ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1,3-БЕНЗОДИОКСОЛА В КАЧЕСТВЕ РЕГУЛЯТОРОВ КОЛЛЕКТИВНОГО ПОВЕДЕНИЯ (ЧУВСТВА КВОРУМА) У БАКТЕРИЙ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/357 A61P31/04 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и фармацевтике и касается малых регуляторных молекул, способных направленно изменять (ослаблять или усиливать) плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение (чувство кворума) у бактерий. Изобретение может найти применение при контроле биотехнологических процессов, производстве средств для предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для контроля и управления бактериальными инфекциями растений, животных и человека.

Обнаружение плотностно-зависимой коммуникации у бактерий с характеристикой лежащих в ее основе молекулярно-генетических механизмов стало одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века [1 - Greenberg Е.Р., Winans S., Fuqua С.Quorum sensing by bacteria. Ann. Rev. Microbiol, 1996, V.50, P.727-751]. При этом данный феномен коллективного поведения бактерий, обозначенный понятием «чувство кворума» (англ. - quorum sensing), позволил принципиально по-новому оценить целый ряд примеров функциональной и морфологической дифференцировки прокариот, включая развитие биолюминесценции, синтез пигментов и антибиотиков, образование экзоферментов и факторов вирулентности, формирование биопленок, конъюгацию и спорообразование [2 - Waters С.М., Bassler B.L. Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Ann. Rev. Cell and Developmental Biol, 2005, V.21, P.319-346].

Первым из описанных и наиболее распространенным среди микроорганизмов вариантом чувства кворума являются luxI/luxR-подобные системы, в которых синтезируемая под контролем гена luxI сигнальная молекула - автоиндуктор диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки, где связываясь с регуляторным белком LuxR, запускает транскрипцию целевых генов [3 - Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg Е.Р. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J. Bacteriol, 1994, V.176 (2). Р.269-275]. При этом анализ химической природы подобных автоиндукторов позволил охарактеризовать их как разнообразные варианты ацилированных гомосеринлактонов (ГСЛ) [4 - Fuqua С.,

Parsek R.M., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu. Rev. Genet, 2001, V.35, P.439 - 468].

Расшифровка молекулярно-генетических механизмов коллективного поведения, а также выявление важной биологической роли систем плотностно-зависимой коммуникации определили актуальность поиска подходов к управлению чувством кворума. Предложенными решениями стали: 1) подавление синтеза автоиндуктора; 2) его деградация специфическими ферментами (лактоназами или ацилазами); 3) использование агонистов и антагонистов ГСЛ, способных прямо интерферировать с естественным сигналом за связывание с luхR-подобными белками [5 - Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий. Антибиотики и химиотерапия, 2003, Т.48(10), С.32-39]. Именно последний подход, наиболее интенсивно разрабатываемый во многих лабораториях по всему миру и к настоящему моменту приведший созданию уже нескольких сотен активных соединений [6 - Galloway W.R.J.D., Hodgkinson J.Т., Bowden S.D., Welch M., Spring D.R. Quorum sensing in gram-negative bacteria: small-molecule modulation of AHL and AI-2 Quorum sensing pathways. Chem. Rev. 2011, V.lll, P.28-67], является наиболее близким к настоящему изобретению.

Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что на основе данного подхода предложена целая серия изобретений, с 1996 по 2006 гг. нашедших отражение в международных охранных документах WO 96/29392; WO 99/27786; WO 99/53915; WO 01/43739; WO 01/68090; WO 01/68091; WO 01/76594; WO 01/85664; WO 02/00639; WO 02/18342; WO 02/47681; WO 02/102370; WO 03/039529; WO 03/106445; WO 2004/016588; WO 2006/079015; WO 2006/084056; WO 2006/125262. В частности, одним из последних и наиболее системных технических решений, сформированных по «зонтичному» принципу, является патент [7 - Blackwell Н.Е., Geske G.D., Campbell J.C. Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands. US patent 7910622, 2011], содержащий сведения о многочисленных синтетических лигандах и способах их использования для модуляции опосредуемого гомосеринлактонами чувства кворума у определенных видов бактерий. При этом в основу подобных веществ заявителями положено аналогичное природным ГСЛ лактонное кольцо, для придания которому дополнительных модулирующих активностей осуществлена ковалентная модификация ацильными группами различного строения и состава.

В то же время значительное структурное сходство предложенной группы молекул с естественными сигналами не только обеспечивает обозначенную заявителями возможность интерференции между ними, но и потенциальное развитие неучтенных эффектов в отношении других микроорганизмов, плотностно-зависимая коммуникация между которыми опосредуется структурно схожими ГСЛ.

В этой связи задачей данного изобретения является разработка структурно отличных от гомосеринлактонов соединений, обладающих избирательной и выраженной способностью к регуляции (усилению или ослаблению) опосредуемого ГСЛ коллективного поведения (чувства кворума) у определенного круга биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий.

В настоящем изобретении эта задача решается применением соединений на основе 1,3-бензодиоксола общей формулы (1)

где в общей формуле 1 X означает, но не ограничивается:

- линейный или разветвленный алкильный (C_nH_2n+1; n=1-12), алкенильный (C_mH_2m-1; n=1-12) или алкинильный (C_mH_2m-3; n=1-12) радикал;

- произвольным образом замещенный линейный углеводородный (C_nH_2n+1; n=1-12) радикал с включением атомов кислорода (n=1-4) или азота (n=1-4);

- фрагмент на основе циклопентана общей формулы Iа

где Z - линейный алкильный (С_nН_2n; n=0-11) радикал;

- фрагмент на основе циклогексана общей формулы Ib

где Y₁ и Y₂ - линейные алкильные (C_nH_2n; n=0-11) радикалы, a R′₁ и R′₂ - атомы Н, Сl, Br, I или F.

В данном изобретении раскрываются структурные формулы соединений общей формулы 1 и способ их практического применения для регуляции коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе производных 1,3-бензодиоксола содержит по весу от 0.0001 до 100% соединений общей формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или вещества, позитивно модифицирующие (повышающие биодоступность, увеличивающие сроки действия и т.д.) свойства данной композиции.

Наиболее близким известным аналогом изобретения является упомянутый выше патент US 7910622 [7], оговаривающий структуру, синтез и использование регуляторов «чувства кворума» общей формулы 2:

По сравнению с соединениями формулы 2 заявляемые соединения общей формулы 1 имеют ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.

Во-первых, в отличие от известных соединений, созданных на основе лактонного кольца и, в этой связи, являющихся близкими структурными аналогами природных авторегуляторных молекул - гомосеринлактонов, заявляемые соединения созданы на основе 1,3-бензодиоксола и, в этой связи, представляют собой структурно неидентичные ГСЛ регуляторные молекулы. Из доступной научной и патентной литературы регуляторы «чувства кворума» на основе 1,3-бензодиоксола не известны.

Во-вторых, благодаря структурным отличиям от природных авторегуляторньгх молекул, проявляющих активность во многих luxI/luxR-подобных системах, заявляемые соединения общей формулы 1 обладают значительно более избирательной (селективной) регуляторной активностью, реализуя ее в отношении cviI/cviR-регулируемой системы биосинтеза виолацеина Chromobacterium violaceum (см. пример 1), а также других биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных виолацеин-продуцирующих бактерий. При этом вероятной причиной селективного действия соединений общей формулы 1 в названных системах «чувства кворума» является их избирательное взаимодействие с регуляторным белком CviR и его близкими гомологами, но не другими LuxR-подобными белками. В свою очередь наиболее тонкие механизмы подобной селективности предположительно определяются конформационным соответствием 1,3-бензодиоксола участку регуляторного белка, в естественных условиях ответственного за связывание лактонного кольца в молекуле ГСЛ. Для понимания сути изобретения также необходимо указать, что достигаемая применением соединений общей формулы 1 регуляция чувства кворума включает, но не исчерпывается только воздействием на продукцию виолацеина, т.к. под контролем регуляторного белка CviR находится ряд целевых генов (оперонов), в том числе ответственных за продукцию экзоферментов и образование биопленок. Использование же теста индукции или ингибирования биосинтеза виолацеина в настоящем изобретении определяется простотой и информативностью регистрируемого проявления регуляторной активности соединений общей формулы 1.

В-третьих, варьирование структуры радикала X в соединениях общей формулы 1 позволяет обеспечить им выраженную способность к усилению или ослаблению коллективного поведения (чувства кворума) у бактерий. Для соединений, структура радикала которых имеет сходство с аналогичным фрагментом в молекуле естественного сигнала - гомосеринлактона, типичной оказывается стимулирующая регуляторная активность (см. пример 1), а для соединений общей формулы 1 с радикалом X, по своей структуре отклоняющимся от естественного сигнала, напротив, ингибирующая активность (см. пример 2). При этом вероятной причиной альтернативного действия соединений общей формулы 1 с различным по структуре радикалом X является формирование геометрически различных конформаций димера из двух регуляторных белков CviR или их гомологов, предшествующего связыванию с ДНК как условия инициации транскрипции целевых генов. Соответственно, наиболее выраженной стимулирующей регуляторной активностью при этом обладают соединения общей формулы 1, при взаимодействии с белками семейства CviR обеспечивающие их взаимную ориентацию с формированием «правильной» конформации, а ингибирующая активность, напротив, достигается формированием «ошибочной» геометрически измененной и потому неспособной к взаимодействию с ДНК конформации димера из двух CviR-подобных белков.

Таким образом, результатом действия соединений общей формулы 1 является специфическая регуляция определенной системы «чувства кворума», направленность которой (усиление или ослабление) может целенаправленно изменяться путем введения в структуру действующего вещества различных по строению радикалов X. Сказанное является важным преимуществом указанных производных по сравнению с большинством ранее описанных соединений (например, общей формулы 2), имитирующих эффект природных авторегуляторов - гомосеринлактонов и потому не обладающих высокой специфичностью.

Защищаемое применение соединений общей формулы 1 подразумевает, в том числе, их использование для управления биотехнологическими процессами, реализуемыми с использованием виолацеин-продуцирующих микроорганизмов (справочно: виолацеин - производное индола, образующееся при окислении триптофана, сине-фиолетовый пигмент с антибактериальной, протистоцидной, противовирусной и другими биотехнологически и фармакологически полезными активностями). В этом случае соединения общей формулы 1 могут вводиться в плотные или жидкие питательные среды в виде растворов, а также применяться в виде чистых веществ или иммобилизованными на различных носителях.

В состав патентуемого изобретения входит также применение соединений общей формулы 1 для регуляции активности других целевых генов (оперонов), в том числе вовлеченных в процессы порчи сельскохозяйственной продукции, а также развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данные соединения могут вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Соединения могут использоваться в виде твердых веществ, растворов или суспензий в воде или других растворителях, а также нанесенными на различные носители. Возможно также использование соединений общей формулы 1 в составе композиций с другими веществами, в том числе позитивно модифицирующими (повышающими биодоступность, увеличивающими сроки действия и т.д.) проявления их биологической активности.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Стимуляция коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

В качестве регуляторов коллективного поведения бактерий, соответствующих общей формуле 1, были использованы соединения 1а-б.

Определение способности данных соединений к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием двух бактериальных тест-систем, в присутствии гексаноил-гомосеринлактона (С₆-ГСЛ), отвечающих синтезом пигмента виолацеина (Chromobacterium violaceum NCTC 13274) или развитием биолюминесценции {Escherichia coli рАЫОЗ). При этом особенностью первого являлась инсерция транспозона Тп5 в ген evil, ответственного за синтез собственного С₆-ГСЛ, с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им регуляторного белка, ответственного за восприятие автоиндуктора [8 - McClean К.Н., et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones. Microbiology, 1997, V.143, Р.3703-3711]. В свою очередь особенностью второго штамма являлось наличие генетической конструкции IwcR+luxI_luxCDABE, кодирующей рецепторный белок LuxR Vibrio fischeri и в присутствии экзогенно вносимого С₆-ГСЛ или С₆-оксо-ГСЛ отвечающей развитием свечения (биолюминесценции) [9 - Lindsay A., Ahmer В.М. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones. J.Bacteriol, 2005, V187(14), Р.5054-5058].

Подобное тестирование проводилось на плотных питательных средах (для получения качественного результата с использованием С. violaceum NCTC 13274), а также жидких питательных средах (для получения количественного результата с использованием С. violaceum NCTC 13274 и Е. coli рАL03). В последнем случае характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация исследованных соединений общей формулы 1, вызывающих индукцию «чувства кворума» на 50% от максимально выраженного эффекта в присутствии естественного авторегулятора С₆-ГСЛ.

Результаты определения регуляторных эффектов соединений 1а-б на синтез пигмента виолацеина культурой С. violaceum NCTC 13274 при проведении тестирования на плотной питательной среде иллюстрируются Фиг.1, где в центре обозначен естественный авторегулятор С₆-ГСЛ. В обобщенном виде результаты приведены в таблице 1.

Из приведенных значений активности видно, что оба использованных микроорганизма интенсивно реагируют кворум-зависимым синтезом виолацеина (С.violaceum NCTC) или развитием биолюминесценции (Е. coli рАL03) в присутствии естественного авторегулятора С₆-ГСЛ. В свою очередь тестируемые соединения общей формулы 1 действуют менее активно, но более специфично, вызывая индукцию синтеза виолацеина, но не развитие биолюминесценции. При этом в основе подобных различий предположительно лежит избирательное сродство соединений la-б к воспринимающему регуляторный сигнал белку CviR при отсутствии такового к LuxR.

Таблица 1 Оценка влияния соединений 1а-б на коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий в тестах на С.violaceum NCTC 13274 и Е. coli рАL03 Соединение Концентрации ЕС50,
характеризующие индукцию «чувства кворума» у бактерий   Синтез пигмента виолацеина С.violaceum NCTC Биолюминесценция Escherichia coli рL03 С₆-ГСЛ 0,5 наноМ 60 наноМ 1а 46,9 мкМ 0 (нет активности) 1б 250 мкМ 0 (нет активности)

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность избирательной индукции «чувства кворума» определенных видов бактерий, входящих в состав полимикробных ассоциаций.

Пример 2. Подавление коллективного поведения («чувства кворума») у бактерий.

В качестве регуляторов коллективного поведения бактерий, соответствующих общей формуле 1, были использованы соединения 1в-е.

Определение способности данных соединений к регуляции «чувства кворума» проводилось с использованием штамма Jantinobacterium lividum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под №В-10136. Данный штамм представляет собой природный изолят, характеризующийся способностью к синтезу пигмента виолацеина под контролем автоиндуктора неидентифицированной природы.

При проведении тестирования J. lividum В-10136 выращивался на жидких питательных средах в отсутствие (контроль) и в присутствии соединений 1в-е (опыт), использованных в диапазоне концентраций от 2 до 1000 мкМ. Характеристикой регуляторного действия служила величина ЕС50 - концентрация исследованных соединений общей формулы 1, вызывающих подавление продукции виолацеина на 50% от максимально выраженного эффекта в контроле.

Результаты определения регуляторных эффектов соединений 1в-е на синтез пигмента виолацеина культурой J. lividum В-10136 при проведении тестирования на жидкой питательной среде иллюстрируются фиг.2, где справа обозначены действующие концентрации соединений общей формулы 1 в среде культивирования; К - контроль. В обобщенном виде результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 Оценка влияния соединений 1в-е на коллективное поведение («чувство кворума») у бактерий в тесте на J. lividum В-10136 Соединение Концентрации ЕС50, характеризующие подавление «чувства кворума» у бактерий 1в 175 мкМ 1 г 112,5 мкМ 1д 87,5 мкМ 1е 100 мкМ

Из приведенных значений активности видно, что все четыре тестированных соединения общей формулы 1 подавляют продукцию виолацеина, что характеризует их как игибиторы коллективного поведения («чувства кворума») J. lividum В-10136. При этом наиболее активным в данном тесте являлось соединение 1д, характеризуемое величиной ЕС50=87,5 мкМ.

Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность подавления «чувства кворума» определенных видов бактерий, для предупреждения вызываемой ими порчи продукции.

Способность соединений общей формулы 1 к подавлению коллективного поведения у бактерий также может быть использована при лечении и профилактике инфекционных заболеваний растений, животных и человека, в том числе вызываемых виолацеин-продуцирующими микроорганизмами видов С.violaceum и J. lividum.

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и фармацевтики, а именно к применению производных 1,3-бензодиоксола формулы (1) в качестве регуляторов коллективного поведения (чувства кворума) у бактерий, в частности для регуляции опосредуемого гомосеринлактонами чувства кворума у виолацеин-продуцирующих биотехнологически полезных, гнилостных и патогенных бактерий, и предназначено для контроля биотехнологических процессов, предупреждения порчи сельскохозяйственной продукции, а также управления бактериальными инфекциями растений, животных и человека. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

1 Применение производных 1,3-бензодиоксола общей формулы 1 в качестве регуляторов коллективного поведения (чувства кворума) у бактерий:

где в общей формуле 1 Х означает:
- линейный алкильный (С₅Н₁₁) радикал;
- линейный бутоксипропиламиновый (C₇H₁₆NO) радикал;
- фрагмент на основе циклопентана общей формулы Iа

где Y - алкильный (C_nH_2n; n=0 или 1) радикал;
- фрагмент на основе циклогексана общей формулы Ib

где Z - алкильный (С_nН_2n; n=0 или 2) радикал.