Средства, улучшающие процесс обучения, памяти и когнитивные функции, а также для симптоматической терапии при аутистических расстройствах

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии и предназначено для улучшения процессов обучения, памяти, когнитивных функций у здоровых лиц и лиц с психическими дефицитными расстройствами, а также для лечения симптомов аутизма.

После того, как в центральной нервной системе (ЦНС) выявлено присутствие гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и установлена ее роль в формировании нейромедиаторных процессов, было предложено использовать эту аминокислоту в качестве лечебного средства. В настоящее время существует спектр препаратов с ноотропным действием, в основе которого лежит влияние на ГАМК систему: оксибутират, пикамилон, никотинамид, фенибут и другие.

Известно, что ГАМК является основным ингибирующим нейромедиатором ЦНС млекопитающих. Действие ГАМК реализуется путем ее взаимодействия с ионотропными и метаботропными рецепторами, приводящего к их активации. Рецепторы ГАМК(А) и ГАМК(С) относятся к ионнотропным, а рецепторы ГАМК(В) к метаботропным. ГАМК и ее агонисты используются в качестве средств для лечения различных расстройств ЦНС. Термин агонист используется для обозначения веществ, активирующих клеточный сигналинг, т. е. агонист ГАМК действует посредством активации ГАМК-рецептора.

Особое место среди заболеваний ЦНС занимают аутистические расстройства, которые трудно поддаются лечению медикаментозными средствами. Аутизм является расстройством со сложной симптоматикой, обусловленной нарушением развития головного мозга. К числу основных симптомов заболевания относят задержку умственного развития, трудности в общении с другими людьми вербального и невербального характера, отсутствие друзей, ограниченность интересов, для людей с аутистическими расстройствами характерно стереотипное поведение и мышление, повторение одних и тех же движений. Часто люди, страдающие аутизмом, испытывают страхи, впадают в депрессию или в необъяснимый гнев; случаются приступы эпилепсии, нередко нарушается сон, возникают проблемы с функционированием желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

Для лечения людей с аутизмом применяют антидепрессанты и широкий спектр психотропных средств с целью снижения симптоматики и улучшения поведенческих реакций. Применение психотропных средств оказывает в определенных случаях положительное влияние на поведение больных, но вызывает побочное неблагоприятное действие. В целом современные лекарственные средства имеют ограниченное применение при аутистических расстройствах.

В патенте US 8278276 B2 /A61K31/195, A61K38/00, опубликован 02.10.2012г., в качестве средства для лечения аутизма и других расстройств, связанных с нарушением развития головного мозга предложены композиции, в состав которых входят агонисты ГАМК рецепторов. Например, баклофен (бета-(Аминометил)-4-хлорбензолпропановая кислота), который является агонистом ГАМК(В) рецепторов.

Композиция, содержащая баклофен, обладает способностью снижать выраженность симптомов или частоту их возникновения при аутистических расстройствах. Однако лечебное действие композиции проявлялось избирательно, и степень ее эффективности носила индивидуальный характер (прототип).

Задача, решаемая изобретением, сводится к созданию эффективного средства для симптоматической терапии аутистических расстройств, лишённого указанных недостатков. Технический результат заключается в повышении эффективности лечения нарушений когнитивных функции и расширении числа симптомов, устраняемых препаратом при аутистических состояниях.

Поставленная задача достигается посредством синтеза новых химических соединений тетразолсодержащих производных 4-амино-3-фенилмасляной кислоты формулы (I):

(I)

X = O, N

R₂= H, CH₃

X=O, R₁ = метил, изопропил, этил, H.

X =N, R₁ = фенэтил, 2-(пиридин-4-ил)этил, бензил, бензилпиперазинил, изопропил.

Изобретение также относится к лекарственному средству для улучшения процессов обучения, памяти, когнитивных функций у здоровых лиц и лиц с психическими дефицитными расстройствами, для лечения симптомов аутизма в виде капсул, таблеток или инъекций в фармацевтически приемлемой упаковке, содержащему активное начало и фармацевтически приемлемый носитель, в котором в качестве активного начала содержит эффективное количество соединения формулы (I).

Изобретение также относится к способу улучшения процессов обучения, памяти, когнитивных функций у здоровых лиц и лиц с психическими дефицитными расстройствами, лечения симптомов аутизма, заключающийся во введении пациенту фармакологических средств, содержащих эффективные количества соединений формулы (I) в дозах 0,83-12,5 мг/кг массы тела (в пересчете из эффективной дозы на крысах 5-150 мг/кг массы тела) по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Понятие «эффективное количество», используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества соединений формулы (I), которое вместе с их показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной фармацевтической композиции или лекарственной форме.

При необходимости фармацевтические композиции могут содержать вспомогательные средства, такие как наполнители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы, например, такие добавки могут быть выбраны из микроцеллюлозы, лактозы, стеарата кальция, крахмала. Выбор и соотношение указанных компонентов зависит от природы и способа назначения и дозировки.

Методика получения соединений формулы (I) описана в статье (Sergey M. Putis, Elena S. Shuvalova, and Vladimir A. Ostrovskii. Tetrazole-containing derivatives of 4-amino-3-phenylbutanoic acid. // ARKIVOC. – 2009. – Vol. iv. – P. 64-68).

Новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве средств для улучшения процессов обучения, памяти, когнитивных функций у здоровых лиц и лиц с психическими дефицитными расстройствами, а также для лечения симптомов аутизма используется вновь синтезированные соединения на основе ГАМК тетразол-содержащих производных 4-амино-3-фенилмасляной кислоты. Для специалиста эти свойства явным образом не вытекают из уровня техники.

Для изучения фармакологической активности заявленных препаратов, проведены модельные эксперименты по выявлению у исследуемых соединений ноотропных свойств и способности снижать выраженность аутистических симптомов или частоту их возникновения.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы «Statistica V. 6.0.», используя однофакторный дисперсионный анализ; непараметрический анализ для независимых переменных (U-тест Манна-Уитни) и парный критерий Стьюдента для внутригрупповых сравнений.

Пригодность заявляемых препаратов подтверждена рядом экспериментальных данных.

Указанные соединения формулы (I) получены по следующей схеме 1 :

Схема 1

Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения и рисунками:

На Фиг.1 представлена нумерация отверстий пола актометра, где

1, 2, 3, 4 – угловые отверстия;

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 – пристенные отверстия;

13,14, 15, 16 – отверстия в центре установки

На Фиг. 2 представлено число заглядываний в отверстия арены аутбредных мышей и мышей линии BALB/c, где * обозначено p<0,05 относительно группы «Аутбредные»

На Фиг. 3 - Влияние заявляемого соединения Т-001 на число заглядываний в отверстия арены мышей линии BALB/c, где # обозначено p<0,05 относительно группы «BALB/c»

Пример 1. 3-фенил-4-(1Н-тетразол-1-ил)бутановая кислота (T_001).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 12.23 (уш. с, 1Н, ОН), 9.01 (с, 1Н, НС⁵), 7.32 (m, 5Н, C₆H₅), 4.78 (m, 2H, СН₂), 3.72 (квинтет, J 8.5, 1Н, СН), 2.74 (m, 2Н, СН₂). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 172.4, 151.1, 140.0, 128.5, 127.7, 127.3, 51.9, 42.0, 37.5. ESI MS 233(M⁺+1). Найдено, % C, 56.75; H, 5.28; N, 24.01. C₁₁H₁₂N₄O₂ (232). Вычислено, %: C, 56.89; H, 5.21; N, 24.12. ИК-спектр, ν, см^-1: 3126, 2985, 2929, 1708, 1456, 1260, 1139, 1072, 1018, 981, 734.

Пример 2. Метил-4-(5-метил-1Н-тетразол-1-ил)-3-фенилбутанат (Т_002).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 7.40 (м, 5Н, C₆H₅), 3.40 (с, 3H, СН₃О), 4.73 (м, 2Н, СН₂), 3.69 (квинтет, J 8.5 Hz, 1Н, СН), 2.70 (м, 2H, СН₂), 2.40 (s, 3Н, СН₃-С⁵). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 171.5, 155.3, 142.1, 128.2, 127.6, 126.8, 52.3, 50.9, 42.1, 37.7. ESI MS 261 (M⁺+1). Найдено, % C, 59.20; H, 6.53; N, 21.01. C₁₃H₁₆N₄O₂ (260). Вычислено, %: C, 59.99; H, 6.20; N, 21.52. ИК-спектр, ν, см^-1: 2980, 2960, 1732, 1450, 1265, 1140, 1070, 1010, 980, 730, 700.

Пример 3. 3-фенил-N-(2-(пиридин-4-ил)этил-4-(1Н-тетразол-1-ил)бутанамид (Т_003).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 8.92 ( с, 1Н, НС⁵), 8.45 (дд, 2Н, J¹ 4.38, J² 1.53, СН₂N(пиридин), 7.32 (m, 5Н, C₆H₅), 7.24 (дд, 2Н, J¹ 4.38, J² 1.53, СН₂N(пиридин)), 4.82 (m, 2H, СН₂), 3.74 (квинтет, J 8.5 Hz, 1Н, СН), 3.42 (м, 2Н, СН₂), 2.78 (м, 2Н, СН₂), 2.59 (м, 2Н, СН₂), Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 171.9, 150.7, 149.2, 147.6, 143.2, 128.1, 127.2, 123.2, 52.1, 42.3, 40.8, 39.1, 34.7. ESI MS 337 (M⁺+1). Найдено, % C, 64.01; H, 5.88; N, 24.91; C₁₈H₂₀N₆O (336). Вычислено, %: C, 64.27; H, 5.99; N, 24.98;.

Пример 4. N-фенил-3-фенил-4-(1Н-тетразол-1ил)бутанамид (Т_004).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 8.84 ( с, 1Н, НС⁵),

7.31-7.05 (m, 10Н, арил), 4.85 (m, 2H, СН₂), 3.67 (квинтет, J 8.5 Hz, 1Н, СН),

3.42 (м, 2Н, СН₂), 3.34 (м, 2Н, СН₂), 2.42 (м, 2Н, СН₂). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 172.2, 151.2, 149.5, 148.2, 142.9, 128.1, 126.9, 123.4, 52.6, 43.1, 40.6, 39.5, 33.6. ESI MS 336 (M⁺+1). Найдено, % C, 67.81; H, 6.12; N, 20.67; C₁₉H₂₁N₅O (335). Вычислено, %: C, 68.04; H, 6.31; N, 20.88;.

Пример 5. N-изопропил-3-фенил-4-(1Н-тетразол-1-ил)бутанамид (Т_005).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 9.21 (с, 1Н, НС⁵), 7.45 (m, 5Н, C₆H₅), 4.69 (m, 2H, СН₂), 3.92 (м, 1H, СН(СН₃)₂), 3.72 (квинтет, J 8.5, 1Н, СН), 2.74 (m, 2Н, СН₂). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 168.7, 150.7, 143.2, 127.5, 126.7, 126.3, 52.9, 42.1, 41.9, 39.3, 22.7. ESI MS 274(M⁺+1). Найдено, % C, 61.52; H, 7.01; N, 25.62. C₁₄H₁₉N₅O (273). Вычислено, %: C, 61.29; H, 6.93; N, 25.02.

Пример 6. 4-(5-метил-1Н-тетразол-1-ил)-3-фенил-N-(2-(пиридин-4-ил)этил)бутанамид (Т_006).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 8.45 (дд, 2Н, J¹ 4.38, J² 1.53, СН₂N(пиридин)), 7.32 (m, 5Н, C₆H₅), 7.24 (дд, 2Н, J¹ 4.38, J² 1.53, СН₂N(пиридин)), 4.82 (m, 2H, СН₂), 3.74 (квинтет, J 8.5 Hz, 1Н, СН), 3.42 (м, 2Н, СН₂), 2.78 (м, 2Н, СН₂), 2.59 (м, 2Н, СН₂), 2.31 (с, 1Н, СН₃). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 171.9, 150.7, 149.2, 147.6, 143.2, 128.1, 127.2, 123.2, 52.1, 42.3, 40.8, 39.1, 34.7, 10.8. ESI MS 351 (M⁺+1). Найдено, % C, 64.91; H, 6.18; N, 23.61; C₁₉H₂₂N₆O (350). Вычислено, %: C, 65.12; H, 6.33; N, 23.98.

Пример 7. 1-(4-бензилпиперазин-1-ил)-3-фенил-4-(1Н-тетразол-1-ил)бунан-1-он (Т_007).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 9.01 (с, 1Н, НС⁵), 7.31-7.05 (m, 10Н, арил), 4.92-4.81 (m, 2H, СН₂), 3.52-3.37 (m, 2H, СН_2,СН), 2.96 (m, 2H, СН₂), 2.68 (m, 2H, СН₂), 2.38 (m, 2H, СН₂). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 167.3, 150.7, 143.4, 137.9, 128.8, 128.1, 127.6, 127.5, 127.3, 127.1, 61.9, 52.1, 51.6, 45.7, 43.1, 40.9, 36.4. ESI MS 391 (M⁺+1). Найдено, % C, 67.41; H, 6.68; N, 21.41; C₂₂H₂₆N₆O (390). Вычислено, %: C, 67.67; H, 6.71; N, 21.52.

Пример 8. этил-3-фенил-4-(1Н-тетразол-1-ил)бутанат (Т_008).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 12.23 (уш. с, 1Н, ОН), 9.01 (с, 1Н, НС⁵), 7.32 (m, 5Н, C₆H₅), 4.78 (m, 2H, СН₂), 3.72 (квинтет, J 8.5, 1Н, СН), 2.74 (m, 2Н, СН₂). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 172.4, 151.1, 140.0, 128.5, 127.7, 127.3, 51.9, 42.0, 37.5. ESI MS 233(M⁺+1). Найдено, % C, 56.75; H, 5.28; N, 24.01. C₁₁H₁₂N₄O₂ (232). Вычислено, %: C, 56.89; H, 5.21; N, 24.12.

Пример 9. Этил-4(-5-метил-1Н-тетразол-1-ил)-3-финилбутанат (Т_009).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 7.40 (м, 5Н, C₆H₅), 3.40 (с, 3H, СН₃О), 4.73 (м, 2Н, СН₂), 3.69 (квинтет, J 8.5 Hz, 1Н, СН), 2.70 (м, 2H, СН₂), 2.40 (s, 3Н, СН₃-С⁵). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 171.5, 155.3, 142.1, 128.2, 127.6, 126.8, 52.3, 50.9, 42.1, 37.7. ESI MS 275 (M⁺+1). Найдено, % C, 60.21; H, 6.57; N, 20.21. C₁₄H₁₈N₄O₂ (274). Вычислено, %: C, 61.30; H, 6.61; N, 20.42.

Пример 10. Метил-3-фенил-4(1Н-тетразол-1-ил)-бутанат (Т_010).

Спектр ЯМР ¹H (400 MГц, DMSO-d₆), δ м.д., J (Гц): 9.01 (с, 1Н, НС⁵), 7.40 (м, 5Н, C₆H₅), 3.40 (с, 3H, СН₃О), 4.73 (м, 2Н, СН₂), 3.69 (квинтет, J 8.5 Hz, 1Н, СН), 2.70 (м, 2H, СН₂), 2.40 (s, 3Н, СН₃-С⁵). Спектр ЯМР ¹³C (75 MГц, CDCl₃), δ м.д.: 171.5, 155.3, 142.1, 128.2, 127.6, 126.8, 52.3, 50.9, 42.1, 37.7. ESI MS 245 (M⁺+1). Найдено, % C, 58.40; H, 5.53; N, 22.67. C₁₂H₁₄N₄O₂ (246). Вычислено, %: C, 58.53; H, 5.73; N, 22.75.

Пример 11. Изучение влияния заявленных соединений на когнитивные функции у животных проведено в сертифицированной установке "Lafayette Instrument Co" (США), используемой как в России, так и за рубежом при изучении веществ, улучшающих когнитивные функции (Воронина, Островская, 2012, Chopin, 1992, Chopin, Briley, 1992, Voronina, 1994 и др.).

Об эффективности препаратов судили по результатам обучения условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ) и амнезию этого рефлекса у крыс. Оценку заявленных соединений проводили в сравнительных исследованиях с препаратом-аналогом - фенибут (4-амино-3-фенилбутановая кислота).

Исследования проведены на белых беспородных половозрелых крысах самцах 2-3 месячного возраста массой 210 - 230 г. Животные содержались на постоянном доступе к корму и воде – предоставлялся полный рацион экструдированного брикетированного корма (ГОСТ на корм Р 50258-92) и питьевая вода. Животные содержались при температурном режиме 20-22 градуса по Цельсию, при световом цикле - 12 часов светлый и 12 часов темный периоды, в пластмассовых клетках Т/4А размером 580x375x200 мм, с верхней крышкой из нержавеющей стали с подстилкой обеспыленной из деревянной стружки по 8 крыс в каждой клетке. Опыты проводили в первую половину дня.

Крыс помещали на ярко освещенную платформу перед входом в темную камеру установки хвостом к входному отверстию и регистрировали латентное время рефлекса. Затем в темной камере крыса получала болевое неизбегаемое (закрытая дверь) раздражение электрическим током (0,2-0,З мА) 8 раз продолжительностью 0,2 сек. Тест на воспроизведение УРПИ осуществляли через 24 часа после обучения и проводили при повторном помещении животного в установку с регистрацией в течение 3 мин. латентного периода первого захода крысы в темную экспериментальную камеру, и количества животных, не зашедших в темный отсек камеры в процентах (%).

Для получения амнезии крысам сразу после обучения УРПИ накладывали на роговицы глаз корнеальные электроды и наносили максимальный электрический шок (МЭШ) - 250 V / 122 mА, 0,1 сек.

Для проведения эксперимента крысы были разделены на группы по 9-8 животных:

1 группа: Контроль без амнезии (интактный) физиологический раствор;

2 группа: Контроль с амнезией (с МЭШ) физиологический раствор;

3 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-001 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

4 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-001 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

5 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-002 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

6 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-002 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

7 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-003 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

8 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-003 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

9 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-004 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

10 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-004 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

11 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-005 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

12 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-005 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

13 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-006 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

14 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-006 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

15 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-007 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

16 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-007 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

17 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-008 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

18 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-008 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

19 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-009 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

20 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-009 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

21 группа: амнезия + заявляемое соединение Т-010 в дозе 5 мг/кг/внутрибрюшинно;

22 группа: амнезия +заявляемое соединение Т-010 в дозе 50 мг/кг/внутрибрюшинно;

23 группа: амнезия + Фенибут в дозе 50 мг/кг /внутрибрюшинно.

Вещества растворяли в физиологическом растворе с использованием ТВИН 80. Введение растворов осуществляли однократно за 40 минут до обучения внутрибрюшинно (в/б), из расчета 0,2 мл на 100 г массы тела.

При обучении крыс УРПИ показано, что животные интактного контроля и контроля с МЭШ при первом помещении на освещенную платформу заходили в темную камеру с коротким латентным периодом -14,88 ± 2,40 и 14,56 ± 2,11секунд соответственно (Табл. 1).

На фоне острого введения заявляемых соединений в дозе 5 мг/кг латентный период захода значительно не отличался от контрольных групп, а в дозе 50 мг/кг увеличивался с тенденцией к достоверности. Препарат сравнения фенибут в дозе 50 мг/кг в два раза увеличил время захода в темную камеру, статистически достоверно повышая этот показатель до 34,11 ± 8,83 секунд (Табл. 1).

Таким образом, животные контрольных групп при обучении, проявляя естественное желание избежать освещенной открытой подвесной платформы, осуществляли норковый рефлекс с коротким латентным периодом захода. Заявляемые соединения в дозе 50 мг/кг и фенибут в эквивалентной дозе увеличивали этот показатель в 2 раза, демонстрируя поведение, присущее для веществ с анксиолитической активностью.

При воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения крысы интактного контроля помнили об «опасной» темной камере и не заходили в нее в 100 % случаев. У животных, получивших МЭШ сразу после обучения, при вторичном помещении их на освещенную платформу уменьшался латентный период захода в темный отсек камеры установки до 116,11 ± 23,45 секунд (у интактного контроля 180,0 ± 23,45) и уменьшалось число крыс, воспроизводивших УРПИ до 33 % относительно контрольных значений - 100%. (Табл. 1).

Таким образом, МЭШ достоверно укорачивал длительность латентного периода захода в темную камеру при воспроизведении УРПИ и достоверно уменьшал число животных, не зашедших в темный отсек камеры при воспроизведении УРПИ, т.е. помнящих о нанесенном там накануне аверсивном стимуле. Полученные данные свидетельствуют о выраженном амнезирующем действии МЭШ (Табл. 1).

Таблица 1. Изучение влияния заявляемых соединений на УРПИ, вызванный МЭШ

Обучение: Воспроизведение через 24 часа:
Группа животного
Доза
мг/кг Латентный период первого захода, с Латентное время рефлекса, с Количество обучившихся животных Контроль интактный 14,88 ± 2,40 180,00 ± 0,00 100 Контроль с МЭШ - 14,56 ± 2,11 116,11 ± 15,45* 33^# Заявляемое соединение Т-001 5 19,00 ± 4,06 136,22 ± 14,12 69& Заявляемое соединение Т-001 50 30,22 ± 8,09^$1 159,56 ± 11,26^@
81& Заявляемое соединение Т-002 5 17,01 ± 3,95 132,30 ± 23,11 67& Заявляемое соединение Т-002 50 29,11 ± 7,94$¹
151,32 ± 12,10$² 77& Заявляемое соединение Т-003 5 18,10 ± 4,35 133,79 ± 18,45 68& Заявляемое соединение Т-003 50 29,87 ± 7,89$¹
154,56 ± 13,26$² 78& Заявляемое соединение Т-004 5 17,54 ± 2,67 134,34 ± 17,89 66& Заявляемое соединение Т-004 50 27,98 ± 6,23^$1
153,98 ± 10,37$² 76& Заявляемое соединение Т-005 5 18,89 ± 3,78 135,02 ± 17,53 69& Заявляемое соединение Т-005 50 29,68 ± 9,10^$1
154,90 ± 12,45^$2 77& Заявляемое соединение Т-006 5 17,97 ± 2,02 133,89 ± 16,10 68& Заявляемое соединение Т-006 50 28,03 ± 7,78^$1
156,09 ± 14,00^$2 79& Заявляемое соединение Т-007 5 18,90 ± 3,32 131,92 ± 13,04 66& Заявляемое соединение Т-007 50 29,99 ± 8,11^$1
155,78 ± 14,44^$2 75& Заявляемое соединение Т-008 5 17,87 ± 3,98 133,86 ± 16,13 67& Заявляемое соединение Т-008 50 28,88 ± 8,10^$1
156,16 ± 13,34^$2 77& Заявляемое соединение Т-009 5 18,92 ± 2,12 132,12 ± 12,12 66& Заявляемое соединение Т-009 50 29,94 ± 7,91^$1
154,37 ± 14,11^$2 78& Заявляемое соединение Т-010 5 17,78 ± 2,15 133,35 ± 12,56 65& Заявляемое соединение Т-010 50 30,00 ± 8,29^$1
154,66 ± 13,45^$2 76& Фенибут 50 34,11 ± 8,83@ 115,00 ± 25,13 55

*-достоверность отличий от интактного контроля, при Р≤0,05 (t-критерий

Стьюдента);

# - достоверность отличий от интактного контроля, при Р≤0,05 (критерий

Фишера);

& - достоверность отличий от контроля с МЭШ, при Р≤0,05 (критерий %2);

$ - тенденция к достоверности отличий от контроля с МЭШ, при Р≤0,1

(критерий Крускала-Уоллиса); $¹- Р=0,083, $²- Р=0,073.

@ - достоверность отличий от контроля с МЭШ, при Р≤0,05 (критерий

Крускала-Уоллиса).

Заявляемые соединения в дозе 5 мг/кг при воспроизведении УРПИ увеличивали латентное время рефлекса до 131,92 – 136,22 секунд и количество животных, воспроизводивших рефлекс до 65-69 % (Табл. 1).

При воспроизведении УРПИ заявляемые соединения в дозе 50 мг/кг значительно уменьшали амнезирующее действие МЭШ, увеличивая латентное время рефлекса до 151,32 - 159,56 с. и количество крыс, воспроизводивших его до 75-81 %. (Табл. 1).

При повторном предъявлении темной «опасной» камеры животным, однократно получившим до обучения фенибут в дозе 50 мг/кг, регистрировалось незначительное увеличение обучившихся навыку крыс до 55 %, но при этом латентный период рефлекса не отличался от значения контрольной группы с МЭШ (Табл. 1).

Таким образом, выполненные исследования показали, что в тесте амнезии УРПИ, вызванной МЭШ, у крыс в установке "Lafayette Instrument Co" (США) заявляемые соединения оказывают антиамнестическое действие в дозе 5 мг/кг и особенно усиленное в дозе 50 мг/кг, что выражается в статистически достоверном увеличении процента животных без амнезии, хорошо помнящих о ситуации и не заходящих в темный «опасный» отсек камеры, где они ранее получали болевое раздражение. Препарат сравнения фенибут в дозе 50 мг/кг незначительно ослабляет амнезию УРПИ, вызванную МЭШ, и уступает по антиамнестическому эффекту заявляемым соединениям.

Проведенные исследования позволяют предположить наличие у заявляемых соединений и Фенибута в дозе 50 мг/кг анксиолитического действия, о чем свидетельствует способность веществ увеличивать латентное время захода в темную камеру с ярко освещенной платформы при обучении рефлекса.

Таким образом, по антиамнестической активности изученные соединения в исследуемых дозах можно расположить в следующей последовательности: заявляемые соединения (50 мг/кг) > заявляемые соединения (5 мг/кг) > Фенибут (50 мг/кг), а по анксиолитической Фенибут (50 мг/кг) > заявляемые соединения (50 мг/кг).

На основании проведенных исследовании был предложен способ улучшения процессов обучения, памяти, когнитивных функций у здоровых лиц и лиц с психическими дефицитными расстройствами, заключающийся во введении пациенту фармакологических средств, содержащих эффективное количество соединений формулы (I) в дозах 0,83-8,33 мг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Расчет эквивалентных доз для человека проводили в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Часть первая. -М.: Гриф и К, 2012. -944).

Пример 12.

Аутизм диагностируется наличием нескольких критериев, в числе которых:

1. Нарушение социального взаимодействия;

2. Дефицит общения;

3. Стереотипное, повторяющееся поведение, настойчивое требование постоянных, одинаковых условий;

4. Ограниченность интересов;

5. Повышенная тревожность и др.

На основе этих представлений разработаны специальные экспериментальные модели аутизма у животных, позволяющие воспроизвести нарушения ЦНС в эксперименте, а именно на мышах.

Изучение фармакологической активности заявляемых соединений проведено посредством исследования его влияния на аномалии поведения при аутистических расстройствах с использованием специальных экспериментальных моделей аутизма у мышей линии BALB/С, которые широко используются в зарубежных исследованиях (Bielsky et al. 2004; Bielsky, Young 2004; Brodkin 2007; Crawley et al. 2007; Chadman et al. 2008; Roullet and Crawley, 2011; Moy et al. 2004, 2007, 2008; Nadler et.al., 2004; Kwon et al. 2006; Moon J. et al., 2008 и другие) и позволяют оценить такие проявления аутистических состояний, как нарушение социального взаимодействия, дефицит общения, стереотипное, повторяющееся поведение, настойчивое требование постоянных, одинаковых условий, ограниченность интересов, повышенную тревожность и другие. Поскольку подобное поведение характерно для мышей линии BALB/c, именно эта линия животных использовалась в эксперименте для оценки влияния веществ на нарушения ЦНС при аутистических расстройствах.

Изучено влияние заявляемых соединений на обучение пространственному навыку мышей линии BALB/c и на поведение животных после пространственной «сшибки» (переобучения) в водном лабиринте Морриса.

Зацикленное, повторяющееся, стереотипное поведение, активности, ненаправленный на получение конкретного результата являются характерными проявлениями аутизма (South et al. 2005; Roullet and Crawley, 2010). Повторяющееся, стереотипное поведение у мышей включает вращательные движения, повороты назад, повторяющееся обнюхивание одних и тех же мест в пространстве или объектов, а также чрезмерный грумминг и повышенную нецеленаправленную двигательную активность (Crawley 2007b; Moy et al. 2008).

Повторяющееся зацикленное поведение мышей линии BALB/c выявляется в неспособности животных принять решение и осуществить правильное пространственное движение при смене локализации платформы при переобучении в водном лабиринте (Moy et al. 2008).

Эксперимент проводили на мышах-самцах линии BALB/c возрастом 5-7 недель массой 13-15 г. Животные содержались на постоянном доступе к корму и воде – предоставлялся полный рацион экструдированного брикетированного корма (ГОСТ на корм Р 50258-92) и питьевая вода; при температурном режиме 20-22°С, при световом режиме – 12 часов свет/12 часов темнота; в полипропиленовых клетках с решеткой из цинкохромовой стали, с обеспыленной подстилкой из деревянной стружки по 10 мышей в каждой клетке (Т/3С).

Заявляемые соединения использовали в дозах 100 мг/кг и 150 мг/кг. Суспензию соединения готовили с использованием Твина-80. Навеску соединения растирали с каплей Твина-80 и затем добавляли необходимое количество дистиллированной воды.

Заявляемые соединения вводили внутрь (внутрижелудочно) при помощи специального зонда в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши. Контрольным животным вводили внутрь (внутрижелудочно) суспензию с Твином-80 в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши.

Соединения (опытные группы) или суспензию с Твином-80 (контрольные группы) вводили за 40 минут до начала эксперимента.

В настоящем исследовании для оценки влияния заявляемых соединений на аутичные проявления использовалась методика, предложенная Moy SS, Nadler JJ, Young NB et al. (2007). Изучалось влияние соединений на процесс обучения пространственному навыку и на способность осуществить новое пространственное движение при переобучении в водном лабиринте.

Исследование проводили в водном лабиринте Морриса. Лабиринт Морриса представляет собой круглый бассейн диаметром 122 см, глубиной 25 см, заполненный водой температурой 20-22°С. В бассейн помещали круглую платформу диаметром 12 см. Центр платформы располагали на расстоянии 30 см от краев бассейна.

Сначала у мышей проводили предварительное обучение навыку находить платформу в водном лабиринте и воспроизводить этот пространственный навык. А затем животным предъявляли новое местоположение платформы и таким образом осуществляли пространственную «сшибку». При переобучении – смене локализации платформы в водном лабиринте – животные должны принять новое решение и осуществить правильное пространственное движение.

1 этап – отбор животных для эксперимента.

До начала эксперимента проводят отбор животных, пригодных для обучения. Для этого платформу располагают на 0,5 см выше уровня воды. Мышь помещают на платформу на 20 секунд.

Затем мышь опускают в воду на противоположной стороне бассейна и позволяют в течение 60 секунд найти платформу и взобраться на нее, где оставляют животное на 20 секунд. Процесс повторяют, опуская мышь в воду с другой, отличной от первой попытки, стороны бассейна.

Если животное не в состоянии самостоятельно найти платформу в течение 60 секунд, экспериментатор помогает ему переместиться к платформе и взобраться на нее. Если животное не может самостоятельно найти платформу в двух попытках подряд, то оно исключается из опыта.

2 этап. Обучение животных пространственному навыку.

В течение 2-х последующих дней платформа располагается на 0,5 см ниже уровня воды. Ежедневно животным предоставляют по 4 попытки найти платформу в течение 60 секунд. Интервал между попытками составляет 20 секунд, в течение которого они находятся на платформе. Каждый день перед первой попыткой животное на 20 секунд помещают на платформу.

Регистрируют время, прошедшее от момента спуска животного в воду до влезания на платформу, и количество результативных попыток поиска платформы. Животных опускают в воду в 3-х различных точках на половине бассейна, противоположной по отношению к платформе.

3-й этап. Воспроизведение пространственного навыка.

Через 48 часов после второго дня обучения оценивают воспроизведение пространственного навыка: платформу убирают и животных однократно помещают в бассейн на 60 секунд.

Регистрируют время, в течение которого животное находится в квадранте, где в дни обучения располагалась платформа, что служит показателем эффективности обучения и воспроизведения пространственного навыка.

4-й этап. Сшибка пространственного навыка – переобучение.

На следующий день после воспроизведения пространственного навыка платформа, находящаяся ниже уровня воды на 0,5 см при обучении, перемещается в область, диагонально противоположную прежнему её местоположению. Процедура обучения и воспроизведения повторяется по описанной выше схеме.

Влияние заявляемых соединений на обучение и воспроизведение пространственного навыка мышами линии BALB/c в водном лабиринте Морриса

В первый день обучения в водном лабиринте мышей линии BALB/c заявляемые соединения в дозах 100 мг/кг и 150 мг/кг достоверно увеличивали время поиска платформы соответственно на 17,3 % и 14,6 % и снижали количество результативных попыток поиска платформы соответственно в 3,2 и 2,7 раза по сравнению с контрольной группой (Табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии изучаемых соединений на кратковременную память.

Во второй день обучения поведение животных, которым вводились изучаемые соединения в дозах 100 и 150 мг/кг, не отличалось от поведения контрольных мышей. Однако были зафиксированы следующие особенности: если для контрольной группы время поиска платформы было на 11,4 % больше, чем в первый день, то при введении мышам соединений в дозах 100 и 150 мг/кг оно, наоборот, сократилось соответственно на 10,1 % и 10,2 % при сравнении с первым днем обучения. Но эти отличия не являются достоверными.

При воспроизведении пространственного навыка через 48 часов после обучения заявляемые соединения в дозе 150 мг/кг статистически достоверно увеличивали время пребывания в квадранте, где при обучении находилась арена, на 88-90 % (Табл. 2).

Продолжительность нахождения в данном квадранте животных, которым вводили изучаемые соединения в дозе 100 мг/кг, не отличалась от показателя группы контрольных животных (Табл. 2).

Таблица 2 – Влияние заявляемых соединений на обучение и воспроизведение пространственного навыка в водном лабиринте Морриса мышами линии BALB/c (M ± m, n=15)

Группы Обучение Воспроизведение Время поиска платформы, сек Количество результативных попыток, ед. Время нахождения в квадранте платформы, сек 1 день 2 день 1 день 2 день Контроль
48,1 ± 2,7 53,6 ± 1,7 1,9 ± 0,4 1,0 ± 0,2 9,2 ± 1,8 Заявляемое соединение Т-001,
100 мг/кг 56,4 ± 1,3* 50,7 ± 2,7 0,6 ± 0,2* 1,3 ± 0,3 10,3 ± 2,1 Заявляемое соединение Т-001,
150 мг/кг 55,1 ± 1,7* 49,5 ± 2,9 0,7 ± 0,2* 1,3 ± 0,3 17,5 ± 3,6* Заявляемое соединение Т-002,
100 мг/кг 56,2 ± 1,4* 50,9 ± 2,8 0,5 ± 0,3* 1,4 ± 0,4 10,9 ± 1,9 Заявляемое соединение Т-002
150 мг/кг 54,9 ± 1,6* 49,8 ± 2,6 0,6 ± 0,1* 1,3 ± 0,2 17,8 ± 3,3* Заявляемое соединение Т-003,
100 мг/кг 55,7 ± 1,5* 51,0 ± 2,5 0,5 ± 0,2* 1,2 ± 0,2 11,0 ± 2,6 Заявляемое соединение Т-003,
150 мг/кг 55,3 ± 1,6* 49,9 ± 3,0 0,6 ± 0,1* 1,2 ± 0,3 17,1 ± 4,0* Заявляемое соединение Т-004,
100 мг/кг 56,8 ± 1,2* 50,2 ± 2,4 0,6 ± 0,3* 1,3 ± 0,4 11,2 ± 1,8 Заявляемое соединение Т-004,
150 мг/кг 55,7 ± 1,5* 49,8 ± 2,6 0,5 ± 0,1* 1,3 ± 0,2 16,9 ± 3,0* Заявляемое соединение Т-005,
100 мг/кг 55,9 ± 1,2* 50,2 ± 2,3 0,7 ± 0,3* 1,4 ± 0,2 10,7 ± 1,9 Заявляемое соединение Т-005,
150 мг/кг 54,5 ± 1,6* 50,0 ± 2,8 0,6 ± 0,3* 1,3 ± 0,3 17,0 ± 2,8* Заявляемое соединение Т-006,
100 мг/кг 57,0 ± 1,4* 51,1 ± 2,5 0,6 ± 0,3* 1,2 ± 0,2 11,4 ± 2,9 Заявляемое соединение Т-006,
150 мг/кг 56,2 ± 1,5* 49,7 ± 2,8 0,6 ± 0,1* 1,2 ± 0,3 16,7 ± 2,1* Заявляемое соединение Т-007,
100 мг/кг 55,3 ± 1,3* 49,9 ± 2,0 0,5 ± 0,2* 1,4 ± 0,3 10,8 ± 3,0 Заявляемое соединение Т-007,
150 мг/кг 56,0 ± 1,6* 48,8 ± 2,7 0,6 ± 0,3* 1,3 ± 0,4 17,2 ± 3,1* Заявляемое соединение Т-008,
100 мг/кг 56,9 ± 1,4* 50,1 ± 2,3 0,7 ± 0,2* 1,4 ± 0,4 11,5 ± 2,8 Заявляемое соединение Т-008,
150 мг/кг 56,7 ± 1,5* 49,7 ± 2,6 0,6 ± 0,1* 1,4 ± 0,3 16,8 ± 2,6* Заявляемое соединение Т-009,
100 мг/кг 55,8 ± 1,4* 50,6 ± 2,6 0,5 ± 0,3* 1,2 ± 0,3 10,9 ± 2,4 Заявляемое соединение Т-009,
150 мг/кг 56,2 ± 1,6* 49,9 ± 2,5 0,7 ± 0,3* 1,2 ± 0,2 17,8 ± 3,1* Заявляемое соединение Т-010,
100 мг/кг 57,5 ± 1,2* 50,8 ± 2,4 0,7 ± 0,2* 1,3 ± 0,2 10,5 ± 1,8 Заявляемое соединение Т-010
150 мг/кг 56,9 ± 1,8* 49,2 ± 2,6 0,6 ± 0,3* 1,3 ± 0,4 17,4 ± 3,0*

*-p<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Влияние заявляемых соединений на поведение мышей линии BALB/c после пространственной сшибки (переобучения) в водном лабиринте Морриса

Установлено, что непосредственно после сшибки (процесс переобучения мышей) время поиска платформы и количество результативных попыток как в контрольной, так и в опытных (введение заявляемых соединений) группах статистически не отличались как при внутригрупповом, так и при межгрупповом сравнениях (Табл. 3).

Таблица 3 – Влияние заявляемых соединений на поведение мышей линии BALB/c после пространственной сшибки (переобучения) в водном лабиринте Морриса. (M ± m, n=15).

Группы Переобучение Воспроизведение Время поиска платформы, с Количество результативных попыток, ед. Время нахождения в квадранте платформы, с 1 день 2 день 1 день 2 день Контроль 41,4 ± 3,0 34,7 ± 2,3 2,4 ± 0,3 3,1 ± 0,2 16,1 ± 2,3 Заявляемое соединение Т-001,
100 мг/кг 39,9 ± 4,7 40,6 ± 4,3 2,1 ± 0,5 2,1 ± 0,4 18,1 ± 3,1 Заявляемое соединение Т-001,
150 мг/кг 44,0 ± 3,0 36,6 ± 4,1 2,1 ± 0,4 2,5 ± 0,4 28,6 ± 4,3* Заявляемое соединение Т-002,
100 мг/кг 40,0 ± 4,0 40,4± 3,8 2,0 ± 0,3 2,2 ± 0,5 18,7 ± 2,9 Заявляемое соединение Т-002,
150 мг/кг 45,1 ± 3,8 36,1 ± 3,4 2,2 ± 0,3 2,4 ± 0,3 27,5 ± 4,0* Заявляемое соединение Т-003,
100 мг/кг 39,6 ± 4,2 41,5 ± 4,5 2,0 ± 0,2 2,4 ± 0,5 19,0 ± 3,5 Заявляемое соединение Т-003,
150 мг/кг 43,8 ± 3,2 37,1 ± 2,9 2,1 ± 0,3 2,4 ± 0,3 28,1 ± 4,6* Заявляемое соединение Т-004,
100 мг/кг 40,2 ± 3,7 40,0 ± 3,5 2,0 ± 0,4 2,0 ± 0,6 18,7 ± 3,7 Заявляемое соединение Т-004,
150 мг/кг 44,7 ± 2,8 36,8 ± 4,0 2,2 ± 0,5 2,3 ± 0,5 27,9 ± 4,5* Заявляемое соединение Т-005,
100 мг/кг 39,5 ± 3,7 41,4 ± 3,7 2,1 ± 0,2 2,5 ± 0,3 17,9 ± 2,8 Заявляемое соединение Т-005,
150 мг/кг 44,4 ± 3,3 36,1 ± 3,2 2,0 ± 0,3 2,6 ± 0,6 27,8 ± 4,0* Заявляемое соединение Т-006,
100 мг/кг 40,2 ± 3,1 39,9 ± 3,3 2,2 ± 0,3 2,7 ± 0,3 18,8 ± 3,7 Заявляемое соединение Т-006,
150 мг/кг 45,2 ± 3,5 35,8 ± 3,0 2,1 ± 0,5 2,8 ± 0,5 28,0 ± 4,2* Заявляемое соединение Т-007,
100 мг/кг 39,4 ± 4,8 41,1 ± 4,8 2,3 ± 0,6 2,2 ± 0,6 19,0 ± 3,8 Заявляемое соединение Т-007,
150 мг/кг 44,5 ± 2,9 36,8 ± 2,9 2,0 ± 0,3 2,4 ± 0,5 27,7 ± 3,8* Заявляемое соединение Т-008,
100 мг/кг 41,3 ± 4,9 40,0 ± 4,5 2,2 ± 0,4 2,5 ±0,4 18,8 ± 3,6 Заявляемое соединение Т-008,
150 мг/кг 45,5 ± 3,8 37,2 ± 3,7 2,1 ± 0,2 2,7 ± 0,3 28,0 ± 4,1* Заявляемое соединение Т-009,
100 мг/кг 39,6 ± 4,2 40,9 ± 3,6 2,3 ± 0,2 2,4 ± 0,5 19,1 ± 3,3 Заявляемое соединение Т-009,
150 мг/кг 44,9 ± 3,0 36,4 ± 4,0 2,2 ± 0,5 2,7 ± 0,4 27,9 ± 3,2* Заявляемое соединение Т-010,
100 мг/кг 40,0 ± 3,5 41,5 ± 4,7 2,0 ± 0,4 2,5 ± 0,5 18,5 ± 2,1 Заявляемое соединение Т-010,
150 мг/кг 44,8 ± 3,9 35,8 ± 3,8 2,2 ± 0,3 2,3 ± 0,7 28,2 ± 4,0*

*- p<0,05 по сравнению с контрольной группой.

При воспроизведении навыка, полученного после пространственной «сшибки», обнаружено, что изучаемые соединения в дозе 150 мг/кг статистически достоверно увеличивали на 76-78 % время нахождения животных в правильном квадранте по сравнению с показателями контрольной группы (Табл. 3). После введения заявляемых соединений в дозе 100 мг/кг продолжительность нахождения животных в «правильном» квадранте не отличалась от данных в контрольной группе. Таким образом, заявляемые соединения в дозе 150 мг/кг статистически достоверно улучшают показатели долговременной памяти у мышей линии BALB/c в условиях водного лабиринта Морриса и облегчают процесс переобучения сформированного навыка при сшибке пространственной памяти после перемещения платформы в диагонально противоположный прежнему её местоположению квадрант.

Пример 13. Исследовано влияния заявляемых соединений на проявления аутизма в тесте нарушения социального взаимодействия (общительности) у мышей линии BALB/c.

Тест нарушения социального взаимодействия широко используется в экспериментальных исследованиях по изучению влияния веществ на проявления аутизма (Crawley, Chen, Puri et al., 2007a; Moy, Nadler, Perez et al., 2004; Moy, Nadler, Young et al., 2007, 2008; Nadler et al., 2004; Shah, 2013). Чаще всего исследования проводят в установке, разделенной прозрачными стенками на три равных отсека. Тестируемую мышь помещают в центральный отсек, а в крайние отсеки помещают новые, незнакомые для тестируемой мыши объекты: новую, незнакомую мышь и новый несоциальный объект (Crawley, Chen, Puri et. al., 2007a; Moy, Nadler, Perez et. al., 2004; Moy, Nadler, Young et.al., 2007, 2008; Nadler et.al., 2004). В тесте оценивается время, которое тестируемая, изучаемая мышь проводит в отсеке с новой (незнакомой) мышью и время, которое тестируемая, изучаемая мышь проводит в отсеке с новым несоциальным объектом (Moy et al. 2004, 2007; Nadler et al. 2004; Crawley et al. 2007a; Yang et al. 2009; Chadman et al. 2008).

Если время, проведенное в двух отсеках с разными по социальной значимости объектами, статистически не отличается, или время, проведенное в отсеке с несоциальным объектом, больше, чем в отсеке с социальным объектом, – регистрируется утрата общительности, характерная для аутистических состояний. Поскольку подобное поведение характерно для мышей линии BALB/с, именно эта линия животных используется в эксперименте для оценки влияния веществ на нарушения ЦНС при аутизме (Brodkin 2004, 2007; Moy et al. 2008).

В рамках этой модели оценивается также нарушение социального узнавания и социальной памяти. С этой целью тестируемой мыши вместо ранее предъявлявшегося несоциального объекта предъявляется новый социальный объект – «незнакомая» мышь того же пола и линии, что и первый социальный объект и регистрируется время обнюхивания «знакомой» и «незнакомой» мыши (Bielsky et al. 2004; Bielsky and Young 2004).

Эксперимент проводили на мышах-самцах линии BALB/c возраста 5-7 недель массой 13-15 г в начале эксперимента.

В качестве социально значимого объекта и дополнительного контроля использовались мыши-самцы линии C57Bl/6 возрастом 2-3 месяца массой 20-24 г. В качестве социально значимого объекта для мышей линии C57Bl/6 служили аутбредные мыши-самцы возрастом 2-3 месяца и массой 22-26 г. Условия содержания идентичны таковым для исследования в примере 12.

Заявляемые соединения вводили в дозах 100 мг/кг и 150 мг/кг внутрь (внутрижелудочно) в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Контрольным животным вводили внутрь (внутрижелудочно) суспензию с Твином-80 в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Процедуры приготовления суспензий и введения их животным подробно описаны в примере 12.

В настоящем исследовании использовали модифицированный вариант методики, разработанной Crawley lab (Moy, et al., 2004) и широко используемой во многих исследованиях (Moy et al., 2007; Moy et al., 2008; Brodkin 2007; Crawley et al., 2007; Chadman et al., 2008; Roullet FI., Crawley JN, 2010; Silverman et al., 2010; Shah, 2013).

Исследование проводили в специальной установке с прозрачными стенками. Размеры установки: длина 50 см и ширина 25 см. Камера разделена прозрачными снимаемыми перегородками на три равных отсека, которые дверцами с опускаемыми перегородками сообщаются между собой. Тестируемую мышь помещали в центральный отсек, а в крайние отсеки помещали новые, незнакомые для тестируемой мыши объекты: новую, незнакомую мышь и новый несоциальный объект.

Животных приносили из вивария в экспериментальную комнату и оставляли в домашних клетках за 30 минут до первой посадки в камеру установки с целью адаптации к экспериментальной комнате. Затем мышь помещали в центральный отсек установки и проводили вторую процедуру адаптации, для чего мышь оставляли в установке на 10 минут при поднятых перегородках между отсеками.

На втором этапе эксперимента перегородки между отсеками опускали в тот момент, когда тестируемая мышь находилась в центральном отсеке, и в крайние отсеки помещали цилиндры (11 см в высоту, диаметром 9 см) со стенками из металлической сетки. Сверху цилиндров помещали груз для предотвращения их переворачивания.

В один из цилиндров помещали незнакомую мышь линии С57Bl/6 того же пола, что и тестируемая мышь, а в другой – новый несоциальный объект (пластмассовая игрушка высотой 8 см и шириной 4 см), ранее не предъявлявшийся.

Тестирование проводили в течение 6 минут.

Регистрируемые показатели:

1. Время, проведенное тестируемой мышью в отсеке с социально значимым объектом - незнакомой мышью C57Bl/6.

2. Время, проведенное тестируемой мышью в отсеке с новым, социально незначимым объектом.

3. Время, затраченное тестируемой мышью на обнюхивание незнакомой мыши C57Bl/6 (подход тестируемой мыши на 1 см и ближе к новой мыши) при ее первом предъявлении.

4. Число заходов тестируемой мыши в отсек с социально значимым объектом - незнакомой мышью C57Bl/6.

5. Число заходов тестируемой мыши в отсек с социально незначимым объектом.

6. Число подходов тестируемой мыши к социально значимому объекту - незнакомой мыши C57Bl/6.

При выполнении этого теста экспериментатор находится на расстоянии не менее 2 м от установки.

Мыши, которые больше времени проводили в отсеке с новой мышью и совершали туда больше заходов, определялись как общительные, демонстрирующие социальное взаимодействие.

Мыши, у которых время, проведенное в двух отсеках с разными по социальной значимости объектами, статистически не отличалось, или время, проведенное в отсеке с несоциальным объектом, было больше, чем в отсеке с социальным объектом, определялись как мыши с утратой общительности, что характерно для аутизма.

Таким образом, социальное взаимодействие (общительность) оценивали по соотношению времени, проведенному тестируемой мышью в отсеке, содержащем незнакомую мышь, ко времени, проведенному мышью в 2-х отсеках, а также по числу заходов в отсеки.

В тесте социального взаимодействия в группе инбредных мышей линии С57Bl6, служивших дополнительным контролем, время, проведенное в отсеке с незнакомой мышью (социально значимым объектом - аутбредная мышь-самец), было на 61,3% больше, чем в отсеке с социально незначимым объектом. Время обнюхивания незнакомой мыши было почти на 20 с (на 32%) больше, чем в группе контрольных животных линии BALB/c (Табл. 4). При этом мыши линии С57Bl/6 совершали в 1,54 раз больше заходов в отсек с социально значимым объектом, чем в отсек с несоциальным объектом, и в 1,25 раз больше подходов к социальному объекту на расстоянии менее 1 см, чем в контрольной группе мышей BALB/c (Табл. 5).

Таким образом, инбредные мыши линии С57Bl6 больше времени проводят в отсеке с социально значимым объектом - новой мышью и совершают туда больше заходов и поэтому определяются как общительные животные, демонстрирующие высокий уровень социального взаимодействия. Полученные данные коррелируют с результатами других исследований (Moy et al. 2007, 2008; Yang et al. 2009).

Контрольные животные линии BALB/c проводили на 12% меньше времени в отсеке с социально значимым объектом, по сравнению со временем в отсеке с социально незначимым объектом (Табл. 4). Время обнюхивания незнакомой мыши было в 1,48 раз меньше, чем в группе мышей дополнительного контроля. Но, при этом, число заходов в отсек с социально значимым объектом было в 2,2 раза достоверно больше, чем число заходов в отсек с социально незначимым объектом (Табл. 5). Достоверное отличие по числу заходов между контрольными группами животных объясняется меньшей двигательной и ориентировочно-исследовательской активностью, а также повышенной тревожностью, характерными для фенотипа мышей линии BALB/c в отличие от более активных и не тревожных мышей линии С57Bl/6.

Таким образом, мыши линии BALB/c определяются как малообщительные животные, демонстрирующие низкий уровень социального взаимодействия, что характерно для аномалий поведения при аутизме. Полученные контрольные данные находят подтверждение в результатах исследований других авторов (Moy et al. 2007; Yang et al. 2009).

После введения изучаемых соединений в дозе 100 мг/кг мышам BALB/c время нахождения животных в отсеке с социальным объектом было на 9-10 % больше, чем в группе с социально незначимым объектом (Табл. 4). Время обнюхивания новой «незнакомой» мыши на фоне введения заявляемых соединений не отличалось от значений в контрольной группе мышей BALB/c (Табл. 4).

Таблица 4 – Влияние заявляемых соединений на время нахождения в отсеках с социальным и несоциальным объектами в тесте социального взаимодействия у мышей (M ± m).

Группа, доза вещества, число животных в группе Время нахождения, с Время
обнюхивания
незнакомой
мыши, с в центральном
отсеке в отсеке с социальным объектом в отсеке с несоциальным объектом Контроль,
мыши C57Bl/6, n=10 70,00 ± 2,31* 179,60 ± 12,30* 110,70 ± 8,59# 59,75 ± 8,12* Контроль,
мыши BALB/c, n=12 96,80 ± 6,90 124,9 ± 12,15 141,90 ± 15,66 40,40 ± 5,07 Заявляемое соединение Т-001,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 132,20 ± 17,94 120,00 ± 13,03 108,60 ± 23,16 31,70 ± 4,78 Заявляемое соединение Т-001,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 125,20 ± 20,59 95,20 ± 6,71 129,00 ± 21,04 34,90 ± 2,99 Заявляемое соединение Т-002,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 131,80 ± 16,82 121,40 ± 12,11 109,30 ± 21,23 32,20 ± 5,12 Заявляемое соединение Т-002,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 124,40 ± 18,98 96,30 ± 7,34 128,10 ± 20,12 33,70 ± 3,20 Заявляемое соединение Т-003,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 133,10 ± 18,22 119,30 ± 13,67 108,90 ± 22,34 31,10 ± 4,01 Заявляемое соединение Т-003,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 126,80 ± 17,87 94,50 ± 7,43 129,90 ± 20,76 35,30 ± 3,45 Заявляемое соединение Т-004,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 133,50 ± 16,76 122,70 ± 11,99 107,50 ± 21,45 30,50 ± 5,11 Заявляемое соединение Т-004,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 124,00 ± 19,48 93,80 ± 8,95 130,20 ± 22,44 33,80 ± 3,54 Заявляемое соединение Т-005,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 131,40 ± 16,84 123,90 ± 14,23 106,90 ± 24,67 32,30 ± 4,21 Заявляемое соединение Т-005,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 124,60 ± 18,02 96,60 ± 6,87 128,70 ± 20,95 34,10 ± 2,78 Заявляемое соединение Т-006,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 134,30 ± 19,89 125,10 ± 15,13 107,50 ± 22,58 33,40 ± 5,87 Заявляемое соединение Т-006,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 123,90 ± 21,77 97,40 ± 7,21 130,10 ± 22,54 35,50 ± 3,95 Заявляемое соединение Т-007,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 133,40 ± 18,75 122,30 ± 12,24 108,90 ± 23,34 30,40 ± 3,98 Заявляемое соединение Т-007,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 126,90 ± 19,44 93,20 ± 5,91 129,60 ± 20,24 36,20 ± 4,01 Заявляемое соединение Т-008,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 135,10 ± 21,88 118,70 ± 14,05 107,10 ± 21,15 33,30 ± 5,34 Заявляемое соединение Т-008,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 126,30 ± 20,67 96,10 ± 5,78 131,20 ± 23,02 35,80 ± 3,79 Заявляемое соединение Т-009,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 133,70 ± 18,56 120,50 ± 14,22 107,30 ± 22,45 32,60 ± 4,11 Заявляемое соединение Т-009,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 124,50 ± 20,89 94,60 ± 6,98 128,70 ± 20,87 33,90 ± 3,44 Заявляемое соединение Т-010,
100 мг/кг внж
мыши BALB/c n=12 131,80 ± 16,85 122,90 ± 15,01 109,40 ± 21,44 33,70 ± 5,10 Заявляемое соединение Т-010,
150 мг/кг внж
мыши BALB/c n=10 123,40 ± 19,12 97,10 ± 7,02 130,10 ± 19,03 34,40 ± 3,25

* - p<0,05 по сравнению с контрольной группой мышей BALB/c (межгрупповое сравнение);

# - p<0,05 по сравнению со временем нахождения в отсеке с социальным объектом (внутригрупповое сравнение).

Таблица 5 – Влияние заявляемых соединений на заходы в отсеки с социальным и несоциальным объектами в тесте социального взаимодействия у мышей (M ± m).

Группа, доза вещества, количество животных Число заходов в отсек с «незнакомой» мышью, ед. Число заходов в отсек с незнакомым предметом, ед. Число подходов к «незнакомой» мыши, ед. Контроль, мыши C57Bl/6, n=10 24,85 ± 3,27* 13,50 ± 1,06*# 14,70 ± 1,20* Контроль,
мыши BALB/c, n=12 16,60 ± 0,91 7,70 ± 0,80# 11,80 ± 0,74 Заявляемое соединение Т-001, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 10,00 ± 1,45* 4,50 ± 0,99* 7,40 ± 0,94* Заявляемое соединение Т-001,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 13,10 ± 1,74 9,90 ± 1,25 8,60 ± 1,84 Заявляемое соединение Т-002, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 10,50 ± 1,02* 4,60 ± 0,78* 7,60 ± 0,89* Заявляемое соединение Т-002,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 14,20 ± 1,46 10,00 ± 1,46 9,00 ± 1,95 Заявляемое соединение Т-003, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 11,00 ± 0,89* 4,20 ± 1,01* 7,10 ± 1,02* Заявляемое соединение Т-003,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 13,60 ± 1,88 9,60 ± 1,56 8,20 ± 1,55 Заявляемое соединение Т-004, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 9,60 ± 1,77* 4,80 ± 0,68* 7,50 ± 1,00* Заявляемое соединение Т-004,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 12,90 ± 2,01 10,20 ± 1,87 9,10 ± 1,34 Заявляемое соединение Т-005, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 10,80 ± 1,24* 4,10 ± 1,12* 7,80 ± 0,72* Заявляемое соединение Т-005,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 14,30 ± 2,11 9,50 ± 1,14 8,10 ± 2,22 Заявляемое соединение Т-006, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 11,10 ± 0,94* 4,30 ± 0,97* 7,70 ± 0,88* Заявляемое соединение Т-006,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 13,70 ± 1,87 10,40 ± 1,55 8,90 ± 1,95 Заявляемое соединение Т-007, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 9,90 ± 1,77* 4,00 ± 1,23* 8,00 ± 0,69* Заявляемое соединение Т-007,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 12,80 ± 2,56 9,30 ± 1,13 9,40 ± 2,11 Заявляемое соединение Т-008, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 10,40 ± 1,67* 4,90 ± 0,67* 7,20 ± 1,07* Заявляемое соединение Т-008,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 13,60 ± 1,52 9,10 ± 1,34 8,50 ± 1,66 Заявляемое соединение Т-009, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 10,70 ± 1,22* 4,40 ± 1,03* 7,70 ± 0,88* Заявляемое соединение Т-009,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 14,20 ± 2,23 10,90 ± 2,34 8,90 ± 2,13 Заявляемое соединение Т-010, 100 мг/кг внж ,мыши BALB/c n=12 10,50 ± 1,60* 4,70 ± 0,91* 7,20 ± 1,14* Заявляемое соединение Т-010,
150 мг/кг внж, мыши BALB/c n=10 13,70 ± 2,01 9,30 ± 1,67 9,30 ± 1,33

* - p<0,05 по сравнению с контрольной группой мышей BALB/c (межгрупповое сравнение);

# - p<0,05 по сравнению со временем нахождения в отсеке с социальным объектом (внутригрупповое сравнение).

На фоне введения исследуемых соединений в дозе 100 мг/кг число заходов мышей в отсек с социально значимым объектом было в 2,0-2,2 раза больше (как и в группе контроля), по сравнению с числом заходов в противоположный отсек, где располагался несоциальный объект. Наряду с этим, в группах животных, получавших изучаемые соединения в дозе 100 мг/кг, отмечены достоверные снижения числа заходов в оба отсека с объектами и числа подходов к цилиндру с «незнакомой» мышью по сравнению с контролем BALB/c (Табл. 5).

При введении заявляемых соединений в дозе 150 мг/кг отмечена тенденция уменьшения времени нахождения мышей в отсеке с социально значимым объектом и времени обнюхивания новой мыши (Табл. 4), а также числа заходов в отсек с «незнакомой» мышью и числа подходов к цилиндру с помещенной в нем «незнакомой» мышью на расстоянии менее 1-го сантиметра по сравнению с контрольной группой BALB/c (Табл. 5). Однако, при внутригрупповом сравнении выявляется рост числа заходов в отсек с новой мышью по сравнению с отсеком, не содержащим социальный объект в 1,30-1,35 раза.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у заявляемых соединений в дозе 100 мг/кг слабовыраженного позитивного эффекта, направленного на снижение нарушений социального взаимодействия у мышей BALB/c, что проявилось в увеличении (на уровне тенденции) времени нахождения животных в отсеке с социальным объектом и в увеличении (на уровне тенденции) числа заходов в этот отсек относительно отсека с несоциальным объектом.

При оценке влияния исследуемых соединений в дозе 150 мг/кг в данном тесте способности у препаратов восстанавливать нарушения социального взаимодействия у мышей линии BALB/c, характерные для аутистических состояний, не выявлено.

Можно предположить, что наблюдаемые под влиянием заявляемых соединений снижения активности может быть связано, возможно, с наличием у препаратов седативного действия, что проявилось в увеличении у животных, получавших соединения, времени нахождения в центральном отсеке и снижении общего числа переходов из отсека в отсек.

Пример 14. Изучено влияние заявляемых соединений на проявления аутизма в тесте предъявления нового социального объекта (social novelty preference).

Эксперимент проводили на мышах-самцах линии BALB/c возраста 5-7 недель массой 13-15 г. в начале эксперимента.

В качестве социально значимого объекта и дополнительного контроля использовались мыши-самцы линии C57Bl/6 возрастом 2-3 месяца массой 20-24 г. Условия содержания идентичны таковым для исследования в примере 12.

Заявляемые соединения вводили в дозах 100 мг/кг и 150 мг/кг внутрь (внутрижелудочно) в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Контрольным животным вводили внутрь (внутрижелудочно) суспензию с Твином-80 в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Процедуры приготовления суспензий и введения их животным подробно описаны в примере 12.

Исследование проводили согласно методике, предложенной Ryan и соавторами (2010). Использовали ту же экспериментальную установку, что и в исследовании, приведенном примере 12 с прозрачными стенками. Размеры установки: длина 50 см и ширина 25 см. Камера разделена прозрачными снимаемыми перегородками на три равных отсека, которые дверцами с опускаемыми перегородками сообщаются между собой.

После проведения теста социального взаимодействия, где тестируемой мыши предъявляли социальный и несоциальный объекты, мышь BALB/c блокировали в центральном отсеке (ставили двери). В цилиндр, где в предыдущем тесте находился несоциальный объект, помещали вторую новую незнакомую мышь линии C57Bl/6 (объект 2), а в цилиндре другого отсека находилась знакомая мышь линии C57Bl/6 (объект 1) (Ryan, Young, Crawley et.al., 2010).

Затем двери между перегородками убирали и в течение 6-ти минут регистрировали поведение животных.

Регистрируемые показатели:

1. Время, проведенное тестируемой мышью в отсеке с объектом 1 – ранее уже знакомой мышью C57Bl/6.

2. Время, проведенное тестируемой мышью в отсеке с объектом 2 – новой незнакомой мышью C57Bl/6.

3. Время, затраченное тестируемой мышью на обнюхивание объекта 2 - незнакомой мыши C57Bl/6 (подход тестируемой мыши на 1 см и ближе к новой мыши) при ее первом предъявлении.

4. Число заходов тестируемой мыши в отсек с объектом 1 – ранее уже знакомой мышью C57Bl/6.

5. Число заходов тестируемой мыши в отсек с объектом 2 – новой незнакомой мышью.

При выполнении исследований по этому тесту экспериментатор находится на расстоянии не менее 2 м от установки. Мыши C57Bl/6 (незнакомцы «1» и «2») были предварительно адаптированы к цилиндру (контейнеру), в котором они будут сидеть в ходе тестирования. Мыши (незнакомцы «1» и «2») были взяты из разных клеток. Цилиндры, стены и полы установки мыли после каждого тестирования.

В тесте социального узнавания при предъявлении нового социального объекта 2 (незнакомец, мышь C57Bl/6) вместо ранее используемого несоциального объекта в контрольной (мыши BALB/c) и опытных группах (введение изучаемых соединений в дозах 100 и 150 мг/кг) различий при внутригрупповых сравнениях во времени нахождения в отсеке с уже «знакомой» мышью (объект 1) по сравнению со временем нахождения в отсеке с новой «незнакомой» мышью (объект 2) выявлено не было (Табл. 6).

Можно отметить, что время обнюхивания новой «незнакомой» мыши в группах, получавших заявляемые соединения, недостоверно увеличивалось (Табл. 6). Так, на фоне заявляемых соединений в дозе 100 мг/кг время обнюхивания новой мыши было на 15,8 % больше, а на фоне соединений в дозе 150 мг/кг – на 28,9 % больше, чем при обнюхивании «знакомой» мыши, тогда как в контрольной группе этот показатель был равен 7,7 %.

Таблица 6 – Влияние заявляемых соединений на поведение мышей BALB/c в тесте предъявления нового социального объекта «Social novelty preference» (M ± m).

Группа, доза вещества, Количество животных Время нахождения в отсеке, с Время обнюхивания, с В центре Со «знакомой» мышью,
Объект 1 С «незнакомой» мышью,
Объект 2 «знакомой» мыши, Объект 1 «незнакомой» мыши, Объект 2 Контроль, BALB/c, n=12 70,40 ± 6,30 153,70 ±9,19 136,50 ± 9,08 23,1 ± 2,96 25,90 ± 2,81 Заявляемое соединение Т-001, 100 мг/кг внж, n=12 157,60 ± 16,23* 102,70 ± 16,32* 100,50 ± 16,17 21,1 ± 6,99 25,50 ± 4,14 Заявляемое соединение Т-001, 150 мг/кг внж, n=10 145,70 ± 19,21* 121,60 ± 10,43* 93,40 ± 11,23* 10,6 ± 3,68* 14,90 ± 2,12* Заявляемое соединение Т-002, 100 мг/кг внж, n=12 158,10 ± 17,03* 103,50 ± 16,21* 101,60 ± 15,23 22,4 ± 7,10 24,60 ± 3,12 Заявляемое соединение Т-002, 150 мг/кг внж, n=10 144,90 ± 18,11* 120,40 ± 11,13* 94,50 ± 10,22* 10,2 ± 3,79* 14,20 ± 3,00* Заявляемое соединение Т-003, 100 мг/кг внж, n=12 157,20 ± 15,45* 103,10 ± 15,12* 102,40 ± 17,10 23,0 ± 5,68 25,90 ± 4,56 Заявляемое соединение Т-003, 150 мг/кг внж, n=10 144,60 ± 18,02* 122,20 ± 9,23* 92,20 ± 12,16* 11,1 ± 2,76* 15,10 ± 1,91* Заявляемое соединение Т-004, 100 мг/кг внж, n=12 156,50 ± 14,34* 101,90 ± 17,54* 103,10 ± 17,88 22,0 ± 7,11 24,20 ± 4,78 Заявляемое соединение Т-004, 150 мг/кг внж, n=10 143,40 ± 16,81* 120,80 ± 11,74* 94,30 ± 10,01* 10,1 ± 4,02* 14,70 ± 2,56* Заявляемое соединение Т-005, 100 мг/кг внж, n=12 158,10 ± 17,17* 103,40 ± 15,55* 100,10 ± 15,18 24,4 ± 5,78 24,80 ± 4,70 Заявляемое соединение Т-005, 150 мг/кг внж, n=10 144,50 ± 18,31* 122,30 ± 10,03* 93,90 ± 11,04* 9,98 ± 4,59* 14,50 ± 2,13* Заявляемое соединение Т-006, 100 мг/кг внж, n=12 157,60 ± 16,23* 104,20 ± 14,30* 99,70 ± 18,46 20,8 ± 4,79 25,20 ± 3,21 Заявляемое соединение Т-006, 150 мг/кг внж, n=10 145,00 ± 18,11* 120,50 ± 11,44* 92,60 ± 10,56* 10,2 ± 3,45* 14,20 ± 2,44* Заявляемое соединение Т-007, 100 мг/кг внж, n=12 156,70 ± 14,33* 103,80 ± 15,12* 101,80 ± 14,97 22,5 ± 5,34 24,30 ± 4,89 Заявляемое соединение Т-007, 150 мг/кг внж, n=10 144,80 ± 17,22* 120,10 ± 11,22* 94,21 ± 9,43* 10,5 ± 2,99* 14,10 ± 2,88* Заявляемое соединение Т-008, 100 мг/кг внж, n=12 158,30 ± 17,23* 102,30 ± 16,10* 103,70 ± 17,27 21,9 ± 7,01 24,50 ± 5,16 Заявляемое соединение Т-008, 150 мг/кг внж, n=10 146,40 ± 18,47* 123,80 ± 10,45* 92,30 ± 10,93* 11,0 ± 3,11* 14,40 ± 2,05* Заявляемое соединение Т-009, 100 мг/кг внж, n=12 157,10 ± 15,23* 100,90 ± 17,42* 102,20 ± 15,47 23,1 ± 5,03 25,60 ± 3,97 Заявляемое соединение Т-009, 150 мг/кг внж, n=10 147,60 ± 17,84* 124,20 ± 9,05* 93,70 ± 11,00* 10,8 ± 3,23* 14,70 ± 1,99* Заявляемое соединение Т-010, 100 мг/кг внж, n=12 156,90 ± 17,13* 103,50 ± 15,13* 101,80 ± 16,29 21,8 ± 5,39 24,90 ± 4,77 Заявляемое соединение Т-010, 150 мг/кг внж, n=10 144,90 ± 18,01* 122,70 ± 10,24* 92,50 ± 10,22* 10,3 ± 4,21* 14,50 ± 2,99*

* - p<0,05 по сравнению с контрольной группой мышей BALB/c (межгрупповое сравнение).

При этом животные, получавшие заявляемые соединения, проводили достоверно больше времени в центральном отсеке, и статистически значимо меньше времени в отсеках с объектами по сравнению с контролем (Табл. 6).

По числу заходов в отсеки со «знакомой» и «незнакомой» мышами различий между контрольной и опытными группами не выявлено. При подсчете числа подходов к социальным объектам 1 и 2 на близкое расстояние, позволяющее обнюхать мышь, сидящую в цилиндре, также статистически значимых различий не выявлено. Но, при этом, если в группе контроля рост числа подходов к Объекту 2 по сравнению с числом подходов к Объекту 1 составил 5,9 %, то в группах соединений -100 мг/кг – 12,5 %, а в группах соединений -150 мг/кг – 21,6 % (Табл. 7).

Таблица 7 – Влияние заявляемых соединений на поведение мышей BALB/c в тесте предъявления нового социального объекта «Social novelty preference» (M ± m)

Группа, доза вещества,
количество животных Число заходов в отсек со «знакомой» мышью, ед.
Объект 1 Число заходов в отсек с «незнакомой» мышью, ед.
Объект 2 Число подходов к «знакомой» мыши, ед.
Объект 1 Число подходов к «незнакомой» мыши, ед.
Объект 2 Контроль, BALB/c, n=16 11,00 ± 0,87 12,00 ± 1,07 6,40 ± 0,78 6,80 ± 0,65 Заявляемое соединение Т-001, 100 мг/кг внж, n=12 6,90 ± 1,50* 7,90 ± 1,14* 4,20± 1,06 4,80 ± 0,59 Заявляемое соединение Т-001, 150 мг/кг внж, n=10 8,60 ±1,48 8,70 ± 1,02* 4,00 ± 0,87 5,10 ± 0,77 Заявляемое соединение Т-002, 100 мг/кг внж, n=12 6,80 ± 1,34* 8,00 ± 1,01* 4,30± 1,01 4,90 ± 0,48 Заявляемое соединение Т-002, 150 мг/кг внж, n=10 8,90 ±1,67 8,80 ± 0,91* 4,10 ± 0,92 5,20 ± 0,88 Заявляемое соединение Т-003, 100 мг/кг внж, n=12 6,40 ± 1,23* 7,70 ± 1,21* 4,00± 1,12 5,00 ± 0,77 Заявляемое соединение Т-003, 150 мг/кг внж, n=10 9,00 ±1,35 8,60 ± 1,00* 4,20 ± 1,00 5,30 ± 0,89 Заявляемое соединение Т-004, 100 мг/кг внж, n=12 6,50 ± 1,41* 7,80 ± 1,18* 4,40± 1,02 4,70 ± 0,98 Заявляемое соединение Т-004, 150 мг/кг внж, n=10 8,20 ±1,89 8,40 ± 1,12* 4,20 ± 0,76 5,40 ± 0,86 Заявляемое соединение Т-005, 100 мг/кг внж, n=12 6,10 ± 1,70* 7,30 ± 1,23* 4,10± 1,21 4,60 ± 0,75 Заявляемое соединение Т-005, 150 мг/кг внж, n=10 8,80 ±1,66 8,50 ± 1,11* 4,00 ± 1,10 5,10 ± 0,77 Заявляемое соединение Т-006, 100 мг/кг внж, n=12 6,50 ± 1,44* 7,40 ± 1,24* 4,30± 1,32 4,50 ± 0,99 Заявляемое соединение Т-006, 150 мг/кг внж, n=10 8,90 ±1,88 8,20 ± 1,15* 4,20 ± 1,08 5,40 ± 0,72 Заявляемое соединение Т-007, 100 мг/кг внж, n=12 6,30 ± 1,77* 7,90 ± 1,03* 4,00± 1,04 4,40 ± 0,89 Заявляемое соединение Т-007, 150 мг/кг внж, n=10 8,00 ±1,87 8,40 ± 1,10* 4,10 ± 0,92 5,60 ± 0,65 Заявляемое соединение Т-008, 100 мг/кг внж, n=12 6,40 ± 1,79* 7,60 ± 1,09* 4,50± 1,44 4,90 ± 0,67 Заявляемое соединение Т-008, 150 мг/кг внж, n=10 8,80 ±1,88 8,20 ± 1,08* 4,40 ± 0,77 5,00 ± 0,68 Заявляемое соединение Т-009, 100 мг/кг внж, n=12 6,70 ± 1,65* 7,30 ± 1,20* 4,10± 1,13 4,70 ± 0,64 Заявляемое соединение Т-009, 150 мг/кг внж, n=10 8,90 ±1,12 9,10 ± 0,87* 4,20 ± 0,96 5,30 ± 0,87 Заявляемое соединение Т-010, 100 мг/кг внж, n=12 6,50 ± 1,63* 7,10 ± 1,25* 4,10± 1,22 4,90 ± 0,47 Заявляемое соединение Т-010, 150 мг/кг внж, n=10 8,40 ±1,80 8,40 ± 1,11* 4,20 ± 1,21 5,50 ± 0,55

* - p<0,05 по сравнению с контрольной группой мышей BALB/c (межгрупповое сравнение).

В тесте социального предпочтения и узнавания, также как и ранее, в тесте социального взаимодействия, выявлено достоверное снижение числа заходов в отсеки на фоне введения соединений в обеих дозах по сравнению с контролем (Табл. 7).

Полученные данные свидетельствуют о наличии слабой способности у заявляемых соединений в дозах 100 и 150 мг/кг улучшать социальное узнавание и социальную память, что проявилось в увеличении числа подходов на близкое расстояние к новому социальному объекту, по сравнению с подходами к знакомому социальному объекту, на 12,5 % и – 21,6 %, что было в 2,1 и 3,7 раз больше, соответственно, чем в контроле. Также, данное обстоятельство, подтверждается и увеличением самого времени обнюхивания новой мыши (Объект 2) относительно соответствующего показателя для ранее знакомой мыши (Объект 1) на 15,8 % в группах соединений -100 мг/кг и 28,9 % в группах соединений -150 мг/кг, что было в 2 и 4 раза больше, соответственно, чем в контрольной группе мышей.

Таким образом, по данным, полученным в ходе выполнения теста социального взаимодействия, у заявляемых соединений в дозе 100 мг/кг выявлена слабо выраженная способность улучшать социальную общительность, а в тесте предъявления нового социального объекта «Social novelty preference» - для обеих изученных доз соединений показана возможность улучшать социальное узнавание (распознавание).

Пример 15. Изучено влияние заявляемых соединений на показатели ограниченности поведения в тесте обследования отверстий (Hole-board exploration) у мышей линии BALB/c.

Эксперимент проводили на мышах-самцах линии BALB/c возраста 5-7 недель массой 13-15 г. в начале эксперимента. В качестве социально значимого объекта и дополнительного контроля использовались мыши-самцы линии C57Bl/6 возрастом 2-3 месяца массой 20-24 г. Условия содержания идентичны таковым для исследования в примере 12.

Заявляемые соединения вводили в дозах 100 мг/кг и 150 мг/кг внутрь (внутрижелудочно) в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Контрольным животным вводили внутрь (внутрижелудочно) суспензию с Твином-80 в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Процедуры приготовления суспензий и введения их животным подробно описаны в примере 12.

Исследование проводили согласно методике Moy SS., Nadler JJ., Poe MD. et.al. (2008).

Тестирование животных проводили в инфракрасном актометре фирмы Panlab, Испания (модель LE 8825 IR Motor Activity Monitor V 08/05/120). Установка представляет собой квадрат. Пол установки разделен на 16 квадратов с 16 одинаковыми отверстиями. Все отверстия пронумерованы и разделены на угловые, пристенные отверстия и отверстия в центре установки (Фиг. 1).

В течение 10 минут регистрировали:

- общее число перемещений мыши в установке (в условных единицах, у.е.);

- общее число заглядываний (Nose poke, ед.) в отверстия,

- число заглядываний в угловые отверстия,

- число заглядываний в пристенные отверстия,

- число заглядываний в центральные отверстия

- время пребывания животного в угловой зоне установки (сек.).

- время пребывания животного в пристенной зоне установки (сек.)

- время пребывания животного в центральной зоне установки (сек.)

У контрольных мышей линии BALB/c в условиях теста обследования отверстий (Hole-board exploration) выявлена тенденция к снижению исследовательской активности на 17,4 %, проявляющаяся в уменьшении общего количества заглядываний в отверстия установки, по сравнению с группой аутбредных мышей (Табл. 8).

При анализе продолжительности нахождения мышей линии BALB/c в трех зонах установки (угловой, центральной и пристенной) было зафиксировано статистически достоверное снижение на 41,4 % времени пребывания животных в центральной зоне установки по сравнению с группой аутбредных мышей (Табл. 8).

Таблица 8 – Поведение мышей линии BALB/c в сравнении с аутбредными белыми мышами в условиях теста обследования отверстий (Hole-board exploration) (M ± m).

Регистрируемые параметры
Аутбредные мыши, n=10 Мыши BALB/c, n=15 Локомоторная активность, у.е. 1482,5 ± 80,2 1483,5 ± 107,9 Общее число заглядываний в отверстия, ед. 79,8 ± 6,5 65,9 ± 3,7 Время нахождения в зонах, сек: угловая 276,7 ± 10,5
278,1 ± 12,5 пристенная 266,1 ± 11,1
288,4 ± 12,1 центральная 57,2 ± 8,5
33,5 ± 6,7# Количество заглядываний в отверстия, ед. угловые 35,3 ± 3,0
31,3 ± 2,1 пристенные 36,7 ± 3,3
32,1 ± 2,1 центральные 7,8 ± 1,6
2,5 ± 0,7#

# - p<0,05 достоверность различий относительно группы аутбредных мышей.

Оценка количества заглядываний мышей линии BALB/c в отверстия, расположенные в трех различных зонах экспериментальной установки (угловая, пристеночная, центральная), выявила статистически достоверное снижение в 3,1 раза числа заглядываний в центральные отверстия и недостоверное уменьшение количества заглядываний в угловые и пристенные отверстия по сравнению с аутбредными животными (Табл. 8).

Влияние заявляемых соединений на поведение мышей линии BALB/c в тесте обследования отверстий (Hole-board exploration).

Установлено, что на фоне исследуемых соединений в дозах 100 и 150 мг/кг общее число заглядываний в отверстия установки не отличалось от значений контрольной группы мышей линии BALB/c. При этом следует отметить, что введения соединений в дозе 100 мг/кг обеспечивало статистически достоверное увеличение двигательной активности мышей линии BALB/c на 34,6 % (Табл. 9).

Таблица 9 – Влияние заявляемых соединений на локомоторную и исследовательскую активность мышей линии BALB/c (M ± m, n=15).

Группы животных Локомоторная активность, у.е. Общее число заглядываний в отверстия, ед. Контроль 1483,5 ± 107,9 65,9 ± 3,7 Заявляемое соединение Т-001, 100 мг/кг 1997,0 ± 60,5* 58,9 ± 4,2 Заявляемое соединение Т-001,150 мг/кг 1632,5 ± 94,5 57,9 ± 5,3 Заявляемое соединение Т-002, 100 мг/кг 1995,2 ± 57,6* 59,5 ± 4,4 Заявляемое соединение Т-002,150 мг/кг 1645,2 ± 95,7 58,1 ± 5,0 Заявляемое соединение Т-003, 100 мг/кг 1999,3 ± 59,4* 58,4 ± 4,8 Заявляемое соединение Т-003,150 мг/кг 1656,7 ± 99,1 57,5 ± 4,3 Заявляемое соединение Т-004, 100 мг/кг 1986,1 ± 50,7* 58,0 ± 3,9 Заявляемое соединение Т-004,150 мг/кг 1649,4 ± 97,9 58,3 ± 5,7 Заявляемое соединение Т-005, 100 мг/кг 1989,6 ± 62,6* 58,6 ± 4,0 Заявляемое соединение Т-005,150 мг/кг 1640,9 ± 96,1 57,5 ± 4,6 Заявляемое соединение Т-006, 100 мг/кг 1991,9 ± 57,3* 58,7 ± 3,8 Заявляемое соединение Т-006,150 мг/кг 1639,9 ± 97,5 58,8 ± 4,3 Заявляемое соединение Т-007, 100 мг/кг 1994,4 ± 61,6* 59,3 ± 4,4 Заявляемое соединение Т-007,150 мг/кг 1640,1 ± 90,2 57,6± 5,1 Заявляемое соединение Т-008, 100 мг/кг 1982,9 ± 58,7* 58,6 ± 4,0 Заявляемое соединение Т-008,150 мг/кг 1629,3 ± 93,0 57,5 ± 4,5 Заявляемое соединение Т-009, 100 мг/кг 1988,5 ± 55,4* 59,2 ± 3,7 Заявляемое соединение Т-009,150 мг/кг 1641,6 ± 92,3 57,4 ± 4,2 Заявляемое соединение Т-010, 100 мг/кг 1976,7 ± 52,4* 58,7 ± 3,7 Заявляемое соединение Т-010,150 мг/кг 1647,0 ± 99,9 57,8 ± 4,6

* - p<0,05 относительно группы «BALB/c»

Заявляемые соединения в дозе 100 мг/кг вызывали увеличение времени нахождения животных в центральной зоне на 57,3 % (p<0,05) по сравнению с показателями группы мышей линии BALB/c (Табл. 9). Заявляемые соединения в дозе 150 мг/кг не оказывали влияния на время нахождения животных в центральной зоне (Табл. 10).

Таблица 10 – Влияние заявляемых соединений на время нахождения мышей линии BALB/c в угловой, пристенной и центральной зонах установки (M ± m, n=15).

Группы животных Время нахождения в зонах, с Угловая зона Пристенная зона Центральная зона Контроль 278,1 ± 12,5 288,4 ± 12,1 33,5 ± 6,7 Заявляемое соединение Т-001,100 мг/кг 263,6 ± 12,8 283,7 ± 9,8 52,7 ± 0,6* Заявляемое соединение Т-001,150 мг/кг 286,1 ± 11,1 275,3 ± 10,6 38,6 ± 6,3 Заявляемое соединение Т-002,100 мг/кг 262,3 ± 11,9 285,3 ± 10,5 53,3 ± 0,5* Заявляемое соединение Т-002,150 мг/кг 284,0 ± 12,2 277,4 ± 11,4 39,4 ± 5,3 Заявляемое соединение Т-003,100 мг/кг 259,4 ± 11,7 286,5 ± 10,7 52,2 ± 0,4* Заявляемое соединение Т-003,150 мг/кг 281,9 ± 10,8 279,6 ± 9,8 38,1 ± 5,0 Заявляемое соединение Т-004,100 мг/кг 259,4 ± 10,5 289,7 ± 10,9 52,0 ± 0,7* Заявляемое соединение Т-004,150 мг/кг 284,6 ± 11,8 278,8 ± 9,7 37,9 ± 4,9 Заявляемое соединение Т-005,100 мг/кг 261,2 ± 11,2 279,9 ± 10,2 51,5 ± 0,5* Заявляемое соединение Т-005,150 мг/кг 288,0 ± 10,3 271,7 ± 11,4 37,8 ± 5,0 Заявляемое соединение Т-006,100 мг/кг 266,4 ± 10,1 280,2 ± 9,9 52,9 ± 0,6* Заявляемое соединение Т-006,150 мг/кг 289,9 ± 9,9 279,0 ± 11,1 38,3 ± 3,3 Заявляемое соединение Т-007,100 мг/кг 260,7 ± 11,7 288,8 ± 10,6 52,0 ± 0,8* Заявляемое соединение Т-007,150 мг/кг 281,0 ± 11,8 277,5 ± 10,2 38,1 ± 5,3 Заявляемое соединение Т-008,100 мг/кг 267,2 ± 13,3 281,4 ± 10,7 52,5 ± 0,5* Заявляемое соединение Т-008,150 мг/кг 283,7 ± 10,0 278,8 ± 11,3 38,3 ± 4,8 Заявляемое соединение Т-009,100 мг/кг 265,4 ± 11,7 278,6 ± 11,2 52,8 ± 0,7* Заявляемое соединение Т-009,150 мг/кг 279,8 ± 12,9 273,4 ± 11,4 38,7 ± 5,1 Заявляемое соединение Т-010,100 мг/кг 268,5 ± 14,2 287,7 ± 9,9 52,9 ± 0,5* Заявляемое соединение Т-010,150 мг/кг 289,7 ± 12,8 276,8 ± 11,8 38,8 ± 5,2

* - p<0,05 относительно группы «BALB/c».

Введение заявляемых соединений в дозе 100 мг/кг в виде тенденции увеличивали на 64,0 % количество заглядываний мышей в центральные отверстия относительно группы мышей линии BALB/c, получавших только растворитель (Табл. 11). Заявляемые соединения в дозе 150 мг/кг не оказывали влияния на показатель числа заглядываний мышей в центральные отверстия в сравнении с показателями группы мышей линии BALB/c (Табл. 11).

Таблица 11 – Влияние заявляемых соединений на количество заглядываний мышей линии BALB/c отверстия установки (M ± m, n=15).

Группы животных Количество заглядываний в отверстия, ед. Угловые Пристенные В центре Контроль 31,3 ± 2,1 32,1 ± 2,1 2,5 ± 0,7 Заявляемое соединение Т-001, 100 мг/кг 27,7 ± 2,1 27,2 ± 2,0 4,1 ± 0,6 Заявляемое соединение Т-001, 150 мг/кг 28,9 ± 2,4 26,1 ± 2,8 2,9 ± 0,6 Заявляемое соединение Т-002, 100 мг/кг 27,9 ± 2,0 27,4 ± 2,1 4,0 ± 0,7 Заявляемое соединение Т-002, 150 мг/кг 29,1 ± 2,2 26,3 ± 2,7 3,0 ± 0,5 Заявляемое соединение Т-003, 100 мг/кг 27,5 ± 2,2 27,7 ± 2,4 4,2 ± 0,5 Заявляемое соединение Т-003, 150 мг/кг 28,7 ± 2,0 26,5 ± 2,3 2,6 ± 0,7 Заявляемое соединение Т-004, 100 мг/кг 27,2 ± 1,9 27,8 ± 2,2 4,4 ± 0,8 Заявляемое соединение Т-004, 150 мг/кг 28,4 ± 2,3 26,8 ± 2,4 2,7 ± 0,7 Заявляемое соединение Т-005, 100 мг/кг 27,8 ± 2,0 27,9 ± 1,9 3,9 ± 0,8 Заявляемое соединение Т-005, 150 мг/кг 29,0 ± 2,1 26,7 ± 2,6 2,5 ± 0,7 Заявляемое соединение Т-006, 100 мг/кг 27,1 ± 2,5 26,8 ± 2,5 4,3 ± 0,8 Заявляемое соединение Т-006, 150 мг/кг 28,3 ± 2,2 25,9 ± 2,6 2,5 ± 0,7 Заявляемое соединение Т-007, 100 мг/кг 27,0 ± 2,0 27,7 ± 2,1 4,0 ± 0,5 Заявляемое соединение Т-007, 150 мг/кг 28,5 ± 2,1 26,6 ± 2,5 3,1 ± 0,4 Заявляемое соединение Т-008, 100 мг/кг 27,2 ± 1,8 27,8 ± 2,6 4,4 ± 0,7 Заявляемое соединение Т-008, 150 мг/кг 28,4 ± 2,2 25,7 ± 2,9 2,6 ± 0,5 Заявляемое соединение Т-009, 100 мг/кг 27,9 ± 1,9 27,0 ± 2,1 3,7 ± 0,9 Заявляемое соединение Т-009, 150 мг/кг 28,8 ± 2,2 26,6 ± 2,7 2,4 ± 0,4 Заявляемое соединение Т-010, 100 мг/кг 27,4 ± 2,3 27,9 ± 2,5 4,0 ± 0,5 Заявляемое соединение Т-010, 150 мг/кг 28,6 ± 2,5 26,2 ± 2,4 2,8 ± 0,4

Для более наглядной, подробной характеристики распределения заглядываний мышей в отверстия арены (пола установки) на фиг. 2 и 3 по четырем анализируемым группам (количество заглядываний контрольных мышей и животных, которым вводили заявляемое соединение Т-001 в двух испытуемых дозах), отдельно представлены диаграммы распределения заглядываний в отверстия по 16 зонам, соответствующим 16 отверстиям установки.

Как видно из Фиг. 2, аутбредные животные в 12,4-12,5 % случаев предпочитали «1» и «4» угловые отверстия, чуть реже выбирая «3» и «2» отверстия (10,7 % и 8,6 % соответственно). Мыши линии BALB/c в 13,8 % случаев предпочитали «1» и «2» отверстия; заглядывания в «3» и «4» отверстия составляли соответственно 9,3 % и 10,6 %.

Распределение заглядываний в отдельные пристенные отверстия для группы аутбредных животных составляло от 4,3 % до 7,0 %; для мышей линии BALB/c оно было менее равномерно – от 3,7 % до 8,5 % от всех заглядываний (Фиг. 2).

Суммарно число заглядываний в пристенные отверстия для аутбредных животных равны 46 %, для мышей линии BALB/c – 48,7 %.

Статистически достоверная разница между аутбредными и линейными животными была выявлена в отношении заглядывания в центральные отверстия («13», «14» и «16», Фиг. 2). Так, число заглядываний в «13», «14», «15» и «16» отверстия относительно общего количества заглядываний для аутбредных животных составляло соответственно: 3,5 %, 1,4 %, 2,0 % и 2,9 %. Для мышей линии BALB/c эти показатели соответствовали следующим значениям: 1,0 %, 0,5 %, 1,1 % и 1,2 %, т. е. были в 3,5, 2,8, 1,8 и 2,4 раза меньше, чем у аутбредных мышей. Пониженное количество заглядываний в отдельные центральные отверстия мышей линии BALB/c определило снижение общего количества заглядываний в отверстия центра, которое составляло 3,8 % против 9,8 % от общего количества заглядываний во все отверстия для белых аутбредных мышей.

Полученные данные свидетельствуют о нарушении у мышей линии BALB/c исследовательского поведения и о наличии у них повышенного уровня тревожности.

Заявляемое соединение Т-001 в дозе 100 мг/кг не вызывает достоверного изменения показателя числа заглядываний в отдельные отверстия установки в сравнении с показателями контрольной группы мышей линии BALB/c (Фиг. 3).

Вместе с тем, под влиянием заявляемого соединения Т-001 в дозе 100 мг/кг распределение заглядываний в угловые отверстия установки 1-4 было более равномерным и составляло 10,6 % - 12,3 %. Кроме того, по сравнению с группой мышей линии BALB/c была обнаружена тенденция к повышению количества заглядываний животных, получавших исследуемое соединение Т-001в дозе 100 мг/кг, в центральные «13», «14» и «15» отверстия. Число заглядываний в них соответственно составляло 1,9 %, 2,5 % и 1,5 % от общего количества случаев, превышая в 1,9, 5,0 и 0,7 раза соответствующие значения группы линейных контрольных животных.

У мышей, получавших заявляемое соединение Т-001 в дозе 100 мг/кг, отмечено повышение общего количества заглядываний во все центральные отверстия, составившее 6,9 % против 3,8 % в контрольной группе. За счет увеличения количества заглядываний в центральные отверстия общее количество заглядываний в пристенные отверстия было немного ниже, чем для контрольных мышей линии BALB/c, и составило 46,2 % всех случаев. Распределение отдельных заглядываний в пристенные отверстия составило от 3,5 % до 8,7 % от всех заглядываний.

Мыши линии BALB/c, получавшие заявляемое соединение Т-001 в дозе 150 мг/кг, в 17,1 % случаев предпочитали «1» угловое отверстие, в 12,3 % и 12,6 % – «2» и «4» отверстия (фиг. 3). На «3» угловое отверстие приходилось 7,9 % от всех заглядываний, что было недостоверно ниже, чем в группе контрольных мышей линии BALB/c. В сравнении с группой мышей линии BALB/c также не было достоверных отличий в отношении заглядываний в центральные отверстия. Так, распределение числа заглядываний животных, получавших заявляемое соединение Т-001 в дозе 150 мг/кг, в отверстия «13»-«16» соответствовало 1,0 % - 1,6 % от всех случаев; общее количество заглядываний в центральные отверстия составило 5,0 %. Вероятно, за счет повышенного предпочтения мышами, получавшими заявляемое соединение Т-001 в дозе 150 мг/кг, «1» отверстия достоверно снизилось количество заглядываний в «5» и «6» отверстия, что соответствовало 6,3 % и 4,1 % случаев для группы «заявляемое соединение Т-001, 150 мг/кг» против 8,5 % и 7,2 % случаев для контрольной группы мышей BALB/c. Распределение заглядываний в остальные пристенные отверстия было неравномерно и варьировало в диапазоне от 2,9 % до 9,4 % от общего количества заглядываний в отверстия.

Таким образом, анализ поведения животных в тесте «Hole-board exploration» показал, что поведение мышей линии BALB/c отличается от поведения аутбредных белых мышей и носит более ограниченный характер.

В сравнении с аутбредными животными для мышей линии BALB/c характерно:

• тревожное поведение, выражающееся в уменьшении количества заглядываний мышей в центральные отверстия установки и времени их нахождения в центральном отсеке установки;

• пониженная исследовательская активность.

Эти особенности поведения мышей линии BALB/c рассматриваются как несоциальные аномалии поведения (ограниченного), проявляющиеся при аутизме (Moy et al., 2008).

Таким образом, в тесте обследования отверстий, заявляемые соединения в дозе 100 мг/кг обнаружили способность восстанавливать несоциальные аномалии поведения, ослаблять ограниченное поведение мышей линии BALB/c, что выражалось в статистически достоверном увеличении времени нахождения мышей линии BALB/c в центральном отсеке и в повышении (на уровне тенденции) числа заглядываний в центральные отверстия.

В дозе 150 мг/кг, заявляемые соединения не оказывали влияния на аномалии поведения и ограниченное поведение мышей линии BALB/c.

Пример 16. Изучено влияние заявляемых соединений на способность животных отвечать на социальные и несоциальные обонятельные стимулы в тесте обонятельной габитуации/дисгабитуации (Olfactory habituation/dishabituation)

При аутизме нарушается способность адекватного реагирования на социальные и несоциальные обонятельные стимулы.

Экспериментальные модели этих нарушений учитывают хорошо установленный факт, что взаимоотношения у мышей в первую очередь происходят через обонятельные сигналы. Поэтому обонятельное привыкание/непривыкание в эксперименте изучается с помощью повторных предъявлений мышам несоциальных и социальных запахов в тесте обонятельной габитуации/дисгабитуации (Olfactory habituation/ dishabituation) (Chadman KK, Gong S, Scattoni MLS et al. 2008; Yang and Crawley 2009; Ryan, Young, Crawley et.al., 2010).

Эксперимент проводили на мышах-самцах линии BALB/c 5-7 недельного возраста, массой 13-15 г. В качестве социального стимула использовали мышей линии С57Вl/6 того же пола, что и тестируемые мыши. В качестве дополнительного контроля использовали аутбредных белых мышей-самцов возрастом 2-3 месяца, массой 24-30 г. Условия содержания идентичны таковым для исследования в примере 12.

Заявляемые соединения вводили в дозах 100 мг/кг и 150 мг/кг внутрь (внутрижелудочно) в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Контрольным животным вводили внутрь (внутрижелудочно) суспензию с Твином-80 в объеме 0,1 мл на 10 г массы мыши за 40 минут до эксперимента. Процедуры приготовления суспензий и введения их животным подробно описаны в примере 12.

Тест обонятельной габитуации/дисгабитуации (Olfactory habituation/dishabituation) используется для выявления способности животных отвечать на социальные и несоциальные обонятельные стимулы. Исследование проводили согласно методике, предложенной Ryan и соавторами (2010).

Мыши перед началом тестирования, по отдельности, помещают в клетку с чистыми опилками на 30 мин. Ватный тампон длиной 15 см смачивают в воде, пропускают через крышку клетки так, чтобы он располагался на высоте 5 см от выстилающих дно клетки опилок. Выполняют по 3 предъявления каждого запаха:

3 предъявления – вода;

3 предъявления – несоциальный стимул: разбавленный цветочный запах (экстракт апельсина, разбавленный в соотношении 1:100 (вода));

3 предъявления – социальный стимул (запах из мышиной «незнакомой» клетки с грязными опилками).

Для социального стимула используют ватный тампон, который предварительно смочили водой и протерли им дно грязной «чужой» мышиной клетки зигзагообразными движениями так, чтобы захватить все углы и середину клетки. В «чужой» клетке должно сидеть не менее 3-х мышей линии С57Вl/6 того же пола, что и тестируемые мыши. Опилки не должны меняться не менее 3 дней.

Наблюдение проводят в течение 2 минут.

Регистрируют следующие показатели:

- число поднятий и поворотов головы (носа) в сторону тампона с запахом, находящегося на расстоянии не более 2 см.

- число подходов к тампону,

- число обнюхивания тампона,

- число залезаний на тампон,

- число жеваний тампона,

- число вставаний на задние лапы,

- число зарываний в подстилку,

- число залезания на тампон,

- число жевания тампона.

Через 2 мин ватный тампон меняют на такой же, который предъявляют также 2 мин.

Поведение аутбредных мышей и мышей линии BALB/c при предъявлении обонятельных стимулов по показателю реакций на обонятельные стимулы

Характерной чертой поведения интактных аутбредных мышей в течение всего эксперимента было четкое распознавание нового запаха, что выражалось в повышенной реакции мышей на тампон с нанесенным на него запахом при первом предъявлении каждого обонятельного стимула и быстрое привыкание к запаху при его повторном предъявлении.

При первом тестировании запаха «Апельсин» у аутбредных мышей отмечено увеличение на 66 % реакции мышей на обонятельный стимул по сравнению с предшествующим этому предъявлению нейтральным запахом «Вода» (3-е предъявление), ставшим уже привычным. А в случае первого предъявления обонятельного социального стимула «Запах мышей C57Bl/6» относительно третьего предъявления запаха «Апельсин», ставшего на тот момент привычным, увеличение реакции мышей на тампон с запахом составило 84,7 % (Табл. 12).

Динамика реагирования мышей на запах при его повторных предъявлениях представлена в табл. 12. Как следует из таблицы, аутбредные мыши при втором предъявлении запаха «Вода» относительно первого тестирования этого запаха реагировали на обонятельный стимул на 69 % меньше. Похожая картина наблюдалась при тестировании запахов «Апельсин» и «Запах мышей линии C57Bl/6», где реакция животных снижалась на 62 % и 70 %, соответственно.

У мышей линии BALB/c при повторном предъявлении одинаковых запахов выраженность адаптации к обонятельным стимулам была ниже, чем в группе аутбредных мышей. Так, при повторном предъявлении запахов «Вода», «Апельсин» и «Запах мышей C57Bl/6» снижение реакции мышей линии BALB/c на стимул относительно первого предъявления подобного запаха составило 20 %, 9 % и 36 %, что было в 3,5, 7,2 и 2,0 раза меньше, соответственно, чем в группе аутбредных мышей (Табл. 12).

Способность распознавать запахи у мышей линии BALB/c не отличалась от аналогичных способностей аутбредных мышей, о чем свидетельствует отсутствие различий между реакциями на новый запах в обеих контрольных группах (Табл. 12).

Таблица 12 – Реакция на обонятельные стимулы мышей линии BALB/c по сравнению с аутбредными белыми мышами.

Обонятельные стимулы
№
предъявления
запаха Реакция на обонятельный стимул, ед. Контроль,
аутбредные мыши, n=7 Контроль,
мыши BALB/c, n=16 Вода 1 12,90± 1,50 10,00 ± 0,91 2 4,00 ± 0,79* 8,00 ± 1,06 3 1,70 ± 0,48# 6,40 ± 0,71 Апельсин 1 5,30 ± 1,29 3,50 ± 0,96 2 2,00 ± 0,38* 3,20 ± 0,81 3 2,00 ± 0,66 2,10 ± 0,81 Запах мышей линии C57Bl/6 1 13,10 ± 2,67 10,80 ± 1,36 2 3,90 ± 1,17* 6,90 ± 0,79 3 4,00 ± 1,51 7,80 ± 1,34

* - p<0,05 достоверность различий относительно значений при 1-м измерении того же стимула;

# - p<0,05 достоверность различий относительно значений при 2-м измерении того же стимула.

Примечание - «Реакция на обонятельный стимул» включает повороты головы мыши к тампону с запахом, находящимся на расстояние 2 см и меньше, обнюхивание, залезание на тампон, его жевание, подходы к нему.

Влияние заявляемых соединений на поведение мышей линии BALB/c при предъявлении обонятельных стимулов по показателю реакций на обонятельные стимулы

Заявляемые соединения в дозах 100 и 150 мг/кг вызывали более быстрое привыкание мышей линии BALB/c к запаху при его повторных предъявлениях и не ухудшали распознавание новых запахов (Табл. 13).

В группе мышей, получавших заявляемые соединения в дозе 100 мг/кг, отмечено снижение реакции на запах при его повторном предъявлении, которое составило 16,7 % - для нейтрального обонятельного стимула «Вода»; 42,9 % - для стимула «Апельсин» (p<0,05) и 58,2 % – для социального обонятельного стимула (p<0,05).

У мышей, получавших заявляемые соединения в дозе 150 мг/кг, снижение реакции на повторное предъявление того же обонятельного стимула составила 49 % - при повторном предъявлении нейтрального запаха (p<0,05), 30 % - при предъявлении запаха «Апельсин» и 55,4 % - при втором предъявлении стимула «Запах мышей линии C57Bl/6» (p<0,05), что было в 2,5, 3,3 и 1,53 раза больше, соответственно, чем в группе контрольных животных (Табл. 13).

Таблица 13 – Влияние заявляемых соединений на поведение мышей линии BALB/c при предъявлении обонятельных стимулов

Обонятельные стимулы
№
предъявления
запаха Реакция на обонятельный стимул, ед. Контроль,
мыши BALB/c,
n=16 Заявляемое соединение Т-001, 100 мг/кг внж, n=13 Заявляемое соединение Т-001, 150 мг/кг внж, n=15 Вода 1 10,00 ± 0,91 4,20 ± 0,75 4,70 ± 0,96 2 8,00 ± 1,06 3,50 ± 0,80 2,40 ± 0,34* 3 6,40 ± 0,71 2,40 ± 0,78 3,50 ± 0,68 Апельсин 1 3,50 ± 0,96 5,60 ± 0,51 4,30 ± 0,54 2 3,20 ± 0,81 3,20 ± 0,51* 3,00 ± 0,80 3 2,10 ± 0,81 2,20 ± 0,78 1,90 ± 0,65# Запах мышей линии C57Bl/6 1 10,80 ± 1,36 9,80 ± 1,02 8,30 ± 1,66 2 6,90 ± 0,79 4,10 ± 0,80* 3,70 ± 0,59* 3 7,80 ± 1,34 3,70 ±0,85 1,90 ± 0,41#

* - p<0,05 достоверность различий относительно значений при 1-м измерении того же стимула; # - p<0,05 достоверность различий относительно значений при 2-м измерении того же стимула.

Примечание - «Реакция на обонятельный стимул» включает повороты головы мыши к тампону с запахом, находящимся на расстояние 2 см и меньше, обнюхивание, залезание на тампон, его жевание, подходы к нему.