Композиция на основе ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина, подавляющая систему чувства кворума LuxI/LuxR-типа у бактерий Российский патент 2025 года по МПК A61K31/37 A61K31/496 A61P31/04 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается композиций на основе антибиотиков и малых молекул растительного происхождения, идентифицированных в составе растительных экстрактов, предназначенных для предупреждения, облегчения или лечения патологических состояний живых организмов путем воздействия на физиологию паразитирующего микроорганизма. Изобретение может найти применение при изготовлении лечебных, профилактических и косметических средств контроля бактериальных инфекций человека и животных.

Широкое распространение антибиотико-резистентных форм бактериальных патогенов определило значительный интерес к поиску новых средств и методов лечения инфекций, вызываемых этими патогенами, а также способствовало возникновению ряда ограничений по использованию уже имеющихся антибиотиков. Так в 2015 году Всемирной ассамблеей здравоохранения одобрен Глобальный план действий по устойчивости к противомикробным препаратам. В поддержку глобального плана ВОЗ запустила систему эпидемиологического надзора за устойчивостью микроорганизмов к антибактериальным средствам [Распоряжение Правительства Российской Федерации от 25 сентября 2017 г. № 2045-р]. В России с 2011 года реализуется программа СКАТ (Стратегия Контроля Антимикробной Терапии), в которой отражены общие проблемы антибиотико-резистентности возбудителей нозокомиальных инфекций, стратегические и тактические вопросы рационального применения антимикробных препаратов в стационаре, подходы к сдерживанию антибиотико-резистентности [Программа СКАТ (Стратегия Контроля Антимикробной Терапии) при оказании стационарной медицинской помощи: Российские клинические рекомендации / Под ред. С. В. Яковлева, Н. И. Брико, С. В. Сидоренко, Д. Н. Проценко. - М.: Издательство «Перо», 2018 - 156 с.]. Кроме этого, 30 марта 2019 г. Правительством РФ был утвержден план мероприятий на 2019-2024 годы по реализации Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года [Распоряжение Правительства Российской Федерации от 30 марта 2019 г. № 604-р Об утверждении плана мероприятий на 2019-2024 гг. по реализации Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 г.]. Все вышесказанное определяет актуальность патентуемого изобретения.

Из уровня техники известно, что ципрофлоксацин обладает высокой антибактериальной активностью в отношении многих болезнетворных бактерий и применяется для лечения различных бактериальных инфекций [EP 1880722, RU 2330633, RU 2497524, RU 2326667, RU 2207131], вызываемых бактериальными штаммами, чувствительными к действию ципрофлоксацина. Что касается совместного применения ципрофлоксацина с веществами иной природы, известны композиции на основе ципрофлоксацина с дополнительным антибиотиком из класса фторхинолонов, антибиотика, не относящегося к классу фторхинолонов, синтетического антибактериального средства, антимикотика, фермента или комплекса ферментов, иммуномодулятора, вспомогательного вещества [RU 2682171]; ципрофлоксацина и мальтодекстрина, применяемого в качестве связующего вещества, натриевого карбоксиметилкрахмала в качестве дезинтегрирующего агента, силикагеля, смазывающего вещества [RU 2251420], а также описан пример применения водорастворимого кремнийорганического производного глицерина, проявляющего трансмукозную активность, и ципрофлоксацина [RU 2415144]. Однако большинство описанных патентов не содержат примеров воздействия ципрофлоксацина на систему плотностно-зависимой химической коммуникации у бактерий, именуемую чувством кворума (quorum sensing, QS), несмотря на имеющиеся литературные данные [Gupta P., Chhibber S., Harjai K. Subinhibitory concentration of ciprofloxacin targets quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa causing inhibition of biofilm formation and reduction of virulence // Indian J. of Med.Res. 2016, V. 143 ( 5), P. 643-651; Skindersoe M.E. et al. Effects of antibiotics on quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents and Chemother. 2008, V. 52, P. 3648-3663. doi: 10.1128/AAC.01230-07].

Чувство кворума - это особый вид регуляции экспрессии генов у бактерий, зависящей от плотности их популяции и как следствие концентрации продуцируемых ими низкомолекулярных сигнальных молекул [Mukherjee S., Bassler B.L. Bacterial quorum sensing in complex and dynamically changing environments // Nat.Rev. Microb. 2019, V. 17, P. 371-382]. Главными компонентами системы QS являются сигнальные молекулы - автоиндукторы (АИ), белки-синтазы, их продуцирующие, а также рецепторные белки, в комплексе с АИ активирующие или подавляющие транскрипцию целевых генов [Postat J., Bousso P. Quorum sensing by monocyte-derived populations // Frontiers in Immun. 2019, V. 10. P. 2140]. К настоящему времени описано большое разнообразие систем QS, которые в зависимости от химической природы АИ, характера и локализации воспринимающих их рецепторных белков, можно разделить на несколько типов 1) системы QS грамотрицательных бактерий I (LuxI-LuxR) типа, в которой в качестве АИ выступают различные по структуре ацилированные гомосеринлактоны (АГЛ); 2) системы QS грамположительных микроорганизмов, имеющие в своем составе преимущественно АИ олигопептидной природы; а также QS системы, под контролем которых осуществляются межвидовые связи - 3) система II типа с АИ-2, образуемыми через спонтанную циклизацию 4,5-дигидрокси-2,3-пентандиона и 4) прочие системы QS грамотрицательных бактерий, в которых в качестве сигнальных молекул выступают АИ иной природы (хинолоны, гормоны, жирные кислоты и т.д.) [Wu L., Luo Y. Bacterial quorum-sensing systems and their role in intestinal bacteria-host crosstalk // Frontiers in Immun. 2021, V. 12, P.611413. doi: 10.3389/fmicb.2021.611413].

QS имеет огромное значение, как для бактерий, так и для других организмов, так как под его контролем находится большое количество фенотипических проявлений: синтез антибиотиков и других вторичных метаболитов, образование биопленок, продукцию факторов вирулентности и многое другое [Rutherford S.T., Bassler B.L. Bacterial quorum sensing: its role in virulence and possibilities for its control // Cold Spring Harb Perspect Med. 2012, V. 2 (11), P. a012427. doi: 10.1101/cshperspect.a012427]. Поэтому ингибирование системы QS патогенных бактерий является перспективным направлением в области разработки новых лекарственных средств и методов лечения, основанных на принципиально ином механизме действия в отношении возбудителя бактериальной природы, что в сегодняшних условиях может стать выходом из сложившейся ситуации широкого распространения антибиотико-резистентных штаммов бактерий.

Поиск имеющихся патентных источников за последние 8 лет показал актуальность предлагаемого подхода по разработке средств и способов ингибирования системы QS, описанных во многих охранных документах [RU 2542464, US 2015/0306067 , CN104327020, US 20180078526, WO2021242461, US 2020140489, US 2019298872 и др].

Согласно литературным данным, ципрофлоксацин в субингибиторных концентрациях способен ингибировать образование биопленок и экспрессию факторов вирулентности у Pseudomonas aeruginosa [Gupta P., Chhibber S., Harjai K. Subinhibitory concentration of ciprofloxacin targets quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa causing inhibition of biofilm formation and reduction of virulence // Indian Journal of Medical Research. 2016. V. 143. N. 5. P. 643-651], а также подавлять синтез автоиндукторов С₁₂-АГЛ и С₄-АГЛ у этого же штамма [Skindersoe M.E. [et al.] Effects of antibiotics on quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2008. V. 52. P. 3648-3663. doi: 10.1128/AAC.01230-07]. Кроме того, описаны композиции ципрофлоксацина с кверцетином [Taghavi T. et al. Anti-quorum sensing activity of quercetin in combination with imipenem and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa PAO1 // Res. Square. 2022, https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-435536/v1], гваяколом [Mangal S., Chhibber S., Singh V., Harjai K. Guaiacol augments quorum quenching potential of ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa // J. of Applied Microb. 2022, V. 133 (4), P. 2235-2254. https://doi.org/10.1111/jam.15787] и эфирным маслом Eucalyptus camaldulensis [Al-Qaysi Al-M.K., Al-Ouqaili M.T.S., Al-Meani S.A.L. Ciprofloxacin- and gentamicin-mediated inhibition of Pseudomonas aeruginosa biofilms is enhanced when combined the volatile oil from Eucalyptus camaldulensis // System. Rev. in Pharm. 2020, V. 11(7), P. 98-105], эффективно ингибирующие систему QS у P. aeruginosa.

В свою очередь, данные об использовании кумаринов в качестве ингибиторов системы QS включают несколько патентов на изобретение. Кумарины - класс природных соединений на основе 5,6-бензо-α-пирона (лактона цис-ортогидроксикоричной кислоты) с широкой биологической активностью. Они достаточно часто встречаются в высших растениях, где локализованы преимущественно в корнях, коре и плодах, в меньшей степени в стеблях и листьях, откуда легко экстрагируются в лабораторных условиях [Deryabin D., Galadzhieva A., Kosyan D., Duskaev G. Plant-derived inhibitors of AHL-mediated quorum sensing in bacteria: Modes of action // Intern. Journal of Mol. Scienc. 2019, V. 20 (22), P. 5588. doi: 10.3390/ijms20225588]. Описано ингибирующее действие кумарина и скополетина [RU 2616237], а также 7,8-дигидрокси-4-метилкумарина [RU 2744456] на систему QS LuxI/LuxR-типа у бактерий. Еще одним примером является использование пеурутеницина - соединения кумаринового ряда, обладающего антибактериальной активностью в отношении культур клеток условно-патогенных бактерий штаммов Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Escherichia coli и способностью подавлять биопленкообразование указанными штаммами бактерий [RU 2764522]. Что касается используемого в данной заявке 7-гидроксикумарина, известно, что это производное кумарина обладает ингибирующим эффектом в отношении системы QS LuxI/LuxR-типа Chromobacterium subtsugae ATCC 31532 (ранее C. violaceum) [Deryabin D., Inchagova K., Rusakova E., Duskaev G. Coumarin’s anti-quorum sensing activity can be enhanced when combined with other plant-derived small molecules // Molecul. 2021, V. 26, P. 208. doi: 10.3390/molecules26010208], системы QS II типа у E. coli O157:H7 [Lee J.-H. et al. Coumarins reduce biofilm formation and the virulence of Escherichia coli O157:H7 // Phytomed. 2014, V. 21 ( 8-9), P. 1037-1042. doi: 10.1016/j.phymed.2014.04.008] и системы грамположительных бактерий - S. aureus [Scoffone V.C., Trespidi G., Chiarelli L.R., Barbieri G., Buroni S. Quorum sensing as antivirulence target in cystic fibrosis pathogens // Internat. J. of Mol. Scienc. 2019, V. 20. (8), P. 1838. https://doi.org/10.3390/ijms20081838].

Все вышеизложенное свидетельствует о значительном потенциале совместного использования композиции ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина в качестве ингибитора системы QS LuxI/LuxR-типа у бактерий, использующих плотностно-зависимую химическую коммуникацию для реализации своего патогенного потенциала.

Задачей данного изобретения является разработка композиции на основе антибиотика ципрофлоксацина и малой молекулы растительного происхождения 7-гидроксикумарина, проявляющей выраженный аддитивный эффект при регуляции системы QS патогенных и гнилостных бактерий.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является композиция кумарина с аминогликозидными антибиотиками, описанная в патенте «Применение кумарина и его производных в качестве ингибиторов системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий» [RU 2616237]. Данное изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к композиции, ингибирующей QS. (1) Отличием является то, что эта композиция состоит из кумарина и аминогликозидных антибиотиков (канамицина, гентамицина и амикацина). В нашем же случае композиция включает ципрофлоксацин и 7-гидроксикумарин. (2) Еще одним отличием является то, что ципрофлоксацин характеризуется более широким спектром биологической активности, воздействуя как на грамотрицательные, так и на грамположительные бактерии, наиболее эффективен в отношении P. aeruginosa, по сравнению с аминогликозидными антибиотиками, а также менее токсичен в отношении человека и животных, что позволяет его использовать в медицинской практике с меньшими рисками осложнений. (3) Кроме того, предлагаемое применение композиции ципрофлоксацина с 7-гидроксикумарином в качестве ингибитора системы QS LuxI/LuxR-типа у бактерий ранее не описано.

В настоящем изобретении заявляемая задача решается совместным применением раствора ципрофлоксацина («Эльфа Лабораториз», Индия), приготовленном в жидкой питательной среде, в концентрациях, мгк/мл: от 0,0006 до 0,781 и раствора 7-гидроксикумарина («Merck», США), также приготовленного в жидкой питательной среде, в концентрациях от 0,5 до 10130. В соответствии с изобретением регуляторный препарат (композиция) на их основе содержит, мкг/мл: 0,001-0,025 ципрофлоксацина и 5-129 7-гидроксикумарина, формируя индивидуальное соотношение антибиотик/малая молекула растительного происхождения.

Композицию получали путем смешивания растворов ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина в двукратных разведениях, вносимых перпендикулярно друг к другу. Совместное действие антибиотика и малой молекулы растительного происхождения оценивали с использованием виолацеин-продуцирующего штамма C. subtsugae ATCC 31532. Данный штамм обладает стереотипно-устроенной двухкомпонентной системой QS LuxI/LuxR-типа, при работе которой синтезируемый геном cviI автоиндуктор - ациллированный гомосеринолактон (С₆-АГЛ) взаимодействует с рецепторным белком, кодируемым геном cviR, что приводит к экспрессии оперона ABCDE, ответственного за синтез сине-фиолетового пигмента виолацеина. Данный пигмент можно зафиксировать визуально либо аппаратно по измерению его оптической плотности при длине волны 585-600 нм, что делает данный биосенсор удобным инструментом для изучения QS-зависимых процессов у бактерий [Stauff D.L., Bassler B.L. Quorum sensing in Chromobacterium violaceum: DNA recognition and gene regulation by the CviR receptor // J. of 9Bacteriol. 2011, V. 193. (P), 3871-3878. doi: 10.1128/JB.05125-11].

Использование заявляемой композиции целесообразно по нескольким причинам. Во-первых, комбинация ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина обладает разнонаправленным действием. Так механизм действия ципрофлоксацина заключается в воздействии на синтазу сигнальных молекул, тем самым нарушается синтез АГЛ [Gupta P., Chhibber S., Harjai K. Subinhibitory concentration of ciprofloxacin targets quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa causing inhibition of biofilm formation and reduction of virulence // Indian Journal of Medical Research. 2016. V. 143. N. 5. P. 643-651]. В свою очередь, 7-гидроксикумарин подавляет QS через внутриклеточные регуляторные пути, связанные с секрецией III типа и метаболизмом циклического дигуанилата (c-di-GMP) [Deryabin D., Galadzhieva A., Kosyan D., Duskaev G. Plant-derived inhibitors of AHL-mediated quorum sensing in bacteria: Modes of action // International Journal of Molecular Sciences. 2019. V. 20. N 22. P. 5588. doi: 10.3390/ijms20225588]. Данное обстоятельство может помочь повысить эффективность препарата даже в отношении резистентных к антибиотику штаммов. Во-вторых, при совместном использовании названных веществ значительно снижаются концентрации каждого из них, что может способствовать уменьшению их негативного влияния на организм человека и животных, связанного с токсическим эффектом. В-третьих, ципрофлоксацин и 7-гидроксикумарин помимо QS-ингибирующей активности обладают собственным антибактериальным эффектом, что позволяет охватить весь спектр антимикробного действия заявляемой композиции.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующим примером.

Пример. Композиция на основе ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина, подавляющая систему чувства кворума LuxI/LuxR-типа у бактерий.

В ячейки 96-луночного планшета из прозрачного пластика в перпендикулярных друг другу направлениях вносились двукратные разведения исследуемых веществ, приготовленных в жидкой питательной среде, в результате чего каждая лунка содержала индивидуальное соотношение ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина, как показано на Фиг. 1. Контролями явились ряды разведений, включающие в себя только 7-гидроксикумарин (К1) или ципрофлоксацин (К2), и лунка с питательной средой, не содержащая ни одного из исследуемых веществ - контроль роста (КР). После этого планшет инокулировали 1-суточной культурой C. substsugae ATCC 31532 в объеме 20 мкл и инкубировали в термостате в течение 24 ч при температуре +27°С.

Анализ результатов проводили путем регистрации оптической плотности бактериальной биомассы при длине волны 450 нм и экстрагируемого сине-фиолетового пигмента виолацеина при длине волны 600 нм. Антибактериальный эффект композиции выражали значениями минимальных ингибирующих концентраций - МИК₁₀₀ и МИК₅₀, соответствующими 100 и 50 процентному подавлению роста тест-культуры. Эффективность ингибирования системы QS описывали значениями эффективных концентраций - EC₁₀₀ и EC₅₀, соответствующими 100 и 50 процентному ингибированию синтеза пигмента. Оценку совместного использования ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина проводили с помощью изоболографического анализа по методике, предложенной Tallarida [Tallarida R.J. An overview of drug combination analysis with isobolograms: perspectives in pharmacology // J. of Pharmacol. and Experim. Therapeutics. 2006, V. 3 (19), P. 1-7]. Суть этого метода заключается в определении положения экспериментальных точек, координатами которых являются концентрации компонентов, относительно изоболы, соединяющей значения ЕС₅₀ каждого из веществ, взятого по отдельности. Аддитивным считается эффект, при котором точки расположены вдоль линии изоболы, супераддитивным, если точки расположены ниже линии изоболы, инфрааддитивный эффект отражает положение точек над линией изоболы.

Пример совместного использования ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина иллюстрирует Фиг. 1, зависимость оптической плотности биомассы и экстрагированного пигмента от концентрации ципрофлоксацина (а) и 7-гидроксикумарина (б) представлена на Фиг. 2, а изоболографический анализ влияния заявляемой композиции на систему QS LuxI/LuxR-типа показан на Фиг. 3.

Собственная антибактериальная активность ципрофлоксацина, характеризуемая значением МИК₁₀₀, была равной 0,391 мкг/мл, в то время как 100%-ое ингибирование системы QS, выражаемое ЕС₁₀₀=0,098 мкг/мл (Фиг. 2а). Отношение МИК₅₀/ЕС₅₀, наиболее полно характеризующее интенсивность ингибирования системы QS, равнялось 2,1. В свою очередь, антибактериальный эффект 7-гидроксикумарина характеризовался значением МИК₁₀₀=2530 мкг/мл, а ингибирование системы QS - ЕС₁₀₀=630 мкг/мл (Фиг. 2б). Отношение МИК₅₀/ЕС₅₀ было равным 3,4. На этом фоне, при исследовании способности композиции антибиотика и малой молекулы растительного происхождения ингибировать систему QS C. substsugae в диапазоне концентраций ципрофлоксацина от 0,0006 до 0,781 мкг/мл и 7-гидроксикумарина от 0,5 до 10130 мкг/мл было выявлено, что интенсивность QS-ингибирующего эффекта возрастала до 30 раз по сравнению с использованием каждого компонента композиции по отдельности, о чем свидетельствует расположение экспериментальных точек ниже линии изоболы (Фиг. 3). Однако обязательным условием при формировании супераддитивной композиции является соблюдение следующих концентраций компонентов: 0,001-0,025 мкг/мл - для ципрофлоксацина, 5-129 мкг/мл - для 7-гидроксикумарина, поскольку именно эти диапазоны концентраций дают эффект усиления QS-ингибирующей активности данной композиции.

Положительным результатом использования заявляемого изобретения является усиление как антибактериального, так и QS-ингибирующего эффектов ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина, что способствует снижению объемов применения антибиотика, не утрачивая при этом его эффективности в отношении антибиотико-резистентных форм бактериальных патогенов растений, животных и человека.

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, а именно к композиции на основе ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина. Предлагается композиция на основе ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина, подавляющая систему чувства кворума LuxI/LuxR-типа у бактерий при следующем соотношении компонентов, при формировании композиции, мкг/мл: ципрофлоксацин - от 0,001 до 0,025, 7-гидроксикумарин - от 5 до 129. Использование изобретения обеспечивает получение композиции, обладающей выраженным аддитивным эффектом при ингибировании системы чувства кворума (QS) и усиленным антибактериальным эффектом, а также позволяет снизить объем применяемого антибиотика. 3 ил., 1 пр.

Композиция на основе ципрофлоксацина и 7-гидроксикумарина, подавляющая систему чувства кворума LuxI/LuxR-типа у бактерий при следующем соотношении компонентов, при формировании композиции, мкг/мл:

ципрофлоксацин - от 0,001 до 0,025;

7-гидроксикумарин - от 5 до 129.