СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2014 года по МПК G09B23/28 A61K35/39 A61P3/10 

Изобретение относится к области медицины, а именно хирургии, и может быть применено в качестве способа лечения сахарного диабета.

Известен способ лечения сахарного диабета, в котором пациенту вводят сульфатид, содержащий 14-18 углеродных атомов в цепи жирной кислоты, что приводит к повышению сохранности резерва инсулина в островках Лангерганса (1 - Патент РФ 2266123). Данный способ принят за аналог.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ лечения сахарного диабета путем трансплантации бета-клеток поджелудочной железы млекопитающих (Патент РФ №2135193, A61K 35/39, 1997).

Однако в определенной мере при использовании способа-прототипа возможно возникновение иммунологического конфликта.

Целью изобретения является уменьшение количества осложнений, связанных с развитием тканевой несовместимости.

Технический результат достигается тем, что в качестве вещества используют инсулин-продуцирующие клетки в дозе 300-400 мг/кг, вводимые подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы.

Способ осуществляется следующим образом.

Животному (мыши линии C57BL/6 дикого типа массой 18-22 г возраста 8-12 недель) в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 3-4 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 3-4 мм³.

Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)/Mn коллагеназы 1 типа и 0.3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 30-45 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и центрифугируют со скоростью 1200 об/мин 5 мин. Инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM/F12), 5% сыворотка эмбриональная телячья (FBS), 10^-8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактор роста фибробластов (bFGF) 5 мкг/мл, эпидермидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3х10⁵ на диаметре 100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина, глюкагона с помощью полимеразной цепной реакции.

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля, добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

6 мышам линии C57BL/6 Rag-1/- массой 18-22 г возрастом 8-12 недель (самцы) моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 300-400 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 400-500 мг/dL (норма у мышей 250 мг/dL).

Согласно заявленному способу, лечение диабета осуществляют введением матрикса с В-клетками в дозе 300-400 мг/кг подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мышам-самцам линии C57BL/6 Rag-1/- с экспериментально вызванным диабетом.

Морфологический контроль повреждения В-клеток островков Лангерганса осуществляется следующим образом. В течение месяца мыши находятся под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышей усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса и поджелудочную железу, заключают в матричную среду для криотомии Tissue-Tek и замораживают. Для иммуногистологического анализа готовят гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду. При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом определяют дистрофию В-клеток островков Лангерганса. Увеличена микрокапиллярная сеть островков Лангерганса. Отмечается дистрофия отдельных ациноцитов и эпителиальных клеток Вирсунгова протока. Увеличено кровенаполнение внешнесекреторной части поджелудочной железы. В совокупности с динамикой уровня глюкозы, данными по окрашиванию антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод о адекватном моделировании сахарного диабета I типа. В образцах матрикса обнаруживают положительное окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду, что говорит о функциональной активности трансплантированных клеток в матриксе.

При гистологическом исследовании поджелудочной железы мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия экзогенных культивированных В-клеток, согласно заявляемому способу, выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса. Уменьшена выраженность микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинарной части поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Мыши массой 20 г в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 3 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 3 мм. Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)/Mn коллагеназы I типа и 0,3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 30 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и ЦФ 1200 RPM 5 мин: инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: DMEM/F12, 5% FBS, 10^-8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактор роста фибробластов bFGF 5 мкг/мл, эпидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3×10⁵ на ⌀100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина, глюкагона с помощью Real time-PCR;

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля, добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

Мыши линии C57BL6 Rag-1/-1 моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 300 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 400 мг/dL (норма у мышей 250 мг/dL).

Матрикс с инсулин-продуцирующими клетками в дозе 300 мг/кг вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мыши-самцу весом 25 г., линии C57BL6 Rag-1/-1 с экспериментально вызванным диабетом. В течение месяца мышь находится под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышь усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса, заключают в Tissiie-Tek и замораживают. Далее подготавливают гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду.

При гистологическом исследовании - мыши с экспериментальным диабетом В-клетки островков Лангерганса в состоянии дистрофии, с увеличенной микрокапиллярной сетью. Отмечается дистрофия отдельных ацинарных и эпителиальных клеток Вирсунгова протока. Увеличено кровенаполнение ацинусов поджелудочной железы. В совокупности с динамикой уровня глюкозы (400 мг/dL), результатами окрашивания биоптатов антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод о адекватном моделировании сахарного диабета I типа.

Поджелудочная железа мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия культивированных В-клеток, выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса. Отмечается уменьшение микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинусов поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы (280 мг/dL) и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

Пример 2

Животному (мыши массой 25 г) в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 4 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 3,5 мм³.

Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)мл коллагеназы I типа и 0,3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 40 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и ЦФ 1200 R-PM 5 мин; инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: DMEM/F12, 5% FBS, 10^-8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактор роста фибробластов bFGF 5 мкг/мл, эпидермидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3×10³ на 0100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина, глюкагона с помощью Real time-PCR;

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля, добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

Мыши линии C57BL6 Rag-1/-1 моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 380 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 450 мг/dL (норма у мышей 250 мг/dL).

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом определяют дистрофию многочисленных В-клеток островков Лангерганса и А-клеток ацинусов. Увеличена микрокапиллярная сеть островков Лангерганса и кровенаполнение внешнесекреторной части поджелудочной железы. Отмечается дистрофия эпителиальных клеток Вирсунгова протока. В совокупности с динамикой уровня глюкозы, данными по окрашиванию антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод об адекватном моделировании сахарного диабета I типа.

Матрикс с инсулин-продуцирующими клетками в дозе 400 мг/кг вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мыши-самцу весом 25 г., линии C57BL6 Rag-1/-1 с экспериментально вызванным диабетом. В течение месяца мышь находится под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышь усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса. заключают в Tissue-Tek и замораживают. Далее подготавливают гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду.

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия культивированных В-клеток выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса и А-клеток ациноцитов. Уменьшена выраженность микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинарной части поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы (250 мг/dL) и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

Пример 3

Животному (мышь массой 30 г) в щадящих условиях проводят верхнюю срединную лапаротомию. Входят в сальниковую сумку, находят головку поджелудочной железы и отступя 4 мм от Вирсунгова протока производят забор ткани поджелудочной железы в объеме 4 мм.

Осуществляют ферментативную диссоциацию тканей поджелудочной железы мыши в присутствии 300 (CDU)/мл коллагеназы 1 типа и 0,3 мг/мл деоксирибонуклеазы при 37°C с постоянным перемешиванием 45 мин.

Полученную суспензию фильтруют через клеточное сито с размером ячейки 75 мкм, и ЦФ 1200 RPM 5 мин; инсулин-продуцирующие клетки, находящиеся в состоянии небольших клеточных агрегатов, под микроскопом отбирают и переносят в чашку Петри. При дальнейшем культивировании в специальной среде Kubota's Medium на непокрытом пластике производят селекцию инсулин-продуцирующих клеток от клеток матрикса. Далее культуру поддерживают на среде: DMEM/F12, 5% FBS, 10^-8 М гидрокортизона, 5 мкг/мл трансферина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, фактора роста фибробластов bFGF 5 мкг/мл, эпидермального фактора роста EGF 20 нг/мл.

Формируют колонии в чашках Петри. Клетки высаживают с плотностью 3×10⁵ на ⌀100 мм в среде Kubota's Medium. Колонии образуются через 3 дня. Колонии фенотипически гетерогенны, в центре расположены малые недифференцированные клетки, по краям колоний - более дифференцированные. Контролируют чистоту клеточной линии по степени экспрессии основных гормонов поджелудочной железы: инсулина, соматостатина. глюкагона с помощью Real time-PCR;

Клетки помещают в трехмерный матрикс: смешивают 100 мкл клеток (0,5 млн) с 0,5 мл изотропного геля. добавляют 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода.

Мыши линии C57BL6 Rag-1/-1 моделируют диабет I типа путем инъекции стрептозоцина внутримышечно 5 дней подряд, общее количество введенного препарата 400 мг/кг. Через две недели уровень глюкозы в крови у животного достигает 500 мг/dL.

Матрикс с инсулин-продуцирующими клетками в дозе 350 мг/кг вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы мыши-самцу весом 30 г., линии C57BL6 Rag-1/-1 с экспериментально вызванным диабетом. В течение месяца мышь находится под контролем уровня глюкозы. Через 1 мес мышь усыпляют парами изофлюрана в течение 3 минут в камере. Извлекают образцы матрикса, заключают в Tissue-Tek и замораживают. Далее подготавливают гистологические криосрезы толщиной 7 мкм и проводят окрашивание антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду.

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом определяют дистрофию В-клеток островков Лангерганса. Увеличена микрокапиллярная сеть островков Лангерганса. Отмечается дистрофия отдельных ациноцитов и эпителиальных клеток Вирсунгова протока. Увеличено кровенаполнение внешнесекреторной части поджелудочной железы. В совокупности с динамикой уровня глюкозы, данными по окрашиванию антителами к глюкагону, соматостатину и панкреатическому полипептиду и данными гистологического исследования делают вывод об адекватном моделировании сахарного диабета I типа.

При гистологическом исследовании мышей с экспериментальным диабетом в условиях воздействия культивированных В-клеток выявляют дистрофию единичных В-клеток островков Лангерганса. Уменьшена выраженность микрокапиллярной сети островков Лангерганса. Дистрофия сохраняется в отдельных эпителиальных клетках Вирсунгова протока. Кровенаполнение ацинарной части поджелудочной железы сохранно. В совокупности с положительной динамикой уровня глюкозы (250 мг/dL) и данными гистологического исследования делают вывод о коррекции сахарного диабета I типа в эксперименте.

По заявляемому способу проведено 25 экспериментов. Результаты лечения подтвердили достижение цели изобретения - уменьшение количества осложнений, связанных с развитием тканевой несовместимости.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения вопросов лечения сахарного диабета. Способ включает введение инсулин-продуцирующих клеток в дозе 500 тыс. клеток в растворе с 0,5 мл изотропного геля, 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода. Препарат вводят подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы. Способ уменьшает число осложнений, связанных с развитием тканевой несовместимости. 3 пр.

Способ лечения сахарного диабета в эксперименте, включающий введение препарата клеток, отличающийся тем, что используют инсулин-продуцирующие клетки в дозе 500 тыс. клеток в растворе с 0,5 мл изотропного геля, 10 мкл 15% аскорбиновой кислоты и 10 мкл 0,1% перекиси водорода, вводимые подкожно в переднюю брюшную стенку в области проекции поджелудочной железы.