации нуклеиновой кислоты, выделенной из сыворотки, но отличается от диагностического набора для HBV тем, что диагностический набор для HBV амплифицирует вирусную ДНК, а диагностический набор для HCV амплифицирует вирусную РНК посредством ОТ-ПЦР.

По сравнению с диагностическим набором для HCV, набор для ОТ-ПЦР в реальном времени с New Inf A (H1N1), который недавно разработан для диагностики инфекции новым вирусом гриппа, схож тем, что происходит амплификация целевой РНК, но отличается тем, что РНК выделяют из органов дыхания вместо сыворотки. Кроме того, набор для ОТ-ПЦР в реальном времени с New Inf A (H1N1) разработан для качественного анализа, тогда как диагностический набор для HCV позволяет осуществлять количественный анализ. В отношении диагностического набора для HCV или диагностического набора для New Inf A (H1N1) для ОТ-ПЦР РНК, раствор смеси для ОТ-ПЦР из 10× RT буфера 5 мкл, MMLV 600 Ед, wTfi 5 Ед, dNTP 20 мМ 3 мкл, DTT 50 мМ, RNasin 15 Ед, стабилизатора и т.п., а также праймер и зонд, сконструированные для избирательной амплификации РНК HCV или РНК New Inf A (H1N1), являются лиофилизированными (Таблица 2). Праймер и зонд, включенные в каждый диагностический набор, разработаны так, чтобы иметь схожие значения Tm в диапазоне от 55°C до 57°C, и, таким образом, можно осуществлять ПЦР с использованием диагностических наборов четырех различных типов в одно и то же время.

Для того чтобы одновременно осуществлять ПЦР или ОТ-ПЦР с использованием диагностических наборов четырех различных типов в амплификаторе нуклеиновых кислот, сначала 5 мкл ДНК или РНК матрицы, 1 мкл ДНК или РНК для внутреннего положительного контроля (ВПК) и 44 мкл дистиллированной воды вносят в сухую смесь для ПЦР и смешивают для достижения общего объема 50 мкл. РНК или ДНК матрицу синтезировали, используя специфичную часть каждой мишени, которую выбирают посредством процедуры выравнивания, посредством способа синтеза генов (NBiochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 248, 200-203), в Bionner Company, и затем клонировали, используя вектор pGEM-T-Easy (Promega Company, USA).

Диагностические наборы для HBV, HCV, CT и NG и New Inf A (H1N1) загружали на блок термоциклирования одного амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени, и колонки и лунки задавали в программном обеспечении в соответствии с назначенной областью. ПЦР одновременно осуществляли при условиях ПЦР для реакции обратной транскрипции при температуре 45°С в течение 15 минут, с последующими 45 циклами, в которых 95°С в течение 5 минут для денатурации, по 95°С в течение 5 секунд и по 55°С в течение 5 секунд. В отношении диагностического набора для HBV и диагностического набора для HCV, от 10¹ до 10⁷ копий/реакция ДНК матрицы соответственно использовали для количественного анализа. В отношении диагностического набора для CT и NG и диагностического набора для New Inf A (H1N1), только один тип концентрации ДНК или РНК матрицы положительного контроля использовали для качественного анализа.

ДНК или РНК для внутреннего положительного контроля представляет собой ген, разработанный для независимой амплификации без влияния на амплификацию ДНК или РНК матрицы, и его используют для того, чтобы подтвердить отсутствие проблем в ПЦР посредством подтверждения амплификации ДНК или РНК внутреннего положительного контроля соответствующим образом по результату для отрицательного контроля, в котором никогда не происходит амплификация ДНК или РНК матрицы.

Как результат, ДНК матрицу диагностического набора для HBV, которую применяют в концентрации от 10¹ до 10⁷ копий/реакция, можно определить по меньшей мере до 10¹ копий/реакция (фиг. 8), и при построении калибровочного графика для ОТ-ПЦР со стандартной матрицей в реальном времени наклон составляет -0,28, а значение R² составляет 0,9997 (фиг. 9). Здесь R² представляет коэффициент корреляции, отражающий линейность кривой на калибровочном графике для ПЦР в реальном времени, и он обозначает, что чем ближе значение R² к 1 (чем кривая ближе к прямой линии), тем более предпочтительным образом осуществляют ПЦР. Также в случае диагностического набора для HCV, РНК матрицу можно определить по меньшей мере до 10¹ копий/реакция (фиг. 10), и при построении калибровочного графика для ОТ-ПЦР со стандартной матрицей в реальном времени наклон составляет -0,29, а значение R² составляет 0,9998 (фиг. 11). Приведенные выше результаты подтверждают, что ПЦР РНК и ДНК можно осуществлять одновременно в одном амплификаторе нуклеиновых кислот в реальном времени, независимо от различий между РНК и ДНК.

Также в случае диагностического набора для CT и NG, разработанного для качественного анализа, когда ПЦР осуществляют одновременно вместе с диагностическими наборами для HBV и HCV, которые представляют собой наборы для количественного анализа, происходит нормальная амплификация ДНК положительного контроля CT, ДНК положительного контроля NG и ДНК для внутреннего положительного контроля. Для того чтобы подтвердить предел определения, проводили реакцию с использованием ДНК матрицы CT и NG от 10¹ до 10⁷ копий/реакция. Результаты подтверждают, что 10¹ копий/реакция ДНК матрицы CT и NG являются обнаружимыми. При построении калибровочного графика для ОТ-ПЦР с стандартной матрицей в реальном времени для CT наклон составляет -0,28, а значение R² составляет 0,9997, и для NG наклон составляет -0,30, а значение R² составляет 0,9996.

Также в случае применения диагностического набора для New Inf A (H1N1) способом, схожим с диагностическим набором для CT и NG, подтверждали, что происходила нормальная амплификация РНК положительного контроля. Для того чтобы подтвердить предел определения, проводили реакцию с ДНК матрицей New Inf A (H1N1) от 10¹ до 10⁷ копий/реакция. Результаты подтверждают, что 10¹ копий/реакция ДНК матрицы New Inf A (H1N1) являются определимыми. При построении калибровочного графика для ОТ-ПЦР со стандартной матрицей в реальном времени наклон составляет -0,28, а значение R² составляет 0,9996. Следовательно, подтвердили, что можно одновременно осуществлять ПЦР с использованием даже наборов, разработанных для количественного анализа или качественного анализа.

Приведенные выше результаты экспериментов подтверждают, что при осуществлении ПЦР и ОТ-ПЦР, используя один амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени, включенный в устройство для интегрального анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, ДНК и РНК, выделенную из различных образцов, таких как сыворотка, моча, орган дыхания и т.п., можно одновременно амплифицировать при одинаковых условиях, даже если используют диагностические наборы четырех различных типов, разработанные для количественного анализа или качественного анализа.

Группа изобретений относится к области молекулярно-диагностических исследований. Устройство для комплексного качественного или количественного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени используют в способе определения целевой нуклеиновой кислоты. Устройство состоит из множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения, амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени, контроллера и блока отображения. Использование изобретений позволяет быстро и точно проводить исследования различных мишеней из различных образцов, посредством проведения амплификации при одинаковых условиях для всех мишеней. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени для одновременного осуществления качественного анализа или количественного анализа целевых нуклеиновых кислот, соответствующих биологическим образцам различных типов, где устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени содержит:
множество приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, которые отделяют и очищают целевые нуклеиновые кислоты от биологических образцов различных типов, содержащих целевые нуклеиновые кислоты;
амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200, который содержит многолуночный блок термоциклирования 210 и в реальном времени измеряет количества целевых нуклеиновых кислот различных типов, полученные посредством множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100;
контроллер, который назначает множество лунок на блоке термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200 посредством стандартизованной колонки в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот соответственно целевым нуклеиновым кислотам различных типов соответственно отделенным и очищенным посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, хранит информацию о биологических образцах из приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 в соответствии с соответствующими лунками, назначенными посредством стандартизованной колонки, осуществляет одновременную амплификацию при одинаковых условиях для блока термоциклирования и осуществляет комплексное управление так, что результаты амплификации, посредством которых соответствующие целевые нуклеиновые кислоты качественно или количественно анализируют, соответствуют соответствующим биологическим образцам, которые подвергли отделению и очистке посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100; и
блок отображения 300 в реальном времени, который выводит результаты качественного или количественного анализа от контроллера.

2. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.1, где при назначении множества лунок на блоке термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200 посредством стандартизованной колонки в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот и хранении информации о биологических образцах в соответствии с приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100 в соответствии с соответствующими лунками, назначенными посредством стандартизованной колонки, дополнительно хранят информацию об образце положительного стандарта, образце отрицательного стандарта или образце количественного стандарта.

3. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.1, где амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 содержит диагностические наборы, загруженные на многолуночный блок термоциклирования 210, диагностические наборы содержат нуклеиновые кислоты различных типов, полученные из множества приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100.

4. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.3, где многолуночный блок термоциклирования 210 представляет собой 96-луночный блок термоциклирования, который состоит из 12 колонок × 8 рядов лунок.

5. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.4, где измеряемые элементы избирательно задают на многолуночном блоке термоциклирования 210 посредством стандартизованной колонки.

6. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.1, где контроллер, когда внутренний положительный контроль (ВПК) отделяют вместе с биологическими образцами различных типов в каждом приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100, определяет по продукту амплификации посредством амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, успешно ли отделили нуклеиновую кислоту посредством приспособления для автоматизированной очистки и распределения 100, и тем самым определяет, нужно ли повторно проводить отделение нуклеиновой кислоты.

7. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.1, где контроллер качественно определяет присутствие или отсутствие целевых нуклеиновых кислот посредством сравнения значений Ct соответствующих биологических образцов, которые получают посредством одновременной амплификации при одинаковых условиях для амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, с критическим значением Ct.

8. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.1, где контроллер количественно определяет целевую нуклеиновую кислоту в образце посредством сравнения соответствующих значений Ct, полученных посредством одновременной амплификации образца количественного стандарта с известной концентрацией и соответствующих биологических образцов при одинаковых условиях амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени 200, с графиком количественных значений Ct образца количественного стандарта для вычисления числа целевых нуклеиновых кислот.

9. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.1, где приспособление для автоматизированной очистки и распределения 100 содержит картридж, содержащий различные биологические образцы, содержащие нуклеиновые кислоты и буферы, используемые для выделения нуклеиновых кислот из них, охлаждающий блок, высокотемпературный блок, емкость для жидких отходов, картридж пипетки и блок пипетки, блок пипетки можно перемещать на подложке, на которой предоставлены блоки и картриджи, что делает возможным присоединение и разъединение пипеток, и содержит блок приложения магнитного поля для приложения магнитного поля к пипеткам или его выключения, а информацию о соответствующих образцах стандартов и биологических образцах и информацию о целевых нуклеиновых кислотах в соответствии с приспособлениями для автоматизированной очистки и распределения 100 хранит контроллер.

10. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.3, где амплификатор нуклеиновых кислот в реальном времени 200 содержит многолуночный блок термоциклирования, температуру которого изменяют в соответствии с предварительно определенными значениями температуры, источник света облучения для облучения светом реакционных пробирок, загруженных на блок термоциклирования, и датчик определения флуоресцентного света для регистрации света, генерируемого в реакционных пробирках, а измеряемые элементы задают и хранят посредством стандартизованной колонки назначенных лунок.

11. Устройство для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени по п.1, которое дополнительно содержит блок хранения базы данных 400, который хранит результаты анализов.

12. Способ определения целевой нуклеиновой кислоты с использованием устройства для комплексного анализа нуклеиновых кислот в реальном времени, где способ включает:
1) отделение и очистку нуклеиновых кислот, содержащихся в соответствующих образцах, от различных биологических образцов, содержащих образцы стандартов и нуклеиновые кислоты, посредством множества приспособлений для автоматизированного разделения и очистки 100, и затем внесение таким образом отделенного и очищенного раствора в реакционную пробирку с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот;
2) назначение множества лунок на многолуночном блоке термоциклирования 210 посредством стандартизованной колонки в соответствии с типами целевых нуклеиновых кислот так, что многолуночный блок термоциклирования 210, на который загружают реакционные пробирки с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот, и соответствующие целевые нуклеиновые кислоты, отделенные и очищенные посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100, соответствуют друг другу, и хранение информации об образцах стандартов и биологических образцах, отделенных посредством приспособлений для автоматизированной очистки и распределения 100 в соответствии с соответствующими лунками, назначенными посредством стандартизованной колонки;
3) загрузку реакционных пробирок, подготовленных на стадии 1), в соответствующие лунки в соответствии с сохраненной информацией о биологических образцах в соответствующие лунки многолуночного блока термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени; и
4) одновременную амплификацию соответствующих целевых нуклеиновых кислот, загруженных на блок термоциклирования 210 амплификатора нуклеиновых кислот в реальном времени, при одинаковых условиях и осуществление качественного анализа или количественного анализа соответствующих целевых нуклеиновых кислот для множества биологических образцов и тем самым получение результатов амплификации;
5) отображение выведенных в реальном времени результатов качественного или количественного анализа от контроллера в блок отображения 300.

13. Способ по п.12, где на стадии 1) в биологический образец добавляют внутренний положительный контроль (ВПК) с последующим отделением нуклеиновой кислоты в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100 и определяют эффективность определения целевой нуклеиновой кислоты посредством определения по результатам амплификации того, успешно ли отделили целевую нуклеиновую кислоту в приспособлении для автоматизированной очистки и распределения 100, а также эффективность амплификации.

14. Способ по п.12, где на стадии 1) реакционную пробирку с реакционной смесью для амплификации нуклеиновых кислот подготавливают посредством внесения раствора отделенной и очищенной нуклеиновой кислоты в реакционную пробирку, которая в сухом виде содержит компоненты, необходимые для амплификации нуклеиновой кислоты, и смешивают раствор с компонентами.

15. Способ по п.12, где внутренний положительный контроль представляет собой частицу вируса табачной мозаики, когда целевой нуклеиновой кислотой является РНК.

16. Способ по п.13, где внутренний положительный контроль представляет собой плазмидную ДНК или продукт ПЦР, когда целевой нуклеиновой кислотой является ДНК.