РЕГУЛЯТОР КОЛЛЕКТИВНОГО ПОВЕДЕНИЯ ("ЧУВСТВО КВОРУМА") У БАКТЕРИЙ Российский патент 2014 года по МПК C07D277/18 A61K31/426 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и фармацевтике и касается малых регуляторных молекул, способных направленно изменять (ослаблять или усиливать) плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий. Изобретение может найти применение при контроле биотехнологических процессов, производстве средств для предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для контроля и управления бактериальными инфекциями растений, животных и человека.

Обнаружение плотностно-зависимой коммуникации у бактерий с характеристикой лежащих в ее основе молекулярно-генетических механизмов стало одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века [1 - Greenberg E.P., Winans S., Fuqua C. Quorum sensing by bacteria. Ann. Rev. Microbiol, 1996, V.50, P.727-751]. При этом данный феномен коллективного поведения бактерий, обозначенный понятием «чувство кворума» (англ. - quorum sensing), позволил принципиально по-новому оценить целый ряд примеров функциональной и морфологической дифференцировки прокариот, включая развитие биолюминесценции, синтез пигментов и антибиотиков, образование экзоферментов и факторов вирулентности, формирование биопленок, конъюгацию и спорообразование [2 - Waters C.M., Bassler B.L. Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol, 2005, V.21, P.319-346].

Первым из описанных и наиболее распространенным среди микроорганизмов вариантом «чувства кворума» являются luxI/luxR-подобные системы, в которых синтезируемая под контролем гена luxI сигнальная молекула-автоиндуктор диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки, где, связываясь с регуляторным белком LuxR, запускает транскрипцию целевых генов [3 - Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J. Bacteriol, 1994, V.176 (2). P.269-275]. При этом анализ химической природы подобных автоиндукторов позволил охарактеризовать их как разнообразные варианты ацилированных гомосеринлактонов (ГСЛ) [4 - Fuqua С., Parsek R.M., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu. Rev. Genet, 2001, V.35, P.439-468].

Расшифровка молекулярно-генетических механизмов коллективного поведения, а также выявление важной биологической роли систем плотностно-зависимой коммуникации, определили актуальность поиска подходов к управлению чувством кворума. Предложенными решениями стали: 1) подавление синтеза автоиндуктора; 2) его деградация специфическими ферментами (лактоназами или ацилазами); 3) использование агонистов и антагонистов ГСЛ, способных прямо интерферировать с естественным сигналом за связывание с luxR-подобными белками [5 - Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий. Антибиотики и химиотерапия, 2003, Т.48(10), С.32-39]. Именно последний подход, наиболее интенсивно разрабатываемый во многих лабораториях по всему миру и к настоящему моменту приведший созданию уже нескольких сотен активных соединений [6 - Galloway W.R.J.D., Hodgkinson J.T., Bowden S.D., Welch M., Spring D.R. Quorum sensing in gram-negative bacteria: small-molecule modulation of AHL and AI-2 Quorum sensing pathways. Chem. Rev. 2011, V.111, P.28-67], составляет теоретическую основу для настоящего изобретения.

Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является патент [7 - Blackwell H.E., Geske G.D., O'Neil J.C. Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands. US patent 7,910,622 B2, 2011], формула и описание которого содержат сведения о ряде соединений, в зависимости от объекта воздействия способных вызывать либо активационные (агонистические), либо ингибирующие (антагонистические) эффекты в отношении опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у определенных видов бактерий. При этом в основу подобных веществ заявителями положено аналогичное природным ГСЛ лактонное кольцо, для придания которому дополнительных модулирующих активностей осуществлена ковалентная модификация ацильными группами различного строения и состава. Однако значительное структурное сходство предложенной группы молекул с естественными сигналами не только обеспечивает обозначенную заявителями возможность интерференции между ними, но потенциально сохраняет возможность развития неучтенных эффектов в отношении других микроорганизмов, плотностно-зависимая коммуникация между которыми опосредуется структурно схожими ГСЛ.

В свою очередь относительно химической структуры заявляемого соединения наиболее близким известным техническим решением является патент [8 - Nakajima Т., Sugawara M., Nomoto Y., Uesaka N., Nakasato Y. Thiazole derivatives. US patent 7,880,013 B2, 2011], формула и описание которого содержат сведения о ряде соединений, в основу которых положено пятичленное кольцо тиазола, ковалентно связанное с замещенными или незамещенными циклоалкильными, арильными и др. группировками. Однако в данном патенте отсутствуют указания о возможности использования данных соединений для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий, а основным назначением заявленных соединений является их применение в качестве антагонистов аденозиновых рецепторов.

Таким образом, заявляемое изобретение не известно из уровня техники, что определяет его соответствие требованию новизны.

Задачей данного изобретения является разработка структурно отличного от гомосеринлактнов соединения, обладающего избирательной и выраженной способностью к регуляции (как усилению, так и ослаблению) опосредуемого ГСЛ коллективного поведения («чувства кворума») у определенного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий.

В настоящем изобретении эта задача решается применением соединения на основе тиазола, полностью описываемого формулой 1:

В данном изобретении раскрывается структурная формула соединения формулы 1 и способы его практического применения для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе производного тиазола содержит по весу от 0.0001 до 100% соединений формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или вещества, позитивно модифицирующие (повышающие биодоступность, увеличивающие сроки действия и т.д.) свойства данной композиции.

По сравнению с соединениями, составляющими сущность известных патентов [7, 8], заявляемое соединение формулы 1 имеет ряд существенных отличий, а именно:

во-первых, в отличие от известных соединений, созданных на основе лактонного кольца и, в этой связи, являющихся близкими структурными аналогами природных авторегуляторных молекул - гомосеринлактонов [7], заявляемое соединение представляет собой структурно отличный от них синтетический лиганд. Из доступной научной и патентной литературы регуляторы «чувства кворума» на основе тиазола не известны;

во-вторых, в отличие от известных производных тиазола [8] общей формулы 2

заявляемое соединение имеет только один вариант ковалентно присоединяемого радикала, по своему положению соответствующего R₄ и полностью описываемого аналогичным имеющемуся в молекуле естественного сигнала (гексаноил-гомосеринлактона) остатком гексановой кислоты, при отсутствии иных изменений по радикалам R₁, R₂ и R₃=Н. Кроме того, в отличие от известного патента [8], оговаривающего использование соединений общей формулы 2 в качестве антагонистов аденозиновых рецепторов, заявляемое соединение формулы 1 предназначено для регуляции опосредуемого ГСЛ коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий;

в-третьих, благодаря структурным отличиям от природных авторегуляторных молекул, проявляющих активность во многих luxI/luxR-подобных системах, заявляемое соединение формулы 1 обладает избирательной (селективной) регуляторной активностью, реализуемой в отношении cviI/cviR-регулируемой системы биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum, а также других биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих, бактерий (см. пример 1). При этом вероятной причиной селективного действия соединения формулы 1 в названных системах «чувства кворума» лежит избирательное взаимодействие с регуляторным белком CviR и его близкими гомологами, но не другими LuxR-подобными белками. В свою очередь природное разнообразие CviR-подобных белков определяет возможность их как позитивного, так негативного регулирования заявляемым соединением, что у различного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих бактерий будет проявляться либо как усиление (см. пример 1), либо как ослабление (см. пример 2) коллективного поведения.

Для понимания сути изобретения также необходимо указать, что достигаемая применением соединения формулы 1 регуляция «чувства кворума» включает, но не исчерпывается только воздействием на продукцию виолацеина, т.к. под контролем регуляторного белка CviR и его гомологов находится ряд целевых генов (оперонов), в том числе ответственных за продукцию экзоферментов и образование биопленок. Использование же теста индукции или ингибирования биосинтеза виолацеина в настоящем изобретении определяется простотой и информативностью регистрируемого проявления регуляторной активности соединения формулы 1.

Таким образом, результатом действия соединения формулы 1 является специфическая регуляция определенной системы «чувства кворума», направленность которой (усиление или ослабление) определяется рецепторными особенностями воспринимающих его CviR-подобных белков. Таким образом, с использованием одного и того же соединения оказывается возможным разнонаправленное воздействие на коллективное поведение различных микроорганизмов, в том числе изолированно или в их смешанной культуре.

Защищаемое применение соединения формулы 1 подразумевает, в том числе, его использование для управления биотехнологическими процессами, реализуемыми с помощью виолацеин-продуцирующих микроорганизмов (справочное: виолацеин-производное индола, образующееся при окислении триптофана, сине-фиолетовый пигмент с антибактериальной, протистоцидной, противовирусной и другими биотехнологически и фармакологически полезными активностями). В этом случае соединение формулы 1 может вводиться в плотные или жидкие питательные среды в виде растворов, а также применяться в виде чистого вещества или иммобилизованным на различных носителях.

В состав патентуемого изобретения входит также применение соединения формулы 1 для регуляции активности других целевых генов (оперонов), в том числе вовлеченных в процессы порчи сельскохозяйственной продукции, а также развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данное соединение может вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Соединение может использоваться в виде твердых веществ, растворов или суспензий в воде или других растворителях, а также нанесенным на различные носители. Возможно также использование соединения формулы 1 в составе композиций с другими веществами, в том числе позитивно модифицирующими (увеличивающими биодоступность, сроки действия) его биологическую активности.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Стимуляция коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

Определение способности соединения формулы 1 к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием двух бактериальных тест-систем, в присутствии гексаноил-гомосеринлактона (С₆-ГСЛ)? отвечающих синтезом пигмента виолацеина {Chromobacterium violaceum NCTC 13274) или развитием биолюминесценции {Escherichia coli pAL103). При этом особенностью первого являлась инсерция транспозона Тn5 в ген cvil, ответственного за синтез собственного С₆-ГСЛ, с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им регуляторного белка, ответственного за восприятие автоиндуктора [9 - McClean K.H., et al].

Quomm sensing and Chrornobacteriurn violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones. Microbiology, 1997, V.143, P.3703-3711]. В свою очередь особенностью второго штамма являлось наличие генетической конструкции luxR+luxI_luxCDABE, кодирующей рецепторный белок LuxR Vibrio fischeri и в присутствии экзогенно вносимого С₆-ГСЛ или С₆-оксо-ГСЛ отвечающей развитием свечения (биолюминесценции) [10 - Lindsay A., Ahmer B.M. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones. J.Bacteriol, 2005, V187(14), P.5054-5058].

При проведении тестирования С. violaceum NCTC13274 и Escherichia coli pAL103 выращивались на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии С₆-ГСЛ или соединения формулы 1 (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация сравниваемых соединений, вызывающая индукцию образования пигмента виолацеина или биолюминесценции на 50% от максимально выраженного эффекта в присутствии естественного сигнала. Результаты подобного тестирования иллюстрируются Фиг.1, а в обобщенном виде приведены в таблице 1.

Таблица 1. Оценка влияния соединения формулы 1 на коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий в тестах на С. violaceum NCTC13274 и E.coli pAL103.

Соединение Концентрации ЕС50, характеризующие индукцию «чувства кворума» у бактерий Синтез пигмента виолацеина С. violaceum NCTC13274 Биолюминесценция Escherichia coli pAL103 С₆-ГСЛ 0,5 наноМ 60 наноМ 1 62,5 мкМ 0 (нет активности)

Из приведенных данных видно, что оба использованных микроорганизма интенсивно реагируют кворум-зависимым синтезом виолацеина (С. violaceum NCTC) или развитием биолюминесценции (Е. coli рAL103) в присутствии естественного авторегулятора С₆-ГСЛ. В свою очередь тестируемое соединение формулы 1 действует менее активно, но более специфично, вызывая индукцию синтеза виолацеина, но не развитие биолюминесценции. При этом в основе подобных различий предположительно лежит избирательное сродство соединения 1 к воспринимающему регуляторный сигнал белку CviR при отсутствии такового к LuxR.

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность избирательной индукции «чувства кворума» определенных видов бактерий, входящих в состав полимикробных ассоциаций.

Пример 2. Подавление коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

Определение способности соединения формулы 1 к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием штамма Jantinobacterium lividum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под №В-10136. Данный штамм представляет собой природный изолят, характеризующийся способностью к синтезу пигмента виолацеина под контролем автоиндуктора неидентифицированной природы.

При проведении тестирования J. lividum В-10136 выращивался на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии соединения формулы 1 (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация соединения формулы 1, вызывающая подавление продукции виолацеина на 50% от максимально выраженного эффекта в контроле.

Результаты подобного тестирования иллюстрируются Фиг.2. Из приведенных данных следует, что тестируемое соединения формулы 1 подавляет продукцию виолацеина (ЕС50=87,5 мкМ), что характеризует его как ингибитор коллективного поведения («чувства кворума») J. lividum B-10136.

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность подавления «чувства кворума» определенных видов бактерий, в частности J. lividum, для предупреждения вызываемой ими порчи сельскохозяйственной продукции. Та же активность может быть использована при лечении и профилактике инфекционных заболеваний растений, животных и человека, вызываемых J. lividum и другими виолацеин-продуцирующими микроорганизмами.

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и фармацевтики, а именно к малым регуляторным молекулам, способным направленно изменять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий. В частности, изобретение относится к применению производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора (активатора или ингибитора) коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий. Технический результат - производное тиазола, предназначенное для регуляции опосредуемого гомосеринлактонами «чувства кворума» у виолацеин-продуцирующих биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Применение производного тиазола формулы 1 в качестве регулятора (активатора или ингибитора) коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий: